不同茶樹品種新梢氮磷鉀含量與根際土壤細菌群落多樣性差異

孔垂思,李友勇,孫云南,尚衛瓊,劉本英,楊 濤

(1.云南省農業科學院農業環境資源研究所,昆明 650205;2.云南省茶學重點實驗室/云南省農業科學院茶葉研究所,云南 勐海 666201;3.云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所,昆明 650205)

【研究意義】茶樹是中國重要的經濟作物,云南是中國茶樹資源最豐富的遺傳多樣性中心[1],氮、磷、鉀是植物生長需求量較大的礦質元素,是植物光合作用順利進行的物質基礎[2],作為葉用植物,氮、磷、鉀是茶樹的主要營養物質,土壤是茶樹生長的保障,良好的土壤肥力是茶葉產量和品質的基礎。因此,揭示高氮磷鉀含量的不同品種茶樹土壤細菌群落多樣性形成機制,優化茶樹種植技術,對茶產業的發展具有重要作用?！厩叭搜芯窟M展】植物生長調節劑能提高茶新梢的光合效率[3-4],遮蔭網構建的微氣候、葉面肥噴施、增施有機肥等措施能增加茶新梢的產量和品質[5-7]。同時不同采摘標準對茶新梢的產量和品質影響較大[8],適量增施氮肥、遮蔭及有機肥均可提升茶新梢的香味品質[9-10]。良好的根際微生態環境可以提升茶葉的產量和品質[11-13]。氮是茶樹需求量最大的營養元素,缺氮時茶樹干物質含量下降,缺磷會影響茶樹根莖葉營養元素的含量及其分配[14];缺鉀會導致茶樹根莖葉重量減少,根冠比增加[15]。研究表明,茶園土壤有機質、有效養分含量降低,會改變茶樹體內營養元素的平衡,導致碳含量增高,而氮、鉀、鎂、硫、鐵和鋅等礦質營養元素含量降低,繼而降低茶葉產量和品質[16]。近年來,茶樹相關研究主要集中在茶樹土壤有機質、茶樹土壤酸化、茶樹土壤微生物、茶樹土壤質量評價等方面[17-19]?！颈狙芯壳腥朦c】目前針對高養分含量不同品種茶樹的根際細菌群落結構多樣性的研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】選擇云南省西雙版納茶產區為主的代表性茶園,以不同茶樹品種為材料,綜合運用植物營養、土壤化學、分子生物學等技術,分析高養分含量不同品種茶樹與常規型茶樹土壤養分及其細菌群落結構多樣性的差異,闡明高養分含量茶樹根際土壤細菌群落多樣性的形成機制,為茶葉有機種植生產提供科學依據和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于云南省西雙版納州勐?？h云南省農業科學院茶葉研究所試驗基地,海拔1160 m,100°27′4.3″ E,21°57′35.6″ N,該區域屬于熱帶、亞熱帶西南季風氣候,茶葉種植土壤為磚紅壤,土壤理化性質為有機質48.34 g/kg,全氮1.84 g/kg,全磷0.74 g/kg,全鉀5.21 g/kg,水解性氮155.87 mg/kg,有效磷18.39 mg/kg,速效鉀101.01 mg/kg。

1.2 供試材料

供試材料為云南省西雙版納州勐?？h主栽茶樹品種,在勐?；夭鑸@選擇規模較大、種植多年的茶樹且種植成片的品種為研究材料,主要茶樹品種為云抗10號(MY)、紫娟(MZG)、佛香3號(MF)、大坪大葉茶(MD),均按照當地田間管理進行相同管理。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品采集及處理 在200 m2茶園內取4種茶樹1芽2葉的新梢,每種茶樹取100株混合為1個樣品,3個重復,干燥后用于測定新梢的氮磷鉀含量,同時通過5點取樣法,在對應的茶樹根際土壤深15 cm處,取1.1 kg土樣,每個土樣分為2份,其中一份1 kg,用于測定土壤pH、有機質、全氮、全磷、全鉀、水解性氮、有效磷、速效鉀8個土壤理化指標;另一份0.1 kg,放在-80 ℃冰箱保存,用于測定根際土壤細菌群落多樣性。

1.3.2 土壤理化性質測定 按照常規方法進行土壤理化指標檢測[20],土壤pH利用玻璃電極法檢測,土壤有機質利用硫酸-重鉻酸鉀容量法檢測,土壤全氮利用凱氏定氮法檢測,土壤全磷利用鉬銻抗比色法檢測,土壤全鉀利用火焰光度法檢測,土壤水解性氮利用堿解擴散法檢測,土壤有效磷利用分光光度法檢測,土壤速效鉀利用火焰光度法檢測。

1.3.3 土壤根際細菌群落多樣性的16S rDNA高通量分析測定 每個樣品稱取土樣0.5 g,使用Fast DNA SPIN Kit For Soil (MP Biomedicals,LLC)試劑盒提取基因組DNA,并通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質量,條帶清晰、完整的可直接用于后續試驗。50 μL PCR反應體系:2 μL模板DNA、2 μL正向引物(10 μmol/L)、2 μL反向引物(10 μmol/L)、4 μL dNTPs (2.5 μmol/L)、5 μL 10×Pyrobest緩沖液、0.3 μL Pyrobest DNA聚合酶和34.7 μL ddH2O。細菌16S的PCR擴增反應引物為16S:F:(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和R:(5′-GG ACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。利用電泳檢測PCR產物。

按照基因組DNA文庫制備程序,將匯集的DNA產物構建配對末端文庫,在Illumina MiSeq平臺測序,測序讀長為PE250。

1.4 數據統計與分析

對根際土壤細菌多樣性原始測序序列進行質控,包括低質量過濾、長度過濾,得到高質量序列進行聚類,劃分OTUs/ASVs(后面統一稱之為Feature),根據Feature序列組成特征得到其物種分類結果,獲得各樣品在分類學水平上的群落結構圖,并通過Alpha多樣性分析,研究樣品的Ace、Chao、Shannon及Simpson指數[21]。把不同品種茶樹新梢氮磷鉀含量、根際土壤理化性質、根際土壤細菌群落作為變量,用軟件SPSS 23.0對茶樹新梢氮磷鉀含量、根際土壤養分、根際土壤細菌群落進行相關性分析。

2 結果與分析

2.1 不同茶樹品種新梢氮磷鉀差異分析

由表1可知,不同茶樹品種新梢氮含量最高的是大坪大葉茶(MD),為4.13%;最低的是云抗10號(MY),為3.77%,不同茶樹品種新梢氮含量差異顯著。不同茶樹品種新梢磷含量最高的是佛香3號(MF),為0.40%,與其它3個茶樹品種達到顯著差異,但3個茶樹品種間差異不顯著。不同茶樹品種新梢鉀含量最高的是紫娟(MZG),為2.78%;最低的是佛香3號,為1.96%,不同茶樹品種新梢鉀含量差異顯著。

表1 不同茶樹品種新梢氮磷鉀含量的LSD分析

2.2 不同茶樹品種根際土壤養分差異分析

由表2可知,不同茶樹品種中,氮含量高的茶樹品種MD根際土壤的pH、有機質、全氮、水解性氮含量均較高,分別為5.17、68.50 g/kg、2.83 g/kg、241.33 mg/kg,高于其他茶樹品種。磷含量高的品種MF根際土壤的全磷、有效磷含量均較高,分別為1.63 g/kg、115.67 mg/kg,高于其他品種茶樹。鉀含量高的品種MZG根際土壤的全鉀、速效鉀含量較高,分別為5.20 g/kg、122.00 mg/kg。

表2 不同茶樹品種根際土壤養分的LSD分析

續表2 Continued table 2

2.3 不同茶樹品種根際土壤細菌群落多樣性

針對不同茶樹品種根際土壤樣品細菌進行16S rDNA高通量測序,共得到340 391條序列,過濾去除嵌合體后,得到339 219條序列,序列長度以351～474 bp為主,其中氮含量高的茶樹品種MD獲得的序列最多,為 75 631條;品種MY獲得序列最少,為64 975條。

如圖1所示,不同茶樹品種根際土壤細菌的Shannon指數呈水平狀態,說明增加測序量,土壤樣本細菌的多樣性趨于穩定,能反映茶樹根際土壤細菌群落多樣性水平。不同茶樹品種中,含氮量高的茶樹品種MD根際土壤Shannon指數最高,說明其細菌群落多樣性水平最高。Simpson 指數分析(圖2)表明,氮含量高的茶樹品種MD根際土壤的Simpson 指數最低;與Shannon指數相反,Simpson 指數最低代表有高的細菌群落多樣性,表明氮含量高的茶樹根際土壤具有高的細菌群落多樣性。如圖3所示,不同茶樹品種中,鉀含量高的茶樹品種MZG根際土壤的Ace與Chao1 指數趨勢相同,其Ace及Chao1指數最高,分別為 1141、1168,表明鉀含量高的茶樹根際土壤具有高細菌群落豐富度。

圖1 不同茶樹品種根際土壤細菌香農指數Fig.1 Shannon index of bacteria in rhizosphere soil of different tea tree varieties

圖2 不同茶樹品種根際土壤細菌辛普森指數Fig.2 Simpson index of bacteria in rhizosphere soil of different tea tree varieties

圖3 不同茶樹品種土壤細菌豐富度比較Fig.3 Comparison of bacteria abundance in rhizosphere soil of different tea tree varieties

2.4 不同茶樹品種根際土壤細菌群落結構差異

如圖4所示,不同茶樹品種根際土壤細菌門水平群落結構基本相同,所有根際土壤主要含變形桿菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、Candidate_division_WPS-2、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、厚壁菌門(Firmicutes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、藍藻門(Cyanobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、浮霉菌門(Planctomycetes)等。優勢細菌類群有變形桿菌門(占比22.32%～39.95%)、酸桿菌門(占比21.15%～36.68%)、放線菌門(占比13.19%～19.10%)、綠彎菌門(占比0.75%～4.05%)、疣微菌門(占比0.61%～4.10%)、擬桿菌門(占比0.50%～4.82%)、芽單胞菌門(占比0.51%～3.17%)、浮霉菌門(占比0.50%～3.21%)、Candidate_division_WPS-2(占比0.37%～2.03%);厚壁菌門(占比0.53%～1.12%);藍藻門(占比0.11%～2.17%);以上優勢細菌類群占總相對豐度的71.14%～89.53%。不同茶樹品種中,氮含量高的茶樹品種MD根際土壤中變形桿菌門、放線菌門、疣微菌門、擬桿菌門、芽單胞菌門、浮霉菌門的相對豐度較高。磷含量高的茶樹品種MF根際土壤中放線菌門、厚壁菌門、藍藻門的相對豐度較高。鉀含量高的茶樹品種MZG根際土壤變形桿菌門、放線菌門、綠彎菌門、浮霉菌門、厚壁菌門的相對豐度較高。

圖4 不同茶樹品種根際土壤細菌群落(門水平)Fig.4 The bacterial community in rhizosphere soil of different tea tree varieties (at phylum level)

2.5 茶樹新梢氮磷鉀含量與根際土壤養分的相關性分析

由表3可知,茶樹新梢氮含量與根際土壤pH、有機質的相關系數分別為0.706、0.825,呈顯著正相關。茶樹新梢磷與根際土壤有效磷的相關系數為0.962,呈顯著正相關。新梢鉀含量與根際土壤全鉀、速效鉀的相關系數分別為0.965、0.852,均呈顯著正相關。

表3 茶樹新梢氮磷鉀含量與根際土壤養分的相關性分析

2.6 茶樹新梢氮磷鉀含量與根際土壤細菌群落相關性分析

由表4可知,茶樹根際土壤變形桿菌門與新梢鉀含量的相關系數為0.798,呈顯著正相關。放線菌門與新梢磷含量的相關系數為0.995,呈極顯著正相關。綠彎菌門與新梢氮含量的相關系數為0.843,呈顯著正相關。浮霉菌門與新梢磷含量的相關系數為0.720,呈顯著正相關。厚壁菌門與新梢磷含量的相關系數為0.916,呈顯著正相關。藍藻門與新梢磷含量的相關系數為0.860,呈顯著正相關。

表4 茶樹新梢氮磷鉀含量與根際土壤細菌群落相關性分析

續表4 Continued table 4

2.7 茶樹根際土壤養分與根際土壤細菌群落相關性分析

由表5可知,茶樹根際土壤變形桿菌門與根際土壤速效鉀含量呈顯著正相關,相關系數為0.678,放線菌門與根際土壤有效磷呈顯著正相關,相關系數為0.616,綠彎菌門與pH、有機質、水解性氮呈顯著正相關,相關系數分別為0.707、0.887、0.852,浮霉菌門與根際土壤速效鉀含量呈顯著正相關,相關系數為0.725,厚壁菌門與根際土壤有效磷含量呈顯著正相關,相關系數為0.692,藍藻門與根際土壤有效磷含量呈顯著正相關,相關系數為0.525。

表5 茶樹根際土壤養分與細菌群落相關性分析

3 討 論

茶樹生長特性被認為是茶園土壤酸化形成的原因之一[22]。本研究結果表明,不同茶樹品種新梢氮磷鉀含量達到顯著差異。不同茶樹品種根際土壤養分含量存在差異,土壤pH、有機質、全鉀、有效磷、速效鉀是造成茶樹養分差異的重要土壤因子,羅凡等[23]研究也表明,不同茶樹品種新梢氮磷鉀含量差異較大。

根際土壤pH、有機質、水解性氮、有效磷、速效鉀含量是對細菌群落結構影響較大的環境因子,不同種類細菌群落結構存在差異。不同茶樹品種既有與土壤酸度呈顯著正相關的細菌,也有與土壤酸度呈顯著負相關的細菌[24]。茶園土壤微生物主要以酸桿菌為主[25]。土壤氮及水解性氮是影響茶園土壤細菌多樣性的主要環境因子[26],本研究表明,不同茶樹品種根際土壤速效鉀含量是影響變形桿菌門相對豐度的因素之一;根際土壤有效磷含量是影響放線菌門相對豐度的因素之一;根際土壤pH、有機質、水解性氮含量是影響綠彎菌門相對豐度的因素之一;根際土壤速效鉀含量是影響浮霉菌門相對豐度的因素之一;根際土壤有效磷含量是影響厚壁菌門相對豐度的因素之一;根際土壤有效磷含量是影響藍藻門相對豐度的因素之一。

細菌群落豐富度、細菌群落多樣性是不同茶樹品種養分差異形成的重要環境因子。研究表明,不同茶樹品種根際土壤細菌、優勢菌群以變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門等為主[26],而本研究認為,變形桿菌門、放線菌門、綠彎菌門、浮霉菌門、厚壁菌門、藍藻門是不同茶樹品種養分差異的主要土壤微生物因子。不同茶樹品種中,鉀含量高的茶樹根際土壤具有較高群落豐富度,且其根際土壤中變形桿菌門、浮霉菌門的相對豐度較高,主要是由于具有較高的土壤速效鉀含量。說明提高根際土壤速效鉀含量,可提高土壤中變形桿菌門、浮霉菌門的相對豐度,從而提高了茶樹鉀含量。不同茶樹品種中,磷含量高的茶樹根際土壤中放線菌門、厚壁菌門、藍藻門的相對豐度較高,主要是由于較高的土壤有效磷含量。說明通過提高根際土壤有效磷含量可提高根際土壤中放線菌門、厚壁菌門、藍藻門的相對豐度,從而提高茶樹磷含量。

不同茶樹品種中,氮含量高的茶樹根際土壤具有較高的細菌群落多樣性,且其根際土壤中綠彎菌門的相對豐度較高,主要是因其具有較高的土壤pH、有機質和水解性氮含量。土壤pH、水解性氮是影響茶園土壤細菌多樣性的主要環境因子[24-26],通過根際土壤pH、有機質、水解性氮含量的提高,提高根際土壤中綠彎菌門的相對豐度,從而提高茶樹氮含量。pH較高的石灰巖土壤栽培茶樹,有利于其新梢的生長發育、促進葉綠素的合成,提高其新梢光合能力[28]。施用有機肥能明顯提高土壤有機質含量,減小土壤容重,同時有減緩土壤酸化趨勢,明顯提升茶園土壤質量[29]。有研究表明,茶樹土壤的有機質與水解性氮含量呈極顯著正相關[30]。適當增加氮肥的施用能提高根際土壤的細菌、放線菌、真菌數量,增加根際微生物數量,改善根際微生物群落多樣性水平[31]。

4 結 論

不同茶樹品種新梢氮磷鉀含量存在差異,其根際土壤養分含量也存在差異,在不同茶樹品種中,新梢氮磷鉀含量高的茶樹根際土壤pH、有機質、全鉀、有效磷、速效鉀的含量較高,進而其細菌群落豐富度、細菌群落多樣性較大。在不同茶樹品種中,高養分含量茶樹根際土壤中變形桿菌門、放線菌門、綠彎菌門、浮霉菌門、厚壁菌門、藍藻門的細菌群落相對豐度較高。