間作柿子樹對蘋果根際土壤微生物群落結構和功能的影響

鄭 嬌,劉娟娟,張東華,伍建榕,劉 麗

(西南林業大學生物多樣性保護學院/云南省高校森林災害預警控制重點實驗室, 昆明 650224)

【研究意義】蘋果(MalusdomesticaBorkh.)屬于薔薇科(Rosaceae)蘋果亞科(Maloideae)蘋果屬(Malus)[1],因其具有豐富的營養價值備受人們喜愛[2]。在中國,蘋果是種植面積最廣、產量最高、經濟地位最重要的水果之一[3]。近年來,蘋果連作障礙嚴重阻礙了蘋果產業的發展[4],究其原因主要是因為土壤中毒素殘留,土壤營養、酸堿度改變及土壤微生物失衡[5]。植物根際是土壤-根系-微生物三者相互影響、相互作用的主要區域,根際微生物與植物協同發展,被稱為是植物的第二基因組[6],能將土壤中植物不可利用的營養元素轉化為可利用形式[7],能產生抗生素抑制植物病原菌[8],能產生信號化學物質與根際有益或致病微生物互作,從而間接促進植物生長和抵抗逆境[9-10]?？梢哉f植物病害的發生,尤其是根部病害,與土壤系統中微生物結構及其多樣性有著密切的關系[11]。間作能增加土壤微生物的代謝活動,促進微生物多種代謝功能的表達,是最有效的生態農業種植模式之一?！厩叭搜芯窟M展】已有大量研究表明,間作可增加根際微生物的數量,改變根際微生物群落結構[12],從而控制植物病害。如桃樹和石榴間作可提高土壤微生物群落的碳代謝能力,從而修復石榴枯萎病害土壤[13];辣椒和紫蘇間作能有效防控辣椒疫病的發生,同時提高辣椒的產量和品質[14]。雖然與蘋果間作的物種繁雜多樣,如大豆[15]、苜蓿[16]、芳香植物[17]等,但針對蘋果間作系統的研究主要集中在果實品質及土壤理化性質方面,能有效控制蘋果根部病害,解決連作障礙的間作模式尚有待探索。柿子樹(DiospyroskakiThunb.)屬于柿科(Ebenaceae)柿屬(Diospyros),原產于溫帶地區,在中國栽培歷史悠久,果實既可生食也可入藥,是藥食兼用的經濟樹種[18]。柿葉中富含較強抗菌活性的多種黃酮類物質[19],已有研究表明,柿子樹根際土壤的優勢細菌為芽孢桿菌(Bacillus)[20],該屬是目前最常見的植物病害生防菌源。柿樹與茶間作可以促進茶樹的生長和茶業品質的提高[21]?！颈狙芯壳腥朦c】有研究發現在蘋果園間作柿子樹對蘋果根腐病具有一定的抑制作用,本文揭示柿子樹與蘋果樹間作對蘋果根際微生物群落結構和土壤理化性質的影響?！緮M解決的關鍵問題】以間作(I)和非間作(NI)的蘋果根際土壤為材料,采用高通量測序技術,對蘋果根際微生物群落結構及土壤理化性質進行分析,以期了解該間作體系的抗病潛力。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

試驗地點位于云南省昆明市團結鄉鼎順農業科技有限公司蘋果園基地(102°48′ E, 25°11′ N),海拔2195 m,年平均降雨量800～1200 mm,年平均氣溫13.2 ℃。試驗地為平地,土壤類型為紅壤。蘋果為11年生的德國富士(砧木 M26),柿子樹為6年生的次郎,截止采樣時已連續間作6年。

1.2 土樣采集

2021年6月采集土壤樣品,分別選取間作柿子樹的蘋果根際土和非間作柿子樹的蘋果根際土2種類型土壤,采集時,清除地表雜物,在距離根際1 cm左右向下挖10～20 cm,取其根際土壤1.1 kg,間作和非間作各隨機取3個重復。將所采土樣裝入潔凈自封袋中,標記標簽,間作模式蘋果根際土樣記為I1、I2、I3,非間作模式蘋果根際土樣記為NI1、NI2、NI3,冰袋低溫保存,帶回實驗室。將每份土樣分為兩部分,部分土樣(1 kg)送往云南同川農業分析測試技術有限公司測定土壤理化性質;另一部分土樣(0.1 kg)用于提取土壤總DNA。

1.3 土壤理化性質檢測

土壤理化性質由云南同川農業分析測試技術有限公司采用國標規定的方法檢測,其中土壤pH采用NY/T 1377—2007電位法測定;土壤有機質采用NY/T 1121.6—2006重鉻酸鉀容量法測定;全氮采用NY/T 1121.24—2012自動定氮儀法測定;水解性氮采用LY/T 1228—2015堿解擴散法測定;全磷和有效磷采用分別采用NY/T 88—1988和NY/T 1121.7—2014鉬銻抗比色法測定;全鉀采用NY/T 87—1988火焰光度法或原子吸收分光光度法測定;有效鉀采用NY/T 889—2004以中性1 mol/L乙酸銨溶液浸提-火焰光度計測定。

1.4 土壤微生物高通量測序

采用試劑盒E.Z.N.ATMMag-Bind Soil DNA Kit(Omega,USA)提取土壤總DNA。使用Qubit2.0(life,USA)測定DNA濃度,以確保提取足夠數量的高質量基因組DNA。

土壤總DNA由生物工程(上海)股份有限公司運用Illumina MiSeq系統進行文庫構建、測序等操作。細菌16S rDNA序列擴增引物為341F(5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’)和805R(5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’);真菌ITS序列擴增引物為ITS1F(5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)和ITS2(5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)。

1.5 數據統計與分析

為獲得更加精確和高質量的生物學信息,首先對原始數據的質量進行質控過濾,得到各樣本的有效數據,用軟件Usearch按照97%相似性對非重復序列 (不含單序列) 進行OTU聚類,在聚類過程中去除嵌合體。16S rDNA基于RDP數據庫,ITS基于UNITE數據庫進行物種注釋。采用軟件Mothur計算Shannon指數、Simpson指數、Alpha多樣性指數,以Chao1和Ace指數表征豐富度,以Shannon和Simpson指數表征多樣性,以Shannoneven指數表征均勻度;Beta多樣性是對不同生態系統之間多樣性的比較,是物種組成沿環境梯度或者在群落間的變化率,用來表示生物種類對環境異質性的反應。采用R軟件mixOmics包進行監督性的PLS-DA分析,pheatmap包進行微生物群落和環境因子相關性分析。采用PICRUSt2分析根際土壤細菌群落功能,用FUNGuild[22]根據營養方式將真菌分為病原營養型、腐生營養型、共生營養型和交叉營養型。利用軟件SPSS 26.0進行顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 蘋果根際土壤理化性質

對間作與非間作蘋果根際土壤理化性質進行分析。結果(表1)表明,間作柿子樹增加了蘋果根際土壤中有機質(Organic matter,OM)、水解性氮(Available nitrogen,AN)、全磷(Total phosphorus,TP)含量,降低了土壤中有效鉀(Available potassium,AK)含量。

2.2 蘋果根際土壤微生物序列及Alpha多樣性

通過對間作和非間作蘋果根際土壤樣品進行Illumina Miseq高通量測序并且質控。結果表明,拼接后共獲得細菌有效序列830 755條,測序長度主要分布在400～450 bp;真菌有效序列289 576條,測序長度主要分布在100～500 bp。

從圖1可知,隨著測序深度的增加,細菌和真菌的微生物稀釋曲線逐漸趨于平緩,各樣本測序深度均大于0.99,表明取樣量充足合理,測序結果已覆蓋測試樣品中的絕大部分物種,微生物群落結構的置信度較高,此次測序結果可真實反映各處理蘋果根際土壤微生物群落結構的組成。

由表2可見,間作和非間作蘋果根際土壤細菌豐富度指數和多樣性指數均無顯著差異(P>0.05)。由表3可見,非間作蘋果根際土壤真菌Ace指數顯著高于間作(P<0.05),說明間作柿子樹顯著降低了蘋果根際真菌群落的物種數量; Shannon指數顯示,間作和非間作蘋果根際土壤中細菌和真菌均勻度均無顯著差異(P>0.05)。

2.3 蘋果根際土壤微生物群落下Beta多樣性分析

PLS-DA分析結果表明,間作和非間作蘋果根際土壤細菌群落(圖2-a)和真菌群落(圖2-b)組成均通過橫坐標被明顯分開,說明間作和非間作的蘋果根際土壤細菌群落和真菌群落結構均存在明顯差異。

2.4 蘋果根際土壤微生物群落組成分析

在門分類水平,從圖3-a可知,間作和非間作蘋果樹根際土壤細菌群落主要分布在9個門,包括變形菌門(Proteobacteria),分別占50.24%、54.15%;放線菌門(Actinobacteria),分別占12.13%、13.52%;酸桿菌門(Acidobacteria),分別占10.25%、11.55%;擬桿菌門(Bacteroidetes),分別占6.07%、3.73%;浮霉菌門(Planctomycetes),分別占3.19%、2.16%;厚壁菌門(Firmicutes),分別占2.46%、2.52%;芽單胞菌門(Gemmatimonadetes),分別占2.22%、2.45%;藍細菌門(Cyanobacteria),分別占2.11%、0.11%;疣微菌門(Verrucomicrobia),分別占1.24%、1.83%;未鑒定細菌(unclassified_Bacteria),分別占7.23%、5.05%。其中間作顯著增加了擬桿菌門在蘋果根際土壤的相對豐度(P<0.05),一定程度上增加了藍細菌門的相對豐度。從圖3-b可知,間作和非間作蘋果樹根際土壤真菌群落主要分布在4個門,包括子囊菌門(Ascomycota),分別占81.36%、56.87%;被孢霉門(Mortierellomycota),分別占11.75%、22.77%;羅茲菌門(Rozellomycota),分別占3.11%、6.49%;擔子菌門(Basidiomycota),分別占1.74%、11.17%。間作和非間作蘋果根際土壤中占比小于1%及不可歸類的真菌門相對豐度分別為2.04%和2.71%,二者無顯著差異。

表1 蘋果根際土壤理化性質

圖1 蘋果根際土壤微生物稀釋曲線Fig.1 Microbial dilution curve of apple rhizosphere soil

表2 蘋果根際土壤中細菌群落多樣性指數

表3 蘋果根際土壤中真菌群落多樣性指數

圖2 蘋果根際土壤微生物的PLS-DA分析Fig.2 PLS-DA analysis of rhizosphere soil microorganisms of apple

圖3 蘋果根際土壤微生物群落門水平上的相對豐度Fig.3 Relative abundance of apple rhizosphere soil microbial community at phylum level

在屬分類水平,從圖4-a可知,間作根際土壤共鑒定出細菌418屬,非間作鑒定出436屬。其中,豐度前10的屬為Gp6,分別占5.01%、2.60%;鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas),分別占3.28%、1.99%;假單胞菌屬(Pseudomonas),分別占2.69%、0.38%;芽單胞菌屬(Gemmatimonas),分別占2.22%、2.45%;Streptophyta屬,分別占2.11%、0.10%;Gp3屬,分別占1.35%、2.08%;Lysobacter屬,分別占1.34%、0.93%;Ohtaekwangia屬,分別占1.34%、0.55%;慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium),分別占0.84%、2.04%;Gp4屬,分別占0.75%、1.34%。在間作根際土中共有3個特有屬,分別為擬桿菌門、衣原體門和厚壁菌門下的未鑒定屬;非間作根際土共有18個特有屬,其中變形菌門6個屬,放線菌門5個屬,厚壁菌門5個屬,綠彎菌門2個屬。間作和非間作蘋果根際土壤中還存在大量未鑒定及不可歸類的屬,其相對豐度分別為75.88%和79.40%,這表明間作和非間作蘋果根際土壤中可能還存在大量新屬種。從圖4-b可知,間作根際土壤共鑒定真菌251屬,非間作鑒定出299屬。豐度前10 的屬為Phaeoacremonium屬,分別占19.97%、8.77%;頭梗霉屬(Cephaliophora),分別占12.08%、4.60%;被孢霉屬(Mortierella),分別占11.54%、22.68%;緣刺盤菌屬(Cheilymenia),分別占9.74%、6.30%;毛葡孢屬(Botryotrichum),分別占6.78%、2.44%;Arthrographis屬,分別占4.09%、0.84%;小鐮孢屬(Fusariella),分別占3.52%、0.13%;腐質霉屬(Humicola),分別占3.26%、2.63%;赤霉菌屬(Gibberella),分別占2.30%、3.73%;短梗霉屬(Aureobasidium),分別占1.97%、0.32%。在間作根際土壤中有33個特有屬,其中子囊菌門20個屬,擔子菌門8個屬,毛霉菌門2個屬,壺菌門2個屬,捕蟲霉門1個屬;在非間作根際土壤中共有79個特有屬,其中子囊菌門59個屬,擔子菌門16個屬,毛霉菌門3個屬,壺菌門1個屬。間作和非間作蘋果根際土壤中未鑒定及不可歸類真菌屬的相對豐度分別為19.05%和27.76%。

Other指I和NI根際土相對豐度都<1%及未歸類的屬。Other refers to the relative abundance of both I and NI rhizosphere soils <1% and unclassified genera.

進一步結合LEfSe分析(圖5-a),發現間作與非間作根際土壤細菌共21個屬存在顯著差異。其中間作顯著增加了17個細菌屬的豐度,分別為已知屬Sporacetigenium、Tepidisphaera、Agromyces、Alkanindiges、Phycisphaera、Pseudoxanthomonas、Terrimonas、Pseudohaliea、Paenisporosarcina共9個;未知屬8個,分別隸屬變形菌門2屬、厚壁菌門2屬、浮霉菌門2屬、擬桿菌門1屬、疣微菌門1屬。4個細菌屬的豐度顯著降低,分別為Sporichthya、Methylocystis、Devosia和Altererythrobacter。從圖5-b可知,間作與非間作根際土壤中真菌4個屬存在顯著差異,間作顯著增加了Arthrographis屬的相對豐度,降低了Cylindrocarpon、Metacordyceps和Exophiala3個屬的相對豐度。

2.5 蘋果根際土壤微生物與環境因子間的關系

在屬分類水平上,根際細菌與土壤化學性質的Spearman相關性熱圖(圖6-a)所示,間作和非間作根際土壤中Gp6、Sphingomonas和Lysobacter與pH呈顯著正相關,與有效鉀(AK)呈顯著負相關;Pseudomonas與水解性氮(AN)、有效磷(Available phosphorus,AP)、全氮(Total nitrogen,TN)、全磷(TP)呈顯著正相關;Bradyrhizobium和Reyranella與AK呈顯著正相關;Arthrobacter與有機質(OM)呈顯著負相關;Bradyrhizobium和Devosia與pH呈顯著負相關; Saccharibacteria_genera_incertae_sedis與全鉀(Total potassium,TK)呈顯著負相關。

標紅部分表示P<0.05顯著性水平。The red part indicates P<0.05.

根際土壤真菌與土壤化學性質的Spearman相關性分析(圖6-b)表明,在間作和非間作根際土壤中Botryotrichum與pH呈顯著正相關;Naganishia與AN、AP呈顯著正相關;Readeriella與 pH呈顯著負相關;Fusariella、Botryotrichum和Fusarium與AK呈顯著負相關;Polyscytalum與AN、AP、TN、TP呈顯著負相關;Minimedusa與OM、AN、AP、TN呈顯著負相關。

2.6 根際土壤功能預測分析

從圖7可知,基于COG數據庫將細菌16S rRNA基因序列進行功能預測,共預測出4792個COG,A～W共23種類別。間作和非間作根際土壤中相對豐度最高的是R(一般功能預測),相對豐度最低的是W(真核細胞的細胞外結構功能)。其中,間作顯著降低了G(碳水化合物運輸和代謝)和W(胞外結構)兩大類功能豐度。從表4可知,對豐度達到0.1%的COG進行方差分析,結果表明,間作顯著降低了COG1028(不同特異性的脫氫酶)、COG2814(阿拉伯糖流出透性酶)、COG0596(預測水解酶或?；D移酶)、COG1846 和COG1609(轉錄調節基因)、COG0491(依賴鋅的水解酶)、COG0667(醌還原酶)和COG0604(相關的鋅依賴的氧化還原酶)的相對豐度;顯著增加了COG0642(信號轉導組氨酸激酶)和COG2165(II型分泌通路,PulG蛋白)的相對豐度。

圖7 蘋果根際土壤微生物COG類別分析Fig.7 COG classification analysis of apple rhizosphere soil microorganisms

表4 蘋果根際細菌預測的優勢COG功能豐度

FUNGuild真菌功能預測分析表明,共有133個OTU未歸類菌群間作(14.73%),非間作(12.37%),其余去除動物病原菌群后,共有344個OTU。間作和非間作根際土壤均以腐生-共生過渡型占主導(45.66%,49.24%),其次為病原-腐生-共生營養型(19.67%,18.75%)、腐生型(13.88%,7.25%)、病原型(2.65%,3.38%)、病原-腐生過渡型(1.83%,4.76%)、共生型(1.46%,3.76%)、病理-共生過渡型(0.11%,0.41%)。進一步方差分析表明,間作與非間作處理的病原-腐生過渡型真菌的豐度差異達顯著水平。

3 討 論

間作能改變土壤養分,本研究表明,間作增加了蘋果根際土壤TP含量,根際細菌屬Pseudomonas與AP、TP呈顯著正相關,根際真菌屬Naganishia與AP呈顯著正相關;王峰等[23]研究發現Pseudomonas具有抑制病原菌,防治植物土傳病害的作用,真菌屬Naganishia的部分種有拮抗Fusarium、Phytophtora和Alternaria的活性[24],表明間作有利于調控AP和TP含量,同時促進有益菌的產生。木薯與大豆連續3年間作使土壤中有效氮、有效磷和有效鉀的含量增加近20倍[25]。本研究證明,間作柿子樹也提高了蘋果根際土壤有機質、水解性氮、全磷含量,但也有研究表明,蘋果園間作花生顯著降低了蘋果園有機質和全磷含量[26]。

間作能顯著提高土壤微生物群落的多樣性和豐富度。本研究結果表明,間作柿子樹對蘋果根際土壤細菌多樣性及豐富度無顯著影響,但卻顯著降低了根際土壤真菌的Ace指數。這可能與柿子樹的化感特性有關。

門水平細菌群落結構分析表明,間作與非間作蘋果根際細菌均以變形菌門為最優菌門,其次是放線菌門和酸酐菌門,有研究表眀,蘋果根腐病[27]、砧木[28]、間作柿子樹都不能影響其根際細菌最優門水平的群落結構。與非間作相比,間作柿子樹顯著增加了蘋果根際擬桿菌門的豐度。擬桿菌門細菌是土壤養分轉化的重要貢獻者[29],因此相對非間作蘋果根際土壤,間作蘋果根際土壤也能獲得更多的養分,同時研究發現在土壤中施加植物根際促生菌也能增加擬桿菌門的相對豐度[30],這也可作為今后調控土壤養分的一種方法。間作與非間作根際均為子囊菌門占絕對優勢,其次是被孢霉門,部分植物如半夏、玉米根際真菌符合這個規律[31]。病害土壤中土壤微生物非常敏感[32],其群落多樣性和結構變化會影響土傳疾病的發生。間作柿子樹顯著增加了蘋果根際細菌屬Sporacetigenium、Tepidisphaera、Agromyces、Alkanindiges、Phycisphaera、Pseudoxanthomonas、Terrimonas、Pseudohaliea、Paenisporosarcina;Agromyces屬是土壤健康的指標[33];Alkanindiges屬是健康生菜的指標[34];蘋果根際土中Terrimonas屬的豐度與蘋果植株的生長呈顯著正相關[35];Tepidisphaera屬細菌多具有降解胞外生物聚合物的潛力[36]。此外,Agromyces對間作大豆[37],Pseudoxanthomonas對植物[38]的生長有促進作用。間作增加了真菌屬Arthrographis的相對豐度。有研究表明真菌Arthrographis對腐殖質的形成有重要作用,而堆肥腐殖質可改良土壤,降低病原微生物的產生幾率[39-40]?？梢?間作柿子樹顯著增加了一些對蘋果植株健康生長有益的細菌和真菌豐度。

土壤中植物病原真菌增加是蘋果連作障礙的重要原因之一,其中Fusarium、Cylindrocarpon和Rhizoctonia等病原出現的頻率較高[41]。本研究中間作柿子樹顯著降低了蘋果根際真菌屬Metacordyceps、Cylindrocarpon、Exophiala的相對豐度。這與Jia等[42]研究發現芥菜與黃瓜間作顯著降低Metacordyceps屬相對豐度的研究結果一致,這可能與芥菜和柿子樹都是多酚化合物含量較高的植物有關。Cylindrocarpon屬豐度降低,暗示著間作柿子樹對抵御蘋果連作障礙有一定潛力。Exophiala屬下真菌多數引起人類和動物的疾病[43]。

本研究通過PICRUSt2功能預測分析,發現間作顯著降低了碳水化合物運輸和代謝與胞外結構兩大類功能的相對豐度。這與董奇琦等[44]研究發現玉米、花生間作后土壤細菌碳水化合物的運輸和代謝相對豐度升高的研究結果不一致,這可能與根系環境,土壤肥力、氣候條件等差異和間作體系不同有關。間作顯著增加了COG0642(信號轉導組氨酸激酶)和COG2165(II型分泌通路,PulG蛋白)的相對豐度。信號轉導組氨酸激酶是細菌雙組分系統的一部分,是細菌中主要的信號轉導途徑。該功能的增強反應了間作系統下根際細菌對環境變化的響應。細菌II型分泌系統主要是分泌與疾病直接相關的效應子,而該系統中PulG蛋白的過渡產生會極大降低分泌素的細胞水平,從而阻礙分泌[45]。采用FUNGuild對間作和非間作根際土壤真菌進行功預測,結果表明,間作顯著降低了病原-腐生過渡型真菌的豐度,但目前造成蘋果根腐的常見病原菌Fusarium、Cylindrocarpon、Rhizoctonia都屬于腐生型病原菌。

4 結 論

對間作和非間作蘋果根際土壤微生物群落結構分析結果表明,間作柿子樹增加了蘋果根際土壤有機質、水解性氮、全磷含量,有助于提高蘋果根際土壤肥力。間作和非間作土壤細菌和真菌群落結構都存在顯著差異,間作顯著增加了蘋果根際土壤中17個細菌屬和1個真菌屬的豐度;顯著降低了4個細菌屬和3個真菌屬的豐度,其中包含Agromyces、Alkanindiges、Tepidisphaera、Pseudoxanthomonas等有益微生物相對豐度的顯著增加及蘋果根際主要病原真菌Cylindrocarpon豐度的減少,在一定程度上為控制蘋果根部病害提供了良好的根際環境。