METTL3/AMPK通路在七氟烷誘發小鼠認知功能損傷中的作用

鐘照明 曹磊 姚立群 黃永珍

海南省中醫院麻醉科（?？?570203）

七氟烷（sevoflurane，SEV）是兒童最常用的麻醉劑之一，可能導致神經元凋亡、突觸缺陷、神經炎癥、Tau 磷酸化、髓鞘形成的破壞以及認知障礙［1-2］。盡管許多研究發現SEV 麻醉會導致大腦各個區域的基因表達發生巨大變化，但是否會發生信使RNA 水平的轉錄后調節尚不清楚。mRNA可以進行各種不同的化學修飾，包括N6 位腺苷的甲基化，從而導致N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）的形成［3］。m6A 是成人大腦中最豐富的可逆mRNA 修飾［4-5］。越來越多的證據表明，m6A RNA 甲基化在RNA 的產生/代謝中起著至關重要的作用，并參與了多種疾病的發病機制［6］。m6A 甲基轉移酶（methyltransferase-like protein 3，METTL3）作為m6A RNA 甲基化的關鍵調節酶，已發現其在中樞神經系統中發揮多種生物學作用，例如調節軸突引導，并且METTL3 在脊髓連合神經元中的特異性消融導致預交叉軸突引導缺陷并導致學習缺陷和記憶［7］。然而，METTL3 是否參與SEV 誘發的認知功能損傷尚未明確。因此，本研究建立了SEV 損傷大鼠模型，以證實METTL3 在誘發的認知功能損傷上的意義，并對其潛在機制進行探索。

1 材料與方法

1.1 動物和治療 體質量18 ～ 22 g（8 周齡）的C57BL/6小鼠購自南京大學模式動物研究所。動物在受控條件［（22 ± 2）℃，12∶12 h 光照：黑暗循環］下分組飼養，自由飲水和食物，并允許在實驗開始前適應實驗室條件至少1 周。交配時雌雄比例為2∶1。出生后6 d 小鼠隨機分為兩組（每組8 只）：對照組（Ctrl）和SEV 組。SEV 組小鼠在出生后第6、7 和8 天用3%SEV 在濕潤的20%氧氣載氣中進行麻醉，每天2 h，持續3 d。對照組中的新生小鼠在相同的腔室中僅以相同的流速接受20%的氧氣?；谙惹暗难芯浚?］，這些經SEV 處理或未長大至出生后65 d 的新生小鼠被定義為成年小鼠。此外，為了考察METTL3 敲低對SEV 誘發的認知功能損傷的影響，將出生后6 d 小鼠隨機分為4 組（每組8 只）：Ctrl+sh-NC 組、SEV+sh-NC 組、Ctrl+sh-METTL3 組和SEV+sh-METTL3 組。SEV+sh-NC 組和SEV+sh-METTL3 組在出生后第6、7、8 天用3%SEV 在濕潤的20%氧氣載氣中進行麻醉，每天2 h，持續3 d，并在出生后第9 天注射sh-METTL3 病毒。Ctrl+sh-NC 組和Ctrl+sh-METTL3 組出生后第6、7 和8 天以相同的流速接受20%的氧氣，并在出生后第9 天注射sh-NC 病毒。研究經本院倫理委員會批準同意（批件號：20190526）。

1.2 病毒包裝和立體定向注射 CMV-METTL3 shRNA（sh-METTL3）和METTL3 過表達腺相關病毒由山東維真生物科技有限公司構建和包裝。對于sh-METTL3 病毒包裝，合成小鼠METTL3 的shRNA序列（5'-GATCCGGGCAGGACAAAGCAATATTGTTCAAGAGACAATATTGCTTTGTCCTGCCCTTTTTTA-3'）并克隆到pAV-U6-GFP 質粒中以產生pAV-U6-eGFP-METTL3 shRNA。 Scramble 腺相關病毒作為對照病毒（sh-NC）。通過定量PCR測定的基因組滴度為4.72×1013TU/mL。對于METTL3過表達，合成小METTL3的編碼序列并克隆到PAG-CAG-eGFP 質粒中以產生PAG-CAG-METTL3-P2A-eGFP。產生eGFP 質粒病毒作為對照病毒（Vector）。通過碘克沙醇逐步梯度超速離心純化病毒顆粒。通過定量PCR 測定的基因組滴度為4.68×1013TU/mL。

對于病毒注射，通過腹膜內注射用氯胺酮（100 mg/kg）和甲苯噻嗪（8 mg/kg）麻醉小鼠并置于立體定向框架中。通過玻璃微量移液器以緩慢的速率（10 nL/min）。動物實驗中，幼鼠在SEV 麻醉后第9 天注射病毒（100 nL）。所有小鼠的Morris水迷宮試驗均為在出生后第65 天進行。

1.3 Morris 水迷宮測試 在SEV 暴露和其他實驗之后，通過使用如前所述的Morris 水迷宮測試在出生后60 ～ 65 d 評估空間記憶［9］。圓形黑色水池（直徑：120 cm；深度：21 cm）用不透明的水填充，使用白色無毒墨水達到平臺表面（直徑，10 cm）以上1.0 cm，水溫保持在22 ℃。在訓練階段，所有動物每天接受4 次訓練試驗，總共4 d。將老鼠放在一個特殊的起始位置的水池中，讓它們在60 s 內發現隱藏的平臺。如果小鼠在1 min 內無法找到平臺，則將其引導至平臺。記錄延遲時間（到達隱藏平臺的時間）以評估空間學習。在測試階段，移去平臺，讓每只老鼠在水池中自由游泳2 min。記錄平臺穿越時間和象限時間以測量記憶功能。

1.4 組織收獲 在Morris 水迷宮測試后第65 天收獲小鼠的腦組織。用2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg，i.p.）麻醉動物的大腦。然后，切開右心房并用肝素化的0.9%鹽水和4%甲醛進行經心灌注。提取腦組織并在4%甲醛中固定過夜，在含15%蔗糖的0.1 mmol/L 鹽緩沖液（pH 7.4）中固定24 h，然后在含30%蔗糖的0.1 mmol/L 磷酸鹽緩沖液中固定48 h。

1.5 高爾基染色 使用Hito Golgi-Cox OptimStainTMPreKit（美國Hitobiotec Corp 公司）在齒狀回（dentate gyrus，DG）中研究神經元樹突和樹突棘的形態。處死后獲得腦組織。用等體積的溶液A 和B浸漬腦組織，避光保存（室溫，2 周）。然后，將腦組織轉移到溶液C 中在4 ℃黑暗中儲存72 h。使用冷凍切片機生成腦切片（100 μm）。使用溶液C 將每個切片固定在涂有明膠的顯微鏡載玻片上，然后讓切片在室溫下自然干燥3 d。使用Olympus BX61 熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）觀察海馬DG 亞區的樹突。

1.6 蛋白質免疫印跡 使用RIPA 緩沖液（上海Beyotime 公司）和1×蛋白酶抑制劑混合物（上海Beyotime 公司）對不同組的海馬組織進行勻漿。通過離心（12 000 ×g，20 min）收集上清液，并通過二辛可寧酸蛋白質測定試劑盒（上海Beyotime 公司）測量蛋白質濃度。通過SDS-PAGE 分離50 μg 蛋白質的等分試樣并轉移到硝酸纖維素膜上，然后用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS，pH 7.4）中的5%脫脂牛奶封閉。將膜與針對METTL3（1∶1 000）、BDNF（1∶500）、FTO（1∶1 000）、METTL14（1∶500）、WTAP（1∶500）、YTHDF2（1∶1 000）、p-AMPK（1∶800）、AMPK（1∶800）和微管蛋白α（1∶10 000，均購自美國Abcam 公司）一抗在4 ℃下孵育過夜。在室溫下將印跡在辣根過氧化物酶偶聯的兔IgG（1∶5 000；美國CST 公司）二抗中孵育2 h。圖像由VersaDoc 4000MP 系統（美國Bio-Rad 公司）捕獲，條帶密度用自帶Quantity One 軟件分析。

1.7 斑點印跡法分析mRNA m6A 甲基化 參照文獻方法進行mRNA m6A 甲基化的斑點印跡分析［10］。使用Trizol 方法分離總RNA，并使用GenEluteTMmRNA Miniprep Kit（美國Sigma 公司）富集mRNA。通過NanoDrop 2000 測量mRNA 的濃度和純度。通過在95 ℃下加熱5 min 使mRNA 變性，然后立即在冰上冷卻。將mRNAs（100 ng）直接點樣到帶正電荷的尼龍膜（美國GE Healthcare 公司）上并風干5 min。然后將膜用5%脫脂牛奶在TBST 中封閉，在4 ℃下與抗m6A 抗體孵育過夜。將HRP綴合的抗兔IgG 二抗在室溫下加入膜中2 h，用增強的化學發光顯色。亞甲藍染色用于驗證膜上是否發現了等量的mRNA。

1.8 細胞培養和分組 本研究中使用的小鼠海馬神經元細胞系（HT-22）獲自上海匯盈生物科技有限公司，接種在含有10%（v/v）FBS 的Dulbecco's Modified Eagle's Medium（DMEM，美國Hyclone 公司）中培養。將細胞分為Vector 組和METTL3 組，分別轉染Vector 或METTL3 質粒，并在轉染48 h 后收集細胞進行相關測試。

1.9 雙熒光素酶測定 將螢火蟲熒光素酶報告基因與海腎報告質粒共轉染到HT-22 細胞中4 h。用Vector 或METTL3 質粒轉染48 h。使用Dual-Luciferase?Reporter Assay System（美國Promega 公司）測量螢火蟲和海腎螢光素酶活性。

1.10 mRNA 穩定性分析 參照文獻方法進行mRNA 穩定性分析［11］。HT-22 細胞用5 μg/mL 放線菌素D（美國Sigma-Aldrich 公司）處理以抑制整體mRNA 轉錄。分別在處理后3、6 和9 h 收集細胞，用于RNA 提取和逆轉錄。通過qPCR 定量AMPK mRNA 水平。

1.11 統計學方法 所有數據均使用SPSS 18.0 軟件進行分析，并表示為均數±標準差。使用非配對Student'st檢驗分析兩組之間的差異，并通過重復測量的單因素或雙向方差分析分析多組之間的差異，然后進行Bonferroni 事后檢驗。P< 0.05 認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SEV 會損害新生小鼠的空間記憶 與對照組相比，SEV 組小鼠在Morris 水迷宮試驗中具有更長的逃避潛伏期，較低的平臺穿越時間和更短的象限時間（P<0.01，圖1A-D）。樹突棘充當突觸強度的存儲位點，并幫助將電信號傳輸到神經元的細胞體。樹突棘的數量被認為是衡量神經元活動的有效方法。研究通過高爾基染色確定了兩組樹突棘數量，SEV 組海馬DG 區樹突棘的數量顯著低于Ctrl 組（P<0.01，圖1E-F）。

圖1 SEV 損害新生小鼠的空間記憶并減少海馬神經發生Fig.1 SEV damaged the spatial memory of newborn mice and reduced hippocampal neurogenesis

2.2 SEV 增加海馬中的m6A 水平 斑點印跡分析顯示暴露于SEV 的小鼠海馬組織中m6A 水平顯著增加（P< 0.01，圖2A）。同時，去甲基化酶FTO水平顯著下降（P<0.05），而甲基轉移酶METTL3、METTL14、WTAP 和結合蛋白YTHDF2 水平顯著增加（P<0.05，圖2B）。

2.3 SEV誘導的年輕小鼠認知缺陷需要METTL3 sh-METTL3 在小鼠中消除了METTL3 蛋白的表達（圖3A）。在接受sh-NC 病毒的小鼠中，與Ctrl 組相比，SEV 組小鼠在Morris 水迷宮試驗中具有更長的逃避潛伏期，較低的平臺穿越時間和更短的象限時間（P<0.01）。與sh-NC+SEV 組相比，sh-METTL3+SEV 組逃避潛伏期顯著縮短，平臺穿越時間和象限時間顯著增加（P< 0.05，圖3B-E）。此外，在接受sh-NC 病毒的小鼠中，與Ctrl 組相比，SEV 組小鼠DG 區樹突棘的數量和BDNF 表達均顯著降低（P< 0.01）。與sh-NC+SEV 組相比，sh-METTL3+SEV 組DG 區樹突棘的數量和BDNF 表達均顯著增加（P<0.05，圖3F-G）。

圖3 SEV 誘導的年輕小鼠認知缺陷需要METTL3Fig.3 METTL3 was needed for SEV-induced cognitive impairment in young mice

2.4 METTL3上調抑制海馬中的AMPK通路 與Ctrl 組相比，SEV 組小鼠海馬中AMPK 表達顯著降低（P<0.01）。與sh-NC+SEV 組相比，sh-METTL3+SEV 組海馬中p-AMPK 表達顯著增加（P< 0.05）（圖4）。體外研究中，METTL3 過表達質粒顯著增加了HT-22 細胞中的m6A 水平（P< 0.01，圖5A），同時顯著增加了METTL3 的表達并降低了BDNF和p-AMPK 表達（P< 0.05，圖5B）。AMPK 3'UTR報告熒光素酶測定顯示，METTL3 上調顯著降低了含有AMPK 3'UTR 的構建體的熒光素酶活性（P<0.05），這些m6A 位點（A 到T）的突變導致熒光素酶活性顯著增加（P< 0.05），并對METTL3 上調作用產生抗性（圖5C）。此外，METTL3 上調顯著降低了AMPK mRNA 穩定性（P<0.05，圖5D）。

圖4 蛋白質印跡檢查DG 亞區AMPK 表達Fig.4 The expression of AMPK in DG subregion was examined by protein blotting

圖5 METTL3 上調增加AMPK 3'UTR 中的m6A 修飾并降低HT-22 細胞中的AMPK mRNA 穩定性（n=3）Fig.5 Up-regulation of METTL3 increased m6A modification in AMPK 3'UTR and decreased the stability of AMPK mRNA in HT-22 cells（n=3）

3 討論

有明確的證據表明，生命早期麻醉暴露與隨后持續神經行為缺陷的風險增加之間存在聯系［12］。本研究對P6-P8 小鼠進行每天2 h 的3%SEV 麻醉，并在小鼠成年期觀察到認知缺陷。在許多動物模型中報告了類似的行為改變，包括從1～3 周齡暴露于SEV 的C57BL/6 小鼠，以及Wistar大鼠從出生后第4 天暴露于SEV 3 d，均表現出焦慮樣行為增加和認知障礙［13-14］。因此，SEV 會損害新生小鼠的認知功能。此外，本研究發現SEV 增加小鼠海馬中的m6A 水平，同時伴隨著FTO 減少和METTL3、METTL14 和WTAP 增加。這些結果提示m6A 甲基化增加和SEV 暴露誘導小鼠認知行為受損之間可能存在聯系。

m6A 甲基化在調節應激反應和大腦功能中發揮重要作用［4］。研究表明，m6A RNA 甲基化在AD中異常高，這歸因于METTL3 水平升高和FTO 受損［15］。還有研究報道海馬METTL3 異常表達不利于小鼠的長期記憶維持和鞏固，其可能通過m6A RNA 甲基化減弱神經元早期反應基因的翻譯［16］。本研究利用METTL3 shRNA 病毒來改變METTL3在海馬中的表達。METTL3 沉默病毒減輕了SEV引起的年輕小鼠空間記憶障礙，并改善了DG 區樹突棘的數量和BDNF 表達。BDNF 在大腦中的表達可能有助于腦損傷后的保護和再生作用［17］。已顯示樹突棘數量受BDNF 表達的影響［18］。目前的研究結果進一步強調METTL3 是SEV 誘導的對年齡敏感的學習能力障礙的易感性所必需的。

m6A RNA 甲基化控制與記憶和學習功效以及神經元分化相關的基因的表達和形態發生。然而，作為一種新發現的表觀遺傳調控方法，m6A RNA 甲基化可能是SEV 暴露中一小部分基因表達抑制的原因。值得注意的是，m6A 在5'UTR 而不是在3'UTR 或其他區域的富集，在調節基因表達中起重要作用。5'UTR 處的m6A 殘基通過規避m7G 帽要求［19］，實現了翻譯起始的帽獨立模型，而成熟多腺苷酸化mRNA 的3'末端m6A 的富集與另一種多腺苷酸化相關［20］。因此，筆者推測在海馬神經元細胞系統中，m6A 介導的翻譯過程占據了最終基因表達的主導階段。研究接下來探討了METTL3 對可能參與SEV 誘導認知行為受損相關靶點的影響。AMP 活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）充當能量傳感器，其是蛋白激酶級聯反應的下游組分，在維持能量穩態中起主要作用［21-22］。已經報道了AMPK 對酒精性肝損傷的保護作用［23］。此外，AMPK 過表達可改善老年大鼠的術后認知功能障礙［24-25］。本研究發現METTL3 沉默病毒逆轉了SEV 引起的AMPK 表達降低，METTL3上調抑制HT-22細胞中AMPK、BDNF的表達。此外，AMPK 3'UTR 含有對METTL3 上調反應的功能性m6A 修飾位點，這些m6A 位點的高甲基化導致AMPK mRNA穩定性降低。本研究結果表明，METTL3 上調通過m6A 介導的AMPK mRNA穩定性的降低抑制BDNF 表達，從而導致海馬依賴性記憶形成受損。

綜上所述，本研究探討了SEV 暴露導致小鼠認知功能損傷中的潛在機制，并發現SEV 暴露導致海馬組織中m6A 水平和METTL3 增加。METTL3敲低減輕了SEV 誘導的幼鼠認知功能損傷，其可能通過m6A 介導的AMPK mRNA 穩定性的降低導致海馬依賴性記憶形成受損。本研究為N6 甲基腺苷修飾在麻醉誘導的神經毒性中的作用提供數據支持，需要進一步了解N6 甲基腺苷修飾在麻醉相關行為缺陷中的作用機制。