炭疽病對油橄欖果實真菌群落結構的影響

郭海霞,黃雯瀾,,王 謝,李謹宵,王 銳,楊育林,向成華,張建華

(1.特色園藝生物資源開發與利用四川省高校重點實驗室/成都師范學院,成都 613000;2.四川省農業科學院農業資源與環境研究所,成都 610066;3. 四川省林業科學研究院,成都 712100)

【研究意義】油橄欖(Oleaeuropaea)是木犀科木本果用兼油料作物,因其環境適應能力強、果實含油量高、油品質好、經濟效益高,越來越受種植者和消費者歡迎[1-2]。全球油橄欖的生產地主要集中在地中海沿岸,主要生產國家為西班牙和意大利。2011年全球油橄欖種植面積為1.01×107hm2,橄欖油消費量達3.09×107t,呈逐年上升趨勢[3]。油橄欖最早于1907年由法國傳教士引入我國,1956—1962年由中國科學院等正式引入試種[4]。據統計,2021年我國油橄欖產量為7.29×104t,油橄欖主要種植區在甘肅和四川[5]。兩省總產量占全國總產量的94%左右。其中,甘肅產量約4.1×104t,四川約2.6×104t。炭疽病是制約我國南方地區油橄欖產業發展的主要病害。該病主要危害果實、嫩芽、嫩葉及嫩梢,引起大量落果、落葉、枯梢,果實品質下降。病斑初為褐色小點,圓形,后擴大,中心略凹陷,可造成油橄欖大面積減產。Juan等[6]在測試了來自科爾多瓦世界橄欖種質庫384個橄欖品種的炭疽病易感性后指出,幾乎所有西班牙油橄欖品種都可歸類為極易感染、容易感染或較易感染三類。而我國大多數推廣栽培品種來源于西班牙。因此,掌握感染炭疽病油橄欖果的真菌區系變化特征對我國油橄欖產業的發展具有重要的現實意義?！厩叭搜芯窟M展】炭疽病是一種危害性較強的真菌性病害,主要危害葉片和果實,常引起大量落葉、落果和枯梢,以及果實品質和產量降低[7]。炭疽病的病原菌主要為刺盤孢屬(Colletotrichum)真菌,可侵染草莓、茶樹、辣椒、油橄欖等30多種植物,嚴重損害植物品質,造成較大的經濟損失[8-11]。時全昌[12]1979年研究指出油橄欖炭疽病是由刺盤孢菌屬(Colletotrichumsp.)侵染所致。2018年,張知曉等[11]對云南永仁油橄欖炭疽病病原菌進行了分離鑒定,進一步確定了我國油橄欖炭疽病的主要病原菌為盤長孢狀刺盤孢(C.gloeosporioides)。同時,王敬文[13]研究發現,盤長孢狀刺盤孢主要以孢子侵染果實,侵染后能分泌對油橄欖組織發生毒害的化合物,該毒素對油橄欖原生質體具有毒害作用,能使最敏感的愈傷組織在短時間內壞死,從而毒害油橄欖?！颈狙芯壳腥朦c】雖然當前研究已經分離鑒定出油橄欖炭疽病的病原菌,并形成一定的防治技術[14],但對炭疽病病原菌與健康果實原有微生物之間的互作關系尚不知曉?？蓮奈⑸锷鷳B學角度,進一步探明感染炭疽病后油橄欖果實內微生物結構和多樣性變化,為全面解析感染炭疽病后油橄欖果實各部位微環境和生理變化提供依據[15]。另外,日益成熟的高通量測序技術[16]為微生物多樣性研究提供了更加可靠的技術支撐?！緮M解決的關鍵問題】本研究采用高通量測序技術,探究炭疽病油橄欖果實和健康果實的真菌群落結構及多樣性的差異,為油橄欖炭疽病的綜合防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

研究區位于四川省成都市金堂縣淮口產業科技綜合示范園油橄欖種植區(104°08′ E,30°11′ N,海拔432 m),屬于亞熱帶季風氣候。種植區于2009年開始種植油橄欖,栽培密度4 m×4 m,主要栽培品種有阿貝基娜、皮瓜爾和萊星,種植面積約5153.33 hm2。區內氣候條件、栽培管理措施和水肥用量基本一致,年平均氣溫16.9 ℃,年均降水量760 mm,濕度大,年平均日照1295.5 h,土壤類型為黃壤。研究區內油橄欖炭疽病在各品種上均有發生。油橄欖炭疽病主要影響果實,對樹木生長無影響。

1.2 樣品采集

2020年12月10日,于研究區內選擇3塊空間位置相對獨立、種植面積不小于300 m2且有油橄欖炭疽病發生的橄欖種植田塊進行調查。每個田塊上不分品種隨機采集健康果實和發病果實,按照發病程度分為健康果實(CK)、發病前期果實(MP)和發病后期果實(SP)。果實未變質為健康果實,果實變質部分少于1/2為發病初期,果實整個部分全部變質為染病發病后期(圖1)。每個園區CK、MP和SP的樣品采集量不低于100 g。采集后當日帶回實驗室,按照無菌棉花富集法[17]采集果皮(Peel)上的真菌群落,然后果實表面消毒后在無菌條件下將果皮、果肉、種子完全分離開來。將無菌分離的果皮放入棉花富集法獲得的樣品中合為1個果皮真菌檢測的總樣品,將無菌分離的果肉(Flesh)作為1個果肉真菌檢測的總樣品。采集后的樣品按照發病程度、果實部位、來自第i個試驗區分別編號為SP_peel_i、SP_flesh_i、MP_peel_i、MP_flesh_i、CK_peel_i和CK_flesh_i,編號后立即放入-80 ℃冰箱,用于DNA提取。

圖1 健康油橄欖果實、發病初期油橄欖果實和發病后期油橄欖果實對比Fig.1 Comparison of healthy fruits,mildly anthracnose diseased fruits and severe anthracnose diseased fruits

1.3 高通量測序分析

所有樣品送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行DNA提取和ITS1-2高通量測序。試劑盒擴增引物為Read1 3′端和Read2 3′端。測序引物接頭分別為AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCC AGTCA和AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAA GAGTGT,擴增片段長度為300 bp[18]。

1.4 統計與分析

為揭示真菌分類單元(Operational taxonomic units,OTU),本研究將序列進行歸類操作(Cluster)。通過歸類操作,將序列按照彼此的相似性分為許多小組,1個小組就是1個OTU。通常按97%的相似度,對所有序列進行OTU劃分并進行生物信息統計分析。

為揭示處理間真菌物種組成的差異性,本研究基于ImageGP平臺(http://www.ehbio.com/ImageGP/)開展韋恩(Venn)分析和群落結構分析。為比較不同組間標志性物種差異,本研究基于微科盟生科云平臺(https://bioincloud.tech/)平臺,開展了線性判別分析(Linear discriminant analysis Effect Size,LEfSe)。真菌功能類群利用第三方工具FUNGuild v1.0 完成。為揭示處理間物種的多樣性,本研究采用ACE指數[19](Abundance-based coverage estimators)和Chao指數[20](Chao’s index)表征物種的豐富度,用Shannon 指數、Simpson指數、Shannon evenness指數代表群落內物種的多樣性。Shannon指數是物種豐富度和分布均勻度的綜合度量,Shannon指數越大則群落多樣性越高。Simpson指數反映了群落中個體數量分布的集中度,Simpson指數越高表明群落中個體越集中在少量優勢物種上,群落優勢度越大,群落分布不均勻,多樣性低。Shannon evenness指數描述群落均勻性,Shannon evenness指數越高,代表群落分布越均勻,多樣性越高。本研究基于SPSS 23.0軟件,采用單因素(One-way ANOVA)和Duncan法多重比較(α=0.05)分析了發病程度和果實部位對群落多樣性指數、相對豐富度的影響(P<0.05)。圖表中數據為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 真菌分類單元結構特征

測序結果顯示,6個處理測出真菌覆蓋率均大于99%,檢測結果有效(表1)。由表2可知,油橄欖果實的18個樣本中共獲得有效真菌序列80 182條。堿基數在10 396 294～28 667 930 bp,平均堿基數為19 637 830 bp,堿基長度在42～490 bp,真菌序列長度高度集中于200～300 bp,平均有效長度245 bp。將有效序列在97%的相似度水平下進行聚類,分別獲得有效真菌分類單元(OTU)1596個。其中果皮有真菌OTU 939個,果肉有真菌OTU 921個。

表1 采集樣品真菌檢測覆蓋率

表2 各樣本有效序列數據統計

由圖2可知,6個分組的全部OTU為1022個。其中,共有OTU為317個,占全部OTU的34.64%。SP_peel組特有的OTU數為46,占全部OTU的4.50%;SP_flesh組特有的OTU數為18,占全部OTU的1.76%;MP_peel組特有的OTU數為31,占全部OTU的3.03%;MP_flesh組特有的OTU數為48,占全部OTU的4.70%;CK_peel組特有的OTU數為68,占全部OTU的6.65%;CK_flesh組特有的OTU數為46,占全部OTU的4.50%。綜上可知,6個分組中真菌的共有菌較多,各組中特有菌占比均不高,其中CK_peel組特有菌數最多,說明健康果皮的特有真菌物種最豐富。

圖2 六組樣品中真菌韋恩圖Fig.2 Venn diagram on fungi identified in six sample groups

2.2 真菌類群多樣性變化分析

由表3可知,Chao指數對發病程度和果實部位均無明顯響應;Ace指數對發病程度無顯著響應,差異主要是由果實部位所決定,結合表4可知,果肉的Ace指數顯著高于果皮。由此推斷,果肉真菌的種類數高于果皮。

由表3可知,發病程度顯著影響了果皮和果肉中真菌群落的多樣性。由表4可知,染病后,果皮和果肉上真菌群落的Shannon和Shannon evenness指數均顯著降低。隨著染病程度的加重,果皮真菌的Shannon和Shannon evenness指數呈先降低后升高趨勢,果肉部位則隨著病情的加重呈持續降低趨勢。染病后,果皮和果肉上真菌群落的Simpson指數顯著升高,果肉部位隨著病情的加重而持續升高,果皮部位呈先升高后降低趨勢。

表3 發病程度和果實部位對油橄欖果實真菌群落多樣性指數的影響

表4 油橄欖果實真菌群落多樣性指數

以上結果表明,炭疽病感染顯著降低了油橄欖果真菌群落的多樣性,且其主要通過改變群落中個體數量在種間的分布來影響群落多樣性。感染炭疽病后,真菌群落種類豐富度指數變化不明顯,但優勢物種數量增加顯著,導致群落優勢度增加,均勻度下降,多樣性降低。另外,真菌群落多樣性在果皮和果肉的變化趨勢表現出差異,染病后期果皮真菌多樣性呈回升趨勢。

2.3 不同分類水平上真菌相對豐度的響應

樣品檢測出的真菌分屬于2門9綱17目21科25屬。其中,健康的果皮中有2門6綱12目11科12屬13種,患病果皮中有2門5綱7目7科8屬11種;健康果肉中有2門5綱10目12科13屬16種,患病果肉中有2門5綱10目7科4屬7種。各時期和各部位的優勢菌門均為子囊菌門(Ascomycota)。

由表5可知,排名前5的真菌類群均對發病程度有顯著響應。在不同分類水平上,對果實部位有顯著響應的包括門水平下的子囊菌門(Ascomycota)和擔子菌門(Basidiomycota),綱水平下的銀耳綱(Tremellomycetes),目水平下的座囊菌目(Dothideales)和煤炱目(Capnodiales),科水平下的短梗霉科(Aureobasidiaceae)、錐梗菌科(Dissoconiaceae),屬水平下的短梗霉屬(Aureobasidium)、烏氏霉屬(Uwebraunia),以及種水平下的黑酵母菌(AureobasidiumpullulansSH1515141.08FU)和UwebrauniaaustraliensisSH1930250.08FU。此外,除擲孢酵母屬(Sporobolomyces)及其下的Sporobolomycessymmetricus外,在門、綱、目、科、屬、種水平上排名前5的真菌類群均對發病程度與果實部位的交互作用具有顯著響應。表明炭疽病的發生顯著改變了真菌群落結構,且不同菌群在果皮、果肉的變化存在一定差異。

表5 不同分類水平上真菌相對豐度對發病程度和果實部位的響應

2.3.1 果皮真菌相對豐度對發病程度的響應 從門水平上看,在健康果實果皮上,子囊菌門占比84.71%,染病初期上升至94.93%,染病后期又下降至86.03%。與之相反,健康果皮中擔子菌門占比15.03%,染病初期下降為4.63%,染病后期增加至13.47%(圖3-A)。

從屬水平上看,健康果皮中排名前5的優勢菌屬分別是假尾孢屬(Pseudocercospora)、核盤菌屬(Sclerotinia)、烏氏霉屬、Symmetrospora、刺盤孢屬,占比分別為33.97%、16.74%、10.67%、10.62%、9.39%。發病后假尾孢屬和核盤菌屬占比均小于0.01%,說明炭疽病對其具有明顯的抑制作用。病原菌刺盤孢屬在健康果皮中占比僅為9.39%,在發病后相對豐度迅速升高,達到86.97%,但到發病后期,下降到70.02%。此外,在健康和初病油橄欖果果皮中占比均較少的Bisifusarium屬、漢納酵母屬(Hannaella)、鐮刀菌屬(Fusarium)真菌在染病后期數量大量增加,其相對豐度增長超過10倍(圖3-B)。

2.3.2 果肉真菌相對豐度對發病程度的響應 在果肉中,健康組子囊菌門占比89.85%,發病初期為91.09%,發病后期為97.41%,呈隨炭疽病加重而占比增加趨勢。而擔子菌門在健康果實果皮中占比9.67%,染病初期為8.46%,染病后期為2.14%,呈隨炭疽病加重而占比降低趨勢。此外,子囊菌門在各個時期均為占比約90%的優勢菌門(圖4-A)。

在屬水平上,健康果肉中排名前5的優勢菌屬分別是黑孢霉屬(Nigrospora)、短梗霉屬、刺盤孢屬、unclassified_Pleosporales屬、藍盤伯菌屬(Lambertella),占比分別為30.28%、21.13%、12.28%、7.10%、6.91%。發病后,黑孢霉屬占比小于0.50%,說明炭疽病對其有明顯的抑制作用。短梗霉屬占比也明顯降低,發病初期下降至10.6%,染病后期占比僅1.59%,下降92.47%。而刺盤孢屬在發病中期占比上升至72.31%,在發病后期占比增加至91.38%。說明炭疽病病原菌刺盤孢屬在發病后迅速成為絕對的優勢菌群。此外,在健康果肉中占比較少的假絲酵母菌屬(Candida)在發病初期增加最迅速,相對豐度增長超過30倍(圖4-B)。

2.4 真菌群落的LEfSe差異分析

采用LEfSe[21]分析具有統計學差異的生物標志物(Biomarker),不同樣本中的生物標志物通過線性判別分析效應大小,LDA score大于3.0的為顯著差異物種。分析結果(圖5)顯示,炭疽病感染降低了油橄欖果的標志真菌種類的數量,改變了標志真菌的種類。健康果皮的差異真菌有2綱5目7科9屬,染病初期、后期均僅有1綱1目1科1屬;健康果肉的差異真菌有3綱8目12科14屬,CK和SP處理也僅有1綱1目1科1屬。果皮上,健康果皮的差異指示菌屬為假尾孢屬和核盤菌屬在內的9個屬;MP處理的差異指示菌屬為刺盤孢屬,染病后期的差異指示菌屬則為漢納酵母屬;果肉上,健康果肉的差異指示菌屬為短梗霉屬和黑孢霉屬在內的14個屬,染病中期的差異指示菌屬為假絲酵母菌屬,染病后期的的差異指示菌屬為刺盤孢屬。

圖3 果皮真菌群落結構Fig.3 Structure of fungi community in peel

圖4 果肉真菌群落結構Fig.4 Structure of fungi community in flesh

2.5 真菌的營養結構分析

從表6可以看出,在果皮部位,各營養結構的真菌豐富度在不同患病期的數量呈4種變化趨勢。首先,除了兼共營養和腐生病理型、腐生共生型外,其余幾類真菌在健康果皮上的豐富度均與患病時存在顯著差異。其中,病理營養型、腐生病理型、腐生營養型CK均顯著高于SP和MP,共生病理型CK顯著低于SP和MP,而健康果皮上(CK)共生營養型真菌顯著低于患病后期(SP)但顯著高于患病初期(MP)。

在果肉部位,僅共生病理型真菌在患病后相對豐度顯著升高,CK顯著低于SP和MP。其余6類真菌的相對豐度在患病后均表現為顯著降低,CK顯著高于SP和MP。

圖5 基于LEfSe分析的各處理的指數物種Fig.5 Indicator species for each treatment based on LEfSe analysis

從以上結果可知,共生病理型是油橄欖果實感染炭疽病菌后的優勢菌群;除共生營養型真菌外,其他營養型的真菌在感染炭疽病后,果皮和果實部位的變化都較一致,患病后共生病理型真菌數量均呈上升趨勢,病理營養型、腐生營養型、兼共營養和腐生病理型、腐生營養型真菌均呈下降趨勢。

3 討 論

內生菌是植物與微生物長期協同進化形成的結構復雜并處于動態變化的功能體,廣泛存在于植物的根、莖、葉、花、果實、種子等各個器官中,對植物的生長、繁殖和健康發揮著重要作用[22-24]。本研究通過高通量測序手段研究了炭疽病感染對油橄欖果實內生真菌群落的影響。結果表明,油橄欖果感染炭疽病后,真菌群落多樣性顯著降低。這與預期及已有的諸多研究結果相似,已有的研究表明,植物染病后,病原菌的侵染往往會打破植物體內微生物群原有的穩態結構[22]。彭芳芳等[25]對桑果內生菌的研究發現,感染菌核病的桑果,其果實內生真菌多樣性遠小于健康果實。與之相似,劉曉菲等[26]對黃龍病罹病柑橘葉片的研究,以及謝憲等[27]對感染枯梢病赤松針葉的研究,也證實病原菌侵染會降低植物內生真菌群落的多樣性。這可能是因為病原菌的大量繁殖,一方面改變了內生真菌的生態環境,使之不利于原有菌群的生長,另一方面大量的病原菌通過競爭空間、資源或分泌有害物質,抑制原生真菌的生長。金勤[28]研究指出,炭疽病主要通過產生侵入釘侵入寄主細胞,侵入后從表皮細胞逐漸擴展到柵欄組織,然后進入到海綿組織中,逐漸殺死周圍細胞。本研究結果顯示,炭疽病病原菌的擴張是導致油橄欖果真菌群落多樣性降低的重要因素。多樣性和豐富度指數的變化也顯示,染病后油橄欖果中真菌種類數量相對穩定,但是優勢菌群數量擴張,顯著抑制了其他菌群的生長,改變了群落內部結構,導致真菌群落的多樣性顯著降低,而最大的優勢菌群則是炭疽病病原菌。各分類水平上各菌群相對豐度的分析結果進一步證實了這一觀點。在門水平上,果皮和果肉的優勢菌門在各個時期都為子囊菌門,在屬水平上,染病后刺盤孢屬迅速成為絕對的優勢菌群,占比始終高于70%。

表6 各處理真菌的營養結構差異

植物抗病性與植物內生真菌多樣性、群落結構息息相關。生態系統微生物群落多樣性越低,植株抵抗病原菌侵害的能力越低[29-31]。感染炭疽病后油橄欖果真菌多樣性降低,暗示其抗病能力可能降低。而研究結果顯示,油橄欖果感染炭疽病后期,除了炭疽病病原菌,果皮中其它病原菌菌屬,如Bisifusarium屬、漢納酵母屬、鐮刀菌屬在重病時期也明顯增加。這一結果說明,炭疽病發病后期,油橄欖果可能會并發多種病害。姜莉莉等[32]對染病“香玲”核桃果的研究也發現類似現象。感染炭疽病后,核桃果中其他病原菌,如赤霉菌屬、葡萄座腔菌屬(干腐病菌)等病原菌的相對豐度也明顯提高。由此可見,炭疽病防治不僅要防治炭疽病,還要全面考慮其他病原菌的發生情況,進行綜合防治。

本研究還發現,在炭疽病侵染過程中,油橄欖果皮、果實真菌群落多樣性變化趨勢呈現差異性。果皮真菌群落的多樣性在染病后期有所回升,這可能是由于果皮啟動了對病菌的防御機制。已有的研究發現[7,33],感染炭疽病后,植物果皮中抗真菌二烯、酚類物質等濃度升高,可有效抑制炭疽病病原菌的生長。此外,植物內生菌中有一些是天然的生防菌,能抑制病原菌的生長,并且在與病原菌共處的過程中種群及其抗菌能力得到強化[30-32]。本研究中,染病后期果皮上共生營養型真菌數量顯著回升,且顯著高于健康果實,雙胞雙鐮孢(Bisifusariumdimerum)、Peniophorarufomarginata、Fusicollaviolacea這些共生營養型真菌有可能就是油橄欖果潛在的抗炭疽病生防菌。其中Fusicollaviolacea被研究證明對引發獼猴桃軟腐病的交鏈孢霉屬具有拮抗作用,有一定生防效果[34]。

本研究中,部分真菌對炭疽病感染較敏感。果皮中假尾孢屬和核盤菌屬對炭疽病病原菌的響應最明顯,為炭疽病病原菌敏感菌。LEFse分析結果顯示,假尾孢屬和核盤菌屬為健康果皮差異的指示菌群。在果肉中,發病后黑孢霉屬和短梗霉屬兩種優勢菌屬均明顯降低,LEFse分析結果顯示它們為健康果肉中的指示菌群之一。由此可見,假尾孢屬和核盤菌屬可作為油橄欖果炭疽病感染早期的指示菌,黑孢霉屬和短梗霉屬則可作為炭疽病病原菌入侵果肉的指示菌群。

4 結 論

本研究采用高通量測序技術,分析了感染炭疽病對油橄欖果真菌群落結構的影響。研究得出:①炭疽病感染顯著改變了油橄欖果果皮和果實中真菌群落的結構。感染炭疽病后,油橄欖果真菌豐富度指數變化不顯著,但各分類水平上各類群間的相對豐富度明顯改變,群落的多樣性顯著降低,表明感染炭疽病后,由于病原菌數量的增長,改變了菌群間個體數量的分布,降低了真菌群落多樣性;②果皮中的假尾孢屬和核盤菌屬,果肉中的黑孢霉屬和短梗霉屬為炭疽病病原菌敏感菌,可作為油橄欖果炭疽病感染早期的指示菌;③染病后期果皮上共生營養型真菌數量顯著回升,可能是抗炭疽病生防菌菌群來源,可作進一步篩選;④油橄欖果感染炭疽病后期,除了炭疽病病原菌,果皮中其它病原菌菌屬,如Bisifusarium屬、漢納酵母屬、鐮刀菌屬在重病時期也明顯增加,提示炭疽病防治需要針對這些菌群進行綜合防治。