長鏈非編碼RNA X失活特異轉錄物調控miR-340-5p對卵巢癌細胞上皮間質轉化的影響

姜平 郭哲 梁殿迅 楊喜科 付小玲 李和麗

河南省南陽市中心醫院（河南南陽 473000）

卵巢癌在全球女性癌癥患者中病死率最高［1-2］。由于缺乏有效和準確的診斷標志物，發現時往往已到晚期［2］。復發和轉移是導致卵巢癌患者死亡的重要原因，有研究發現癌細胞轉移和侵襲與上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）密切相關［3］。近年來，越來越多的長鏈非編碼RNA（long non-cording RNAs，lncRNA）被發現通過調節微小RNA（MicroRNAs，miRNAs）在卵巢癌中作為癌基因和抑癌因子［4-5］。lncRNA X 失活特異轉錄物（X-inactive specific transcript，XIST）能夠促進食管癌、結直腸癌發展［6-7］。下調lncRNA XIST 可抑制卵巢癌細胞的惡性生物學行為［8］。因此，lncRNA XIST 是一種潛在的卵巢癌診斷標志物，但其調控機制尚不清楚。生物信息學分析顯示miR-340-5p 可能是lncRNA XIST 的下游靶點，其在結腸癌、乳腺癌等多種人類惡性腫瘤中調控腫瘤生長和進展［9-10］。然而，在卵巢癌中，lncRNA XIST 和miR-340-5p 之間的潛在調控軸尚不清楚。本研究將探討lncRNA XIST 通過EMT 影響卵巢癌細胞遷移、侵襲的作用及其機制，為卵巢癌提供潛在的預后標志物。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器 lncRNA XIST 干擾載體（silncRNA XIST）質粒及其陰性對照（si-NC）、miR-340-5p 模擬物或抑制劑（miR-340-5p mimics 或miR-340-5p inhibitor）及其陰性對照（NC mimics 或NC inhibitor）、RT-qPCR 引物購自上海生工生物技術公司；Lipofectamine 2000 購自英國Invitrogen 公司；TaqManTMmicroRNA 反轉錄試劑盒和高容量cDNA反轉錄試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；qPCR 試劑盒購自日本Takara 公司；雙熒光素酶檢測試劑盒、Matrigel、放射免疫沉淀試劑盒購自北京索萊寶科學技術公司；BCA 蛋白檢測試劑盒購自廣州捷倍斯生物科技有限公司；兔抗E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、GADPH 抗體及羊抗兔抗IgG 購自Abcam 公司；FITC 標記的山羊抗兔抗體購自美國Santa Cruz 生物公司；4，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）購自美國Sigma-Aldrich 公司。RT qPCR 儀購自ABI 公司；Glomax 20/20 熒光檢測器購自Promega 公司；XDS 800D 倒置顯微鏡購自上海凱肯光學儀器有限公司。

1.2 組織樣本 收集2018-2021年本院28 例卵巢癌手術患者組織標本。正常組織來自于卵巢楔形活檢或附件切除術的纖維狀瘤或子宮腺肌癥。卵巢切除后，取下生殖上皮并進一步分析。本研究經本醫院倫理委員會批準，所有患者均簽署書面知情同意書。

1.3 細胞培養、分組與轉染 購自BNCC 公司的人正常卵巢上皮細胞IOSE80 和人卵巢癌細胞系ES-2、CoC1、SK-OV-3 和A2780 在添加10%胎牛血清的DMEM 培養基中培養，維持在5% CO2、37 ℃、飽和濕度條件下。

實驗分為Control 組（不轉染）、si-NC 組（轉染si-NC）、si-lncRNA XIST 組（轉染si-lncRNA XIST）、si-lncRNA XIST+NC inhibitor 組（轉染si-lncRNA XIST 和NC inhibitor）、si-lncRNA XIST+miR-340-5p inhibitor 組（轉染si-lncRNA XIST 和miR-340-5p inhibitor）。第3 代的A2780 細胞接種到24 孔板（2×106個/孔），然后培養至單層細胞。當細胞融合達到75%時，去除培養基，轉染細胞。在轉染前1 d，指數期生長的細胞被播種到6 孔細胞培養板中。孵育12 h后，使用Lipofectamine 2000進行細胞轉染。

1.4 RT-qPCR 檢測lncRNA XIST 和miR-340-5p表達水平 使用TRIzol 收集卵巢癌組織、細胞系及轉染48 h 后的各組A2780 細胞的總RNA。采用TaqManTMmicroRNA 反轉錄試劑盒和高容量cDNA反轉錄試劑盒進行反轉錄。以GAPDH 和U6 為內參，用qPCR 試劑盒配置PCR 反應體系（25 μL）。將PCR 反應液置于RT-qPCR 儀上進行PCR 反應。最后，使用2-ΔΔCT方法進行數據分析。PCR 引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.5 雙熒光素酶實驗證實lncRNA XIST 和miR-340-5p 的調控關系 利用在線網站（http：//starbase.sysu.edu.cn/index.php）分析lncRNA XIST和miR-340-5p 之間的靶向關系?；诙叩慕Y合序列，分別設計目標和突變序列，并將合成后的片段克隆到psiCHECK 2 載體中，進而獲得野生型/突變型（WT/MUT-lncRNA XIST）載體質粒。將重組質粒與miR-340-5p mimics 或NC mimics 共轉染至A2780細胞，記為NC mimics+WT-lncRNA XIST 組、miR-340-5p mimics+WT-lncRNA XIST 組、NC mimics+MUT-lncRNA XIST 組、miR-340-5p mimics+MUT-lncRNA XIST 組。48 h 后，按照雙熒光素酶檢測試劑盒的說明檢測熒光素酶活性的變化。用Glomax 20/20 熒光檢測器記錄這些變化，將si-NC、si-lncRNA XIST、pcDNA、pc-lncRNA XIST 分別轉染至A2780 細胞，記為si-NC 組、si-lncRNA XIST 組、pcDNA 組、pc-lncRNA XIST 組，48 h 后收集細胞，根據1.4 的方法檢測各細胞中miR-340-5p 的表達。

1.6 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 將各組A2780細胞制備成細胞懸液，以細胞密度為1 × 105個細胞/孔接種于6 孔板中。當細胞融合達到90%時，用200 μL 的無菌針尖在平板每孔底部做4 個標記。除去原培養基后，每孔補充2 mL 含10%血清的培養基并孵育。分別于劃痕后0 h 和24 h 倒置顯微鏡下拍照，至少測量5 個劃痕點的間距，取平均值。各組劃痕愈合率=（0 ～ 24 h）劃痕面積/0 h劃痕面積×100%。

1.7 Transwell 法評估細胞侵襲能力 用Matrigel（1∶8）在24 孔板上覆蓋Transwell 室底膜的上室。在上室中加入200 μL 的細胞懸液（1×105個/mL），在下室中加入含20%胎牛血清的DMEM 培養基600 μL，在37 ℃、5% CO2條件下孵育24 h。將上室表面非侵襲細胞擦拭干凈，剩余細胞用4%多聚甲醛固定15 min，0.5%結晶紫溶液染色15 min。倒置顯微鏡下，選擇5 個視野拍照。

1.8 Western blot 分析EMT 標志蛋白水平 轉染48 h后，提取A2780細胞總蛋白，然后用BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度。用10%SDS-PAGE分離蛋白質，轉膜后用含5%牛血清白蛋白的Tween-20 溶液的Tris-緩沖鹽水阻斷膜。隨后，用稀釋的E-cadherin、N-cadherin、Vimentin 多克隆抗體和GADPH在4 ℃孵育膜過夜。次日，用羊抗兔IgG 抗體在室溫下孵膜培養。通過電化學發光觀察條帶。

1.9 免疫熒光染色觀察EMT 標志蛋白表達 首先，用甲醇固定細胞，用0.1% Triton X-100 滲透細胞膜。接著，細胞與一抗（E-cadherin、N-cadherin 或Vimentin）在4 ℃孵育過夜。24 h 后，細胞與FITC標記的山羊抗兔抗體孵育2 h。細胞核用DAPI 染色。圖像用倒置顯微鏡拍攝。

1.10 統計學方法 資料均采用正態分布和方差齊性檢驗進行分析。符合正態分布的計量資料以平均值±標準差表示。將正常組織與癌組織數據進行t檢驗比較。多組間數據采用單因素方差分析進行比較。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 lncRNA XIST、miR-340-5p 在卵巢癌組織和細胞系中的表達水平 與正常組織相比，卵巢癌組織中lncRNA XIST 表達升高，miR-340-5p 表達降低（P<0.05），見圖1A。與IOSE80細胞相比，ES-2、CoC1、SK-OV-3 和A2780 細胞系中lncRNA XIST 表達增高，miR-340-5p 表達降低（P<0.05），見圖1B。由于A2780 細胞中lncRNA XIST、miR-340-5p 表達水平與IOSE80 細胞差異最明顯，故選擇A2780 細胞進行轉染實驗。

圖1 lncRNA XIST、miR-340-5p 在卵巢癌組織和細胞系中的表達水平Fig.1 Expression levels of lncRNA XIST and miR-340-5p in ovarian cancer tissues and cell lines

2.2 lncRNA XIST 靶 向下調miR-340-5p 表達 StarBase 網站預測顯示lncRNA XIST 與miR-340-5p存在互補位點，見圖2A。與NC mimics+WT-lncRNA XIST 組相比，miR-340-5p mimics+WT-lncRNA XIST 組熒光素酶活性降低（P< 0.05），見圖2B。此外，si-lncRNA XIST 組miR-340-5p 水平高于si-NC 組，pc-lncRNA XIST 組miR-340-5p 水平低于pcDNA 組（P<0.05），見圖2C。

圖2 lncRNA XIST 靶向結合miR-340-5p 并下調miR-340-5p 表達Fig.2 lncRNA XIST targets miR-340-5p and downregulates miR-340-5p expression

2.3 轉染si-lncRNA XIST抑制卵巢癌細胞遷移 與Control 組、si-NC組比較，si-lncRNA XIST 組lncRNA XIST 水平、劃痕愈合率下降（t= 26.497、26.931、56.383、56.040，P<0.05）；與si-lncRNA XIST組、si-lncRNA XIST+NC inhibitor組相比，si-lncRNA XIST+miR-340-5p inhibitor 組lncRNA XIST 水平、劃痕愈合率增加（t= 24.325、23.456、48.614、48.190，P<0.05），見圖3。

圖3 轉染si-lncRNA XIST 影響卵巢癌細胞遷移（×50）Fig.3 Effect of si-lncrNA XIST transfection on migration of ovarian cancer cells

2.4 轉染si-lncRNA XIST 抑制卵巢癌細胞侵襲 si-lncRNA XIST 組細胞侵襲數低于Control 組、si-NC 組（t= 33.115、32.526，P< 0.05）；si-lncRNA XIST+miR-340-5p inhibitor 組細胞侵襲數高于silncRNA XIST 組 和si-lncRNA XIST+NC inhibitor 組（t=26.207、25.425，P<0.05），見圖4。

2.5 轉染si-lncRNA XIST抑制卵巢癌細胞EMT 與Control 組 和si-NC組相比，si-lncRNA XIST 組E-cadherin mRNA 和蛋白表達水平升高，N-cadherin和Vimentin 的mRNA 和蛋白表達水平降低（P<0.05）；與si-lncRNA XIST 組和si-lncRNA XIST+NC inhibitor 組相比，si-lncRNA XIST+miR-340-5p inhibitor 組E-cadherin mRNA 和蛋白表達水平下降，Ncadherin 和Vimentin 的mRNA 和蛋白表達水平增高（P<0.05），見圖4、表7。另外，圖5 顯示，與Control組和si-NC 組比較，si-lncRNA XIST 組E-cadherin 表達增強，N-cadherin 和Vimentin 表達減弱；與si-lncRNA XIST 組 和si-lncRNA XIST+NC inhibitor 組 比較，si-lncRNA XIST+miR-340-5p inhibitor 組E-cadherin 表達減弱，N-cadherin 和Vimentin 表達增強。

圖4 轉染si-lncRNA XIST 影響卵巢癌細胞侵襲（×200）Fig.4 Effect of si-lncrNA XIST transfection on ovarian cancer cell invasion

圖5 轉染si-lncRNA XIST 影響卵巢癌細胞EMT 標志物表達（×200）Fig.5 Effect of si-lncrNA XIST transfection on EMT marker expression in ovarian cancer cells

3 討論

EMT 是一個復雜的過程，癌細胞表現為極性喪失和細胞表型從上皮細胞到間充質細胞形態的改變，被認為是血管生成上調、細胞運動性增強和細胞外基質侵襲等典型腫瘤表型的先決條件，也被認為是腫瘤侵襲和轉移的重要步驟［11］。通過EMT，轉化的上皮細胞獲得間充質特征，具有間充質表型的單個癌細胞可以穿過內皮屏障進入血液和淋巴循環［12］。這一過程的關鍵分子特征是上皮細胞標記物E-cadherin 的下調和間質細胞標記物N-cadherin、Vimentin 的上調［13-14］。

許多研究［15-17］表明，lncRNA可以通過參與EMT進程影響腫瘤的侵襲和遷移。lncRNA XIST 是一種17 kb 的lncRNA，通過調控哺乳動物X 染色體失活，獲得XX 女性和XY 男性之間的基因劑量等效值［18］。相關文獻顯示，lncRNA XIST 能促進卵巢癌、宮頸癌的進展以及膠質瘤的EMT［19-21］。本研究結果顯示，lncRNA XIST 在卵巢癌組織和4 種卵巢癌細胞系中均上調表達，這與JIANG 等［8］的發現一致，說明lncRNA XIST 在卵巢癌中發揮致癌作用。另外，以lncRNA XIST 表達最高的A2780細胞為轉染對象，通過轉染si-lncRNA XIST 下調lncRNA XIST 表達后，A2780 細胞的遷移和侵襲能力被抑制，此外，干擾lncRNA XIST 可顯著提高E-cadherin 表達，降低N-cadherin 和Vimentin 表達，與既往研究一致，提示干擾lncRNA XIST 表達能夠抑制卵巢癌細胞的EMT 進程，進而抑制細胞遷移和侵襲。

以往研究［22］表明，lncRNA XIST 對卵巢癌的影響通過調控miRNA實現，其下游靶點包括miR-335、miR-106a［23］等。本研究根據StarBase 預測網站發現miR-340-5p 是lncRNA XIST 的一個可能靶點。miR-340-5p 可能是結直腸癌的一種新的預后生物標志物和治療靶點，其通過直接靶向結直腸癌中的ANXA3 發揮其抑瘤功能［24］。miR-340-5p 在甲狀腺癌中高表達，其過表達可顯著促進甲狀腺癌增殖［25］。然而，miR-340-5p 在卵巢癌中的作用尚不清楚。本研究在卵巢癌組織和細胞系中檢測到顯著降低的miR-340-5p 水平，說明miR-340-5p 可能在卵巢癌中發揮抑癌功能，這與miR-340-5p 在甲狀腺癌中的作用相反，提示miR-340-5p 的表達趨勢與癌細胞的類型相關。熒光素酶實驗進一步證實了lncRNA XIST 與miR-340-5p 之間的直接調控關系。抑制miR-340-5p 表達在體外逆轉了干擾lncRNA XIST 對卵巢癌遷移、侵襲及EMT 的作用。這說明lncRNA XIST 通過抑制miR-340-5p 在卵巢癌中發揮致癌作用。

綜上所述，lncRNA XIST 通過靶向下調miR-340-5p 促進卵巢癌細胞EMT 和遷移、侵襲，有助于探索卵巢癌新的治療策略。然而，本研究還存在一些不足之處。第一，卵巢癌的臨床樣本量較少；第二，未進行體內實驗?；谶@兩點，未來將通過擴大臨床組織樣本量，并采用荷瘤裸鼠實驗，深入研究lncRNA XIST、miR-340-5p 在卵巢癌中的功能和作用機制。