miR21-5p靶向轉錄激活蛋白STAT3減輕高氧性急性肺損傷

周先貴 蔣艷 韓梅 鄭杰 覃松

遵義醫科大學附屬醫院1急診科，2心外科，4重癥醫學科（貴州遵義 563000）；3遵義醫科大學臨床醫學院（貴州遵義 563006）

長時間吸入> 60%濃度的氧氣或氧分壓>450 mmHg 會導致高氧性急性肺損傷（hyperoxia-induced acute lung injury，HALI），可增加危重患者死亡率，與不良預后密切相關［1］。有研究［2］表明，活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）促進了HALI的發生發展。ROS 蓄積可破壞氧化還原平衡損傷肺組織細胞，并促進炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）和白介素-6（IL-6）等在肺組織中大量募集，造成肺組織細胞凋亡壞死，最終導致急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）的發生［3］。轉錄激活蛋白STAT3在調節細胞凋亡、氧化應激及炎癥級聯反應中的作用不可或缺［4］。部分研究證實，ROS 與STAT3 磷酸化的動態平衡對維持細胞內環境穩定極其重要［5］。此外，STAT3 的過度活化可能造成組織細胞損傷，抑制STAT3 的過度活化可改善血管內皮通透性減輕脂多糖誘導的肺損傷［6-7］。微小RNA21-5p（miR21-5p）參與多種肺部疾病的產生和發展，并被確定為生物標志物或治療靶點［8］。課題組前期研究發現，抑制STAT3 過度活化可減輕HALI，同時miR21-5p 與STAT3 呈負相關［9］。通過檢索miRbase 數據庫發現，miR21-5p 可與STAT3 的三處結合位點結合。目前研究表明，STAT3 可促進miR21-5p表達，同時miR21-5p可負反饋調節STAT3表達水平［10-11］。但是關于miR21-5p 與STAT3 在HALI 中的調控作用尚不清楚。因此，本實驗擬通過構建HALI 動物模型驗證miR21-5p 是否負向調控STAT3 活化抑制凋亡以減輕HALI，以期闡明miR21-5p 與STAT3 在HALI 中的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物 選用8 周齡C57BL/6J 小鼠40 只，雌雄各半，體質量（21～25）g，采購于遵義醫科大學實驗動物中心，動物合格證號：（SYXK（黔）2021-0004）。各組小鼠分籠飼養于環境溫度（20 ± 2）℃、相對濕度（55 ± 5）%的環境中，通風換氣12 ～ 18 次/h，晝夜循環照明，給予標準小鼠飼料并自由飲用酸化水（pH：2.5～3.0）適應性飼養一周后進行相關實驗。本實驗經過遵義醫科大學倫理委員會批準（審批號：ZMU21-2202-098），相關操作符合美國《實驗動物飼養管理和試用手冊》第八版要求。

1.2 主要藥物、試劑及儀器 超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、RIPA 裂解液及BCA 蛋白濃度定量試劑盒，DCFH-DA 活性氧ROS 熒光探針和蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司）；TNF-α、IL-1β 及IL-6 酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assays，ELISA）檢測試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）；STAT3、p-STAT3、B 淋巴細胞瘤-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2 相關X 蛋白（Bax）和GAPDH 一抗及辣根過氧化物酶標記的二抗（美國Cell Signaling Technology 公司）；Trizol 試劑、miRNA 第一鏈cDNA合成試劑盒、miRNA 熒光定量PCR 試劑盒及miR21-5p 和U6 PCR 引物設計合成（上海生工生物工程股份有限公司）；miR21-5p 腺相關病毒-6（AAV-6）過表達載體及空載體（漢恒生物科技有限公司）。

1.3 動物分組、給藥及HALI 模型的建立 40 只C57BL/6J 隨機分為常氧組、高氧組、高氧+miR21-5p 組及高氧+空載體組。常氧組飼養于正?？諝庵?，高氧+miR21-5p組和高氧+空載體組分別經氣管導管滴入50 μL滴度為（1×1012TU/mL）的miR21-5p-AAV6 或空載體，每組分籠飼養3 周后，參照劉國躍［12］的方法建立HALI 模型：將實驗用C57BL/6J小鼠飼養于55 cm×40 cm×35 cm 的密閉有機玻璃容器自制高氧箱中，右側開孔接單向閥控制的氧氣接頭；左側開孔接氧濃度和二氧化碳濃度檢測儀。箱底放置鈉石灰吸收CO2，維持其CO2濃度< 0.5%；每天持續給氧23.5 h，維持氧濃度90%以上。定時開艙0.5 h 以添加食物、水并更換小鼠墊料。建模48 h，2%戊巴比妥納以45 mg/kg 腹腔注射麻醉小鼠后處死小鼠取肺組織行相關實驗，取肺組織行RT-PCR 檢測miR21-5p 表達水平驗證轉染成功。

1.4 雙熒光素酶報告實驗 將含有miR21-5p 結合位點的野生型（WT）或含有miR1-5p 結合位點突變序列的突變型（MUT）的3'UTR-STAT3 分別插入psiCHECK2 載體。利用Lipofectamine 2000 試劑將WT/MUT-STAT3 分別與miR21-5p mimics 或miRNC 轉染到HEK293T 細胞，轉染48h 使用雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測HEK293T 細胞熒光素酶活性（以海腎熒光素酶活性與螢光蟲熒光素酶活性的比值表示）。

1.5 炎癥因子及氧化還原標記物檢測 取小鼠肺組織稱重50 mg，剪碎后研磨成勻漿，4 ℃4 000 r/min離心10 min，吸取上清液，按照各試劑盒試劑盒說明書操作手冊檢測肺組織炎癥因子和氧化還原標志物。采用雙抗夾心法檢測炎癥因子：TNF-α、IL-1β 及IL-6。氧化還原標志物包括MDA、SOD 和ROS。使用黃嘌呤氧化酶法測定SOD 含量，硫代巴比妥酸反應法測定MDA 含量，熒光探針DCFH-DA法檢測ROS 水平。

1.6 肺水含量測定 取小鼠肺組織用濾紙吸干水分后稱重，記為肺組織濕質量（W 濕），經過60 ℃烤箱烘烤60 h 后稱重，記為肺組織干質量（D 干），肺組織含水量=（W濕-D干）/W 濕×100%。

1.7 肺組織病理學觀察及肺損傷病理評分 取小鼠肺組織使用10%福爾馬林溶液固定24 h，按照HE 染色試劑盒操作水明書進行HE 染色后，在倒置顯微鏡下觀察肺組織形態學改變并拍照，并在400倍視野下隨機選取至少20個視野，采用Matute-Bello［13］的方法進行標準化肺損傷病理評分。

1.8 Tunel 法檢測肺組織細胞凋亡 取小鼠肺組織10%福爾馬林溶液固定24 h 制作石蠟切片，60 ℃烘箱烘烤15 min 脫蠟；二甲苯脫蠟2×5 min，乙醇（依次100% 2 × 2 min、95% 2 × 1 min、85%1 ×1 min、75% 1 × 1 min）、蒸餾水2 min 水化；加入蛋白酶K 溶液100 μL，37 ℃通透30 min；PBS 洗3 ×5 min；滴加配置好的Tunel 染液100 μL，含DAPI抗熒光淬滅劑封片，拍照。

1.9 小鼠肺組織miR21-5p表達檢測 取小鼠肺組織，加入Trizol 裂解液，使用組織細胞破碎儀裂解組織，提取RNA，酶標儀測定總RNA 濃度及純度。使用miRNA 第一鏈cDNA 合成試劑盒（加尾法）將總RNA 逆轉錄為cDNA，進行定量PCR 擴增。采用SYBR GreenI 染料法對microRNA 進行熒光定量檢測：反應體系為20 μL：2×miRNA qPCR master mix 10 μL；前后引物各1 μL；Template DNA（miR21-5p）2 μL；ROX Referense Dye（L）/（H），1 μL；加入RNase-free water 至20 μL。PCR 反應條件為：預變性：95 ℃30 s；變性：95 ℃5 s；退火/延伸：60 ℃30 s；共40 個循環。引物序列為：miR21-5p，正向5'-CCGGCTAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3'和反向5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'；U6，正向5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'和反向5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；采用相對定量法檢測RNA擴增，以U6 作內參，采用2-ΔΔCt法計算miR21-5p 表達量。

1.10 Western blot 肺組織STAT3、p-STAT3、Bax及Bcl-2 蛋白表達取小鼠肺組織稱重，加入RIPA裂解液、蛋白酶和磷酸酶抑制劑，使用組織細胞破碎儀裂解組織，4 ℃12 000 r/min 離心15 min，取上清液使用BCA 法進行蛋白定量后分裝，-80 ℃凍存備用。用10%或12%SDS-PAGE 凝膠分離蛋白，轉膜后使用5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入STAT3、p-STAT3、Bax、Bcl-2及GAPDH 一抗，4 ℃孵育16 h；PBST 溶液洗膜3 次（5 min/次），加入IgG-HRP 后室溫避光孵育1 h，PBST 洗膜溶液3 次（5 min/次），加入ECL 發光液后使用Gel DocTMEZ 全自動凝膠成像系統曝光、拍照。使用Image J 軟件進行條帶灰度值分析。以GAPDH 為內參照，計算目標蛋白STAT3、p-STAT3、Bax 及Bcl-2 的相對表達量。

1.11 統計學方法 采用IBM SPSS 24.0 統計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差表示，多組比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR21-5p 靶向STAT3 通過在線預測網站Starbase（http：//starbase.sysu.edu.cn）預測到miR21-5p 與STAT3 之間存在靶向結合位點（圖1）。與miR-NC 組相比，miR21-5p 組WT-STAT3 的293T 細胞熒光活性顯著降低，與anti-miR-NC 組相比，antimiR21-5p 組DEFA3 WT 的293T 細胞熒光活性顯著升高，見表1。

圖1 miR21-5p 直接調控STAT3 表達Fig.1 miR21-5p directly regulates expression of STAT3

表1 miR21-5p 結合STAT3Tab.1 miR21-5p binding to STAT3±s

表1 miR21-5p 結合STAT3Tab.1 miR21-5p binding to STAT3±s

組別miR-NC miR21-5p anti-miR-NC anti-miR21-5p F 值P 值熒光活性STAT3 WT 1.06±0.07 0.42±0.06①0.98±0.07 1.87±0.04②615.1<0.001 STAT3 MUT 1.04±0.06 1.00±0.06 0.97±0.07 0.98±0.08 1.179 0.342 8

2.2 miR21-5p對HALI小鼠肺組織形態學、肺組織W濕/D干重比值及肺損傷病理評分的影響 如圖2 和表2 所示：常氧組HE 染色見肺泡結構清晰，肺泡壁光滑，偶有中性粒細胞浸潤；高氧暴露48 h可見肺泡結構紊亂、間隔增厚，大量炎癥細胞浸潤，透明膜形成及肺泡萎陷，與常氧組比較，高氧組肺損傷病理評分及肺組織W濕/D干重比值升高（P<0.05）；miR21-5p 過表達預處理后，HE 染色可見肺泡結構紊亂不明顯，肺間質增厚及炎癥細胞浸潤程度較高氧組明顯減輕，與高氧組比較，高氧+miR21-5p組肺損傷病理評分及肺組織W濕/D干重比值下降（P<0.05）。

圖2 各組小鼠肺組織HE 染色情況（×400）Fig.2 HE staining of lung tissue of mice in each group（×400）

表2 各組小鼠肺組織W 濕/D 干重比值、肺損傷病理評分和miR21-5p 表達的比較Tab.2 Comparison of Wwet/Ddry weight ratio，lung injury pathological score and miR21-5p expression in lung tissue of mice in each group ±s

表2 各組小鼠肺組織W 濕/D 干重比值、肺損傷病理評分和miR21-5p 表達的比較Tab.2 Comparison of Wwet/Ddry weight ratio，lung injury pathological score and miR21-5p expression in lung tissue of mice in each group ±s

注：①與常氧組比較，P<0.05；②與高氧組比較，P<0.05；③與高氧+miR21-5p 組比較，P<0.05

組別常氧組高氧組高氧+miR21-5p 組高氧+空載體組F 值P 值肺W 濕/D 干重比值3.57±0.60 5.65±0.35①4.56±0.33①②5.66±0.33①③34.67<0.001肺損傷病理評分（分）0.10±0.03 0.84±0.04①0.44±0.04①②0.84±0.03①③654.8<0.001 miR21-5p（2-△△Ct）1.00±0.09 0.35±0.04①3.13±0.26①②0.34±0.04①③548.5<0.001

2.3 miR21-5p 對HALI 小鼠肺組織SOD、MDA 及ROS 的影響 如表3 所示，高氧暴露48 h 后各組小鼠肺組織SOD、MDA 及ROS 表達水平比較，差異有統計學意義（P<0.05）；與常氧組比較，高氧組、高氧+miR21-5p 組及高氧+空載體組MDA 及ROS水平升高（P< 0.05），SOD 水平降低（P< 0.05）；與高氧組比較，高氧+miR21-5p 組ROS 及MDA 水平降低（P<0.05），SOD 水平升高（P<0.05）；與高氧+miR21-5p 組比較，高氧+空載體組ROS 及MDA 水平較高氧+miR21-5p 組升高（P< 0.05），SOD 水平降低（P<0.05）。

表3 各組小鼠肺組織SOD、MDA 和ROS 表達的比較Tab.3 Comparison of SOD，MDA and ROS expression in lung tissue of mice in each group ±s

表3 各組小鼠肺組織SOD、MDA 和ROS 表達的比較Tab.3 Comparison of SOD，MDA and ROS expression in lung tissue of mice in each group ±s

注：①與常氧組比較，P < 0.05；②與高氧組比較，P < 0.05；③與高氧+miR21-5p 組比較，P<0.05

組別常氧組高氧組高氧+miR21-5p組高氧+空載體組F值P值SOD（U/mg）61.51±4.71 17.69±3.66①42.74±3.97①②18.28±6.00①③183.4<0.001 MDA（nmol/mg）8.34±0.66 49.62±3.55①27.59±4.86①②51.52±3.85①③194.7<0.001 ROS（U/mg）49.48±4.68 205.56±6.99①124.12±5.12①②207.50±6.66①③966.5<0.001

2.4 miR21-5p 對HALI 小鼠肺組織TNF-α、IL-6及IL-1β 的影響 如表4 所示，高氧暴露48 h 各組小鼠肺組織TNF-α、IL-6 及IL-1β 水平比較，差異有統計學意義（P<0.05）；與常氧組比較，高氧組、高氧+miR21-5p 組和高氧+空載體組TNF-α、IL-6及IL-1β水平升高（P<0.05）；與高氧組比較，高氧+miR21-5p 組TNF-α、IL-6 及IL-1β 水平降低（P<0.05）；與高氧+miR21-5p 組比較，高氧+空載體組TNF-α、IL-6 及IL-1β 水平較升高（P<0.05）。

表4 各組小鼠肺組織TNF-α、IL-6 和IL-1β 表達的比較Tab.4 Comparison of expression of TNF-α，IL-6 and IL-1β in lung tissue of mice in each group ±s

表4 各組小鼠肺組織TNF-α、IL-6 和IL-1β 表達的比較Tab.4 Comparison of expression of TNF-α，IL-6 and IL-1β in lung tissue of mice in each group ±s

注：①與常氧組比較，P < 0.05；②與高氧組比較，P < 0.05；③與高氧+miR21-5p 組比較，P<0.05

組別常氧組高氧組高氧+miR21-5p 組高氧+空載體組F 值P 值TNF-α（ng/mL）18.97±3.46 344.55±5.11①145.84±6.05①②343.73±4.43①③6499<0.001 IL-6（pg/mL）31.43±3.65 200.67±8.98①120.60±3.87①②201.31±8.43①③870.3<0.001 IL-1β（ng/mL）35.36±5.18 144.50±4.48 87.01±6.19 145.43±5.14 599<0.001

2.5 Tunel 法檢測肺組織細胞凋亡 如圖3 表5 所示：與常氧組比較，高氧組、高氧+miR21-5p 組及高氧+空載體組小鼠肺組織細胞凋亡率升高（P<0.05）；miR21-5p 預處理可減輕高氧暴露所致細胞凋亡，與高氧組比較，高氧+miR21-5p 組小鼠肺組織細胞凋亡率降低（P<0.05）。

圖3 Tunel 法檢測肺組織細胞凋亡情況（×200）Fig.3 The Tunel method detects apoptosis of lung histocytes（×200）

2.6 miR21-5p 對HALI 小鼠 肺 組織STAT3、p-STAT3、Bcl-2和Bax蛋白表達的影響 如表5、圖3所示，各組小鼠高氧暴露48 h 后肺組織STAT3、p-STAT3、Bcl-2 和Bax 蛋白表達比較，差異有統計學意義（P<0.05），與常氧組比較氧組肺組織STAT3、p-STAT3和Bax蛋白表達水平升高（P<0.05），Bcl-2蛋白表達降低（P< 0.05）；與高氧組比較，高氧+miR21-5p 組小鼠肺組織STAT3、p-STAT3 和Bax 蛋白表達水平降低（P<0.05），Bcl-2蛋白表達水平升高（P< 0.05）；與高氧+miR21-5p 組比較，高氧+空載體組肺組織STAT3、p-STAT3 和Bax 蛋白表達水平升高（P<0.05），Bcl-2蛋白表達水平降低（P<0.05）。

表5 各組小鼠肺組織STAT3、p-STAT3、Bcl-2 和Bax 蛋白表達的比較Tab.5 Comparison of STAT3，p-STAT3，Bcl-2 and Bax protein expression in lung tissue of mice in each group ±s

表5 各組小鼠肺組織STAT3、p-STAT3、Bcl-2 和Bax 蛋白表達的比較Tab.5 Comparison of STAT3，p-STAT3，Bcl-2 and Bax protein expression in lung tissue of mice in each group ±s

注：①與常氧組比較，P<0.05；②與高氧組比較，P<0.05；③與高氧+miR21-5p 組比較，P<0.05

組別常氧組高氧組高氧+miR21-5p 組高氧+空載體組F 值P 值STAT3 0.63±0.07 0.86±0.04①0.39±0.08①②0.89±0.05①③58.14<0.001 P-STAT3 0.61±0.05 0.84±0.04①0.37±0.05①②0.89±0.05①③66.94<0.001 Bax 0.66±0.06 1.03±0.08①0.81±0.06①②1.05±0.08①③21.87<0.001 Bcl-2 1.06±0.08 0.57±0.06①0.81±0.07①②0.61±0.06①③33.75<0.001凋亡率（%）0.36±0.09 5.98±0.91①3.21±0.65①②5.79±0.98①③37.78<0.001

3 討論

HALI 的特征是ROS 蓄積和肺部炎癥級聯反應［14］。一方面，ROS 可通過脂質與蛋白質過氧化、DNA 損傷等機制造成組織細胞損傷促進炎癥進展；另一方面，炎癥反應進一步促進ROS 產生，引起肺毛細血管內皮和肺泡上皮細胞凋亡壞死，導致其通透性增加，加重肺水腫和（或）肺不張，促進ARDS 的發生發展［4，15］。而抑制ROS 的超負荷蓄積可阻止肺泡上皮細胞凋亡顯著減輕HALI［14］。在本實驗中，高氧暴露48 h 后，可見肺組織大量炎癥細胞浸潤、間隔增厚、透明膜形成和肺泡萎陷；同時肺損傷病理評分、肺水含量及炎癥因子升高；說明模型構建成功。而通過miR21-5p 預處理，可減輕肺組織炎癥細胞浸潤程度及間隔厚度，且肺泡萎陷顯著減少，同時肺損傷病理評分、肺水含量及炎癥因子表降低，并且STAT3 及p-STAT3 蛋白表達下降，說明miR21-5p 可能通過調控STAT3 活化減輕HALI。

圖4 miR21-5p 對HALI 小鼠肺組織STAT3、p-STAT3、Bcl-2 和Bax 蛋白表達的影響Fig.4 Effects of miR21-5p on the expression of STAT3，p-STAT3，Bcl-2 and Bax proteins in the lung tissues of HALI mice

轉錄激活蛋白家族成員STAT3 在氧化還原平衡、凋亡及炎癥反應的作用已成為研究的熱點［4］。目前研究認為，適當的ROS 水平可促進STAT3 活化，活化的STAT3 可正向和（或）負向調控ROS 水平，ROS/STAT3 之間的動態平衡在細胞促存活方面發揮重要作用［5］。然而，STAT3 的過度活化可能破壞氧化還原平衡、血管內皮通透和促進細胞凋亡加劇ARDS 的進展，而抑制STAT3 的過度活化可通過調節血管內皮完整性、氧化還原平衡、炎癥反應和凋亡減輕脂多糖誘導的急性肺損傷［7，16］。本實驗中，高氧暴露48 h 后，可見p-STAT3 水平顯著表達，同時MDA、ROS及炎癥因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）顯著升高，而SOD 降低，說明高氧暴露可破壞氧化還原平衡、促進炎癥因子表達，而miR21-5p 預處理后，炎癥因子及MDA、ROS 水平下降，SOD 水平升高，說明，miR21-5p 可能通過STAT3 調控氧化還原平衡減輕HALI。

microRNAs 是一類進化上高度保守長度約19～25 核苷酸的核苷酸RNA，其通過與靶基因3'非編碼區（3'-UTR 區）結合，在轉錄后水平調控靶基因表達［17］。其通過調控氧化還原平衡、凋亡及炎癥反應等病理生理過程在肺部疾病的發生發展中極為重要［18］。而miR21-5p 已被確認為相關肺部疾病的生物標志物、治療靶點及預后指標的候選者指標［10］。部分研究表明，miR21-5p 過表達可通過抑制TNF-α、IL-6 及IL-1β 的表達和STAT3 活化減輕脂多糖誘導的急性肺損傷［10，19-20］。本實驗通過miRbase 數據庫發現STAT3 是miR21-5p 靶基因，雙熒光素酶報告實驗及RT-qPCR 實驗結果表明miR21-5p 可靶向負調控STAT3。miR21-5p 過表達預處理后，p-STAT3 水平下降，抗凋亡蛋白Bcl-2 升高，促凋亡蛋白Bax 下降，肺組織細胞凋亡率顯著下降。表明，miR21-5p 可通過調控STAT3 過度活化抑制組織細胞凋亡。

綜上，miR21-5p 對HALI 具有保護作用，可能通過調控氧化還原平衡、抑制炎癥反應并減輕細胞凋亡，并且與轉錄激活蛋白STAT3 密切相關。但本實驗僅通過Western blot 及Tunel 法檢測肺組織凋亡，未在細胞分子水平檢測如巨噬細胞、肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡水平；故本實驗還存在不足之處。課題組下一步將通過沉默STAT3 或使用STAT3 基因敲除鼠進一步在細胞層面探討miR21-5p 靶向STAT3 在HALI 中的分子機制，以期為臨床防治HALI 提供可靠的科學依據。