美人蕉黃條病毒揚州、長沙分離物全基因組的測定與序列分析

朱 晨,唐 偉,陰 筱,董玲霞,孫厚俊

(1.江蘇徐淮地區徐州農業科學研究所/農業農村部甘薯生物學與遺傳育種重點實驗室,江蘇 徐州 221131;2.山東省農業科學院濕地農業與生態研究所,濟南 250100)

【研究意義】美人蕉(CannaindicaL.)屬于美人蕉科(Cannaceae)美人蕉屬(Canna),是起源于中美洲和南美洲等熱帶地區的單子葉多年生草本植物[1]。美人蕉適應性強,栽培管理便利,在世界各地均有栽種,主要用作觀賞植物。在南美和東南亞,美人蕉根莖還被用于食品加工[1-2]。目前,美人蕉在我國常用做園林綠化植物,在各地廣泛種植[3]。近年研究發現,美人蕉含有黃酮類、異戊二烯聚合物、生物堿、蛋白質、糖苷、皂苷、單寧等物質,具有較高藥用價值[4]。美人蕉病毒病是美人蕉的一種重要病害,可導致美人蕉出現條紋狀花葉、壞死等癥狀,嚴重影響美人蕉的商品屬性和觀賞價值。因此,診斷侵染美人蕉的病毒種類,分析病毒序列特征,明確病毒進化關系,對我國美人蕉病毒病害防控研究具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前,全世界已報道侵染美人蕉的病毒共有6種,分別是美人蕉黃斑駁病毒(Canna yellow mottle virus, CaYMV)[5]、菜豆黃花葉病毒(Bean yellow mosaic virus, BYMV)[6]、黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)[7]、甘蔗花葉病毒(Sugarcane mosaic virus, SCMV)[8]、番茄不孕病毒(Tomato aspermy virus, TAV)[9]和美人蕉黃條病毒(Canna yellow streak virus, CaYSV)[10]。其中CaYSV是馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)成員,可以通過蚜蟲進行非持久性傳播,也可以通過機械摩擦進行傳播[1]。在實驗室接種環境下,CaYSV也可以侵染本氏煙(Nicotianabenthamiana)、昆諾阿藜(Chenopodiumquinoa)和四季豆(Phaseolusvulgaris)[1]。由于美人蕉主要通過根莖扦插等營養手段進行無性繁殖,隨著商品流通性不斷加快,使得CaYSV的發病和擴散能力具有更大威脅。目前,CaYSV已在英國、美國、以色列、俄羅斯等不同國家的美人蕉品種中被發現[10]?！颈狙芯壳腥朦c】前期對CaYSV的研究大多數集中在國外,國內僅對CaYSV的檢測技術有報道[11],但對CaYSV基因組序列特征、遺傳進化及重組分析研究未見報道?！緮M解決的關鍵問題】利用RT-PCR和RACE技術對揚州和長沙2個地區美人蕉上CaYSV全基因組序列進行擴增,并通過MegAlign、Mega11和RDP5軟件解析我國CaYSV病毒序列特征、遺傳進化及重組事件,為該病毒的防控提供指導和理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

美人蕉葉片樣品采自江蘇省揚州市、湖南省長沙市,其癥狀表現為條紋狀花葉,采集后置于-80 ℃保存備用。

1.2 RNA提取及病原分子鑒定

取美人蕉病葉100 mg,用液氮研磨,參照MiniBEST Universal RNA Extraction Kit(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)說明書提取RNA,溶解后于-80 ℃保存。以美人蕉總RNA為模板,利用M4T為引物進行反轉錄,再參照陳炯等[12]報道的方法進行PCR擴增。擴增產物回收、克隆后,送生工生物工程(上海)股份有限公司測序,測序結果使用NCBI網站BLAST進行比對。

1.3 CaYSV全基因組引物設計及RT-PCR擴增

根據從GenBank下載的12個CaYSV全基因組序列設計引物(表1),并以CaYSV-3R為引物進行反轉錄,得到新cDNA后進行擴增。25 μL擴增體系:10×Buffer(Mg2+plus)2.50 μL、2.50 mmol dNTP 1.00 μL、正反向引物各1.00 μL、cDNA 1.00 μL、DNA 聚合酶 0.25 μL、ddH2O 18.25 μL。反應程序:94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s,退火30 s,72 ℃延伸1 min,30個循環;72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。5′-race擴增,分別設計5′-race引物CaYSV-in和CaYSV-out,具體實驗操作參照Scotto-Lavino等的方法[13]。

表1 CaYSV擴增引物

1.4 序列分析

RT-PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,用DNA凝膠回收試劑盒(北京百泰克生物技術有限公司)回收目的片段,克隆、測序后經DNASTAR軟件拼接。通過MegAlign軟件Clustal W方法比對不同分離物全基因組核苷酸序列和多聚蛋白氨基酸序列的一致率。以BYMV和SCMV為外組,根據全基因組核苷酸序列和CP蛋白氨基酸序列分別通過Mega 11軟件利用極大似然法(Maximum likelihood, ML)構建系統進化樹,Bootstrap檢驗1000次[14]。

1.5 重組分析

利用RDP 5軟件包中RDP、GENECONV、Boot Scan、MaxChi、Chimaera、3Seq和SiScan 7個軟件對CaYSV全基因組序列進行重組檢測[15]。

2 結果與分析

2.1 美人蕉疑似病樣的癥狀

在江蘇省揚州市、湖南省長沙市采集感病美人蕉葉片,病株均表現出葉脈黃化、脈間條紋狀褪綠癥狀(圖1)。

2.2 CaYSV分子鑒定及全基因組克隆與結構分析

提取江蘇揚州和湖南長沙美人蕉病樣的總RNA,利用M4T引物分別進行反轉錄,采用陳炯等[12]的方法進行擴增,獲得1.8 kb目的條帶,測序結果經NCBI BLAST比對發現揚州和長沙美人蕉病樣分離物的序列與CaYSV分離物KS一致率最高,分別達99.3%和99.5%。

采用分段克隆和RACE方法對揚州分離物和長沙分離物全基因組序列進行克隆,分別獲得大小為3814、4119和1697 bp目的條帶和約330 bp RACE條帶。利用DNASTAR對所得片段進行拼接,獲得CaYSV揚州分離物和長沙分離物全基因序列,二者全基因組序列長度均為9501 nt,其中5’UTR均為153 nt,3’UTR均為225 nt(GenBank登錄號分別為OQ 627371和OQ 627372)。CaYSV全基因組包含1個9123 nt的開放閱讀框(Open reading fragment, ORF),編碼3040個氨基酸的多聚蛋白,通過水解酶酶切形成10個成熟蛋白,分別為P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、VPg、NIa-Pro、NIb和CP,其中NIb具有RdRp功能;9個酶切位點推定為Y/A、G/G、Q/K、Q/G、E/T、Q/A、E/G、E/D、Q/A,在P3中存在由G1A6移碼產生的PIPO蛋白(圖2)。

通過MegAlign軟件Clustal W比對不同分離物之間核苷酸和氨基酸一致率,結果發現CaYSV揚州分離物和長沙分離物與其他分離物全基因組核苷酸一致率分別在93.9%～99.4%和94.0%～99.5%,其中揚州分離物與長沙分離物一致率最高,而長沙分離物與俄羅斯分離物KS一致率最高(圖3-a)。CaYSV揚州分離物和長沙分離物與其他分離物多聚蛋白氨基酸一致率分別在95.1%～99.2%和95.7%～99.7%,揚州分離物和長沙分離物均與俄羅斯分離物KS一致率最高(圖3-b)。

2.3 CaYSV系統進化分析

利用MEGA 11中ML法,根據CaYSV全基因組核苷酸序列構建系統發育樹。揚州分離物(OQ627371-JSYZ)和長沙分離物(OQ627372-HNCS)關系最接近,與俄羅斯分離物KS(MG545919-KS)和貴州分離物GZ(OL546222-GZ)聚類到同一分支(圖4-a)。根據CaYSV的CP蛋白氨基酸序列進行系統進化分析,發現CaYSV可以分為A和B 2個大組,其中A組又可以劃分為3個亞組,揚州分離物和長沙分離物均聚類到A1亞組(圖4-b),說明揚州分離物和長沙分離物與CaYSV分離物OK、KS、K2、PHC478遺傳關系較近。

2.4 CaYSVCP蛋白氨基酸序列分析

Ali和Mamoori等[20]研究發現CaYSV不同分組中絲氨酸和蘇氨酸存在不同的特征類型。對CaYSV CP蛋白N-端氨基酸進行序列比對,發現揚州分離物和長沙分離物第22、23、34、36、50位為絲氨酸,第2、26、29、35、58、60、65位為蘇氨酸(圖5)。其中基序S34TS36與A1亞組分離物OK、GZ、KS、DSMZ、K2-5-4一致,但與A1亞組K2-6-1、PHC478-6C6、PHC478-9C4的基序N34TS36不一致,說明揚州分離物和長沙分離物CaYSV CP蛋白N-端絲氨酸和蘇氨酸變化與A1亞組基本一致,但A1亞組中也存在不同氨基酸的分化。

菱形表示本研究中獲得的分離物。The rhombus represents the isolate obtained in the study.

位點已標記。The positions are pointed out.

2.5 CaYSV揚州分離物和長沙分離物重組分析

通過RDP5軟件中的7個程序(RDP、GENECONV、Bootscan、MaxChi、Chimaera、SiScan和3Seq)對CaYSV揚州分離物和長沙分離物進行重組分析,發現RDP5軟件的7個程序均支撐CaYSV揚州分離物和長沙分離物重組事件的發生,其中Chimaera算法的P值最大,為4.063×10-17(表2),主要親本序列均為分離物UK(GQ421689),說明CaYSV揚州分離物和長沙分離物中均存在1個重組事件,重組位點分別為NIb(7891)和NIb(8015)。

表2 CaYSV揚州分離物和長沙分離物重組事件分析

3 討 論

通過RT-PCR和RACE方法獲得病毒全基因組序列已在植物RNA病毒上廣泛應用,利用該方法Tang等[16]獲得SCMV SO株系的全基因組序列,Imamura等[17]獲得火百合花葉病毒(Vallota mosaic virus, ValMV)的全基因組序列,王廿等[18]獲得草莓鑲脈病毒(Strawberry vein banding virus,SVBV)貴州分離物的全基因組序列,謝麗雪等[19]獲得東亞西番蓮病毒(East asian passiflora virus, EAPV)的全基因組序列。本研究采集江蘇揚州和湖南長沙的美人蕉葉片樣品,獲得CaYSV病毒的揚州分離物和長沙分離物的基因組全長序列。序列比對結果表明,揚州分離物與長沙分離物一致率最高為99.4%,而長沙分離物與俄羅斯KS分離物一致率最高為99.5%。根據CP蛋白氨基酸序列將CaYSV分為A和B 2個組,其中A組可分為3個亞組,A1亞組主要包含美洲和東亞及東南亞地區分離物,A2亞組為美國NC1～NC5分離物,A3亞組為中東伊拉克分離物,B組為美國和歐洲分離物,上述結果與Chauhan等、Ali等報道一致[1,20],說明不同分組可能具有地域性,中國分離物與鄰近國家分離物的親緣關系較近。

CP蛋白作為病毒的組成蛋白,受到更多的自然選擇壓力,導致CP蛋白氨基酸序列發生改變。如辣椒輕斑駁病毒(Pepper mild mottle virus, PMMoV)CP蛋白氨基酸變化克服辣椒L4基因型的抗性[21],SCMV玉米分離物和甘蔗分離物CP蛋白氨基酸的變化具有寄主依賴性[22]。CaYSV的CP蛋白共有287個氨基酸組成,其N端絲氨酸和蘇氨酸的變化有助于該病毒組和亞組的劃分[1]。揚州分離物和長沙分離物CaYSV CP蛋白N-端絲氨酸和蘇氨酸變化與A1組基本一致。

重組是推動RNA病毒變異進化的主要動力之一,在多種馬鈴薯Y病毒屬病毒中均有發現[23],在對煙草脈帶花葉病毒(Tobacco vein banding mosaic virus, TVBMV)[24]、甘薯羽狀斑駁病毒(Sweet potato feathery mottle virus, SPFMV)[25]、油桃莖痘相關病毒(Nectarine stem-pitting-associated virus, NSPaV)[26]等病毒重組研究印證這點。前期發現CaYSV美國分離物BZ2、BZ3和OK存在重組事件[27],本研究發現,CaYMV中國江蘇揚州和長沙分離物也均存在重組事件,重組位點分別為NIb(7891)和NIb(8015),而該重組位點在英國分離物UK中也有報道[27]。

4 結 論

CaYSV存在于我國江蘇揚州和湖南長沙的美人蕉上。根據CaYSV的CP蛋白氨基酸構建系統進化樹,揚州分離物和長沙分離物聚類到A1亞組,與泰國分離物K2、PHC478及俄羅斯分離物KS等親緣關系較近。這為開展CaYSV的遺傳進化、致病機制及其防控措施研究奠定基礎。