雙果糖酐水解酶分子改造提升酶活性研究

徐寒冰，郁書懷

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

菊粉(菊糖)是自然界中資源豐富的功能性低聚果糖，主要存在于菊科類植物中，具有改善腸道微生態，促進益生菌增殖，調節血糖、血脂，改善便秘，促進礦物質的吸收以及減少患癌風險等功能，在乳制品、面制品、肉制品加工中有廣泛的應用[1]。菊糖有多條代謝途徑，其中一條途徑是利用菊粉外切酶將菊粉分解為果糖[2]，利用菊粉內切酶將菊糖降解為菊粉型低聚果糖[3]。菊粉型低聚果糖是不同聚合度的低聚果糖的混合物，如菊二糖(果果二糖)、菊三糖(果果三糖)、菊四糖(果果四糖)、菊五糖(果果五糖)、蔗果三糖、蔗果四糖和少量果糖，可發揮益生元作用，可較好地改善妊娠期的糖脂代謝，促進礦物質吸收，調節體內菌群平衡以及增強機體免疫力[3-6]。另一條途徑是利用菊糖果糖轉移酶(inulin fructotransferase，IFTase)降解菊糖為雙果糖酐(difructose anhydride, DFA)，菊糖可被三型菊糖果糖轉移酶(DFA-Ⅲ-forming inulin fructotransferase, IFTase-Ⅲ，EC 4.2.2.18)和一型菊糖果糖轉移酶(DFA-I-forming inulin fructotransferase, IFTase-Ⅰ，EC 4.2.2.17)分別酶解為三型雙果糖酐DFA-Ⅲ和一型雙果糖酐DFA-Ⅰ[7-8]。DFA-Ⅲ是一種功能性甜味劑，能量低，可以促進礦物質的吸收，降低膽固醇，抗齲齒，增殖有益菌[9]。DFA-Ⅲ可被DFA-Ⅲase進一步水解為菊二糖。菊糖這2條代謝途徑都生成了菊二糖，其中菊糖、菊粉型低聚果糖和DFA-Ⅲ都具有特殊的功能，菊二糖卻沒有相關研究報道。另外，對低聚果糖的研究，多是直接研究混合糖的作用，沒有分離出單一的糖，不能確定是哪種成分起作用，或是多種糖起協同作用。這主要由于酶法制備的低聚果糖為多種成分的混合體，其單一成分難以實現規?；铣梢约凹兓?。

基于低聚果糖的生理功效，菊二糖也被推測為一種具有特殊功能的糖。然而菊二糖的產量很低，這限制了菊二糖相關性質的研究。天然菊二糖存在于牛蒡等植物的根莖和香蕉等水果內[10-11]，但是量很少，且與其他糖分離困難。酶法生產菊二糖有較大潛力，蔗糖轉化酶催化的蔗糖轉糖基反應中，不僅生成了果糖和葡萄糖，同時還生成了菊二糖、1-蔗果三糖、6-蔗果三糖、新蔗果三糖，但是果糖和葡萄糖是主要產物[12]。菊粉酶和DFA-Ⅲase也能催化獲得菊二糖。菊粉酶水解菊粉得到的低聚果糖，主要成分為菊三糖、菊四糖，而菊二糖相對較少[3,13]。DFA-Ⅲase能夠水解DFA-Ⅲ獲得單一的菊二糖，無其他副產物產生，因此，DFA-Ⅲase在合成菊二糖方面有望成為一種關鍵酶。1975年，具有水解DFA-Ⅲ功能的酶首次從Arthrobacterureafaciens中被鑒定出來[14]。1997年，DFA-Ⅲase在Arthrobactersp. H65-7中被分離純化出，該酶在pH 4.5，60 ℃時轉化DFA-Ⅲ為菊二糖的活性最高，同時該酶具有可逆催化功能，即催化菊二糖轉化為DFA-Ⅲ[15]。SAITO等[16]實現了DFA-Ⅲase基因在大腸桿菌(Escherichiacoli)中的異源表達。YU等[17]從ArthrobacteraurescensSK8.001中獲得了DFA-Ⅲase編碼基因，并將其在大腸桿菌中克隆和表達，開啟了國內有關DFA-Ⅲase的研究。通過凝膠過濾和SDS-PAGE結果，得知該酶是一種同源三聚體，其單亞基相對分子質量和全相對分子質量分別為49 kDa和145 kDa，酶的活性中心位于亞基與亞基的裂縫之間，在pH 5.5，55 ℃時催化DFA-Ⅲ的活性最高。郁書懷[18]鑒定出了ArthrobacterchlorophenolicusA6中的DFA-Ⅲase，該酶是首個被報道能同時降解菊糖為DFA-Ⅲ，并催化DFA-Ⅲ水解為菊二糖的酶，即該酶具有連續催化性，其晶體結構也被首次解析出。關于DFA-Ⅲase的研究目前仍然較少，且活性都較低，因此，獲得活性高、專一性強的DFA-Ⅲase對于菊二糖的研究至關重要。

本研究對來源于A.chlorophenolicusA6的AcDFA-Ⅲase進行分子改造，以期得到酶活性提高的突變體。由于設計的突變體數量較多，一一純化測定酶活性，將十分耗時繁瑣。糖分析方法主要有色譜法、比色法和滴定法等[19]。色譜法準確，但是耗時，滴定法不適用于大批量樣品的測定。比色法利用紫外-可見分光光度法和標準曲線進行定量分析，有苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法和3，5-二硝基水楊酸(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)法，前2種方法利用濃硫酸將多糖水解為單糖并脫水生成糖醛，再和苯酚/蒽酮生成有色化合物，利用分光光度計測量[19]。DNS法的原理是還原糖在堿性條件下與DNS反應生成紅棕色化合物，且顏色深淺在一定范圍內與還原糖的量成正比，準確性高，重復性好，被廣泛使用[20-21]。菊二糖作為一種還原糖[14]，可利用DNS法檢測。另外，高通量篩選技術可大大提高篩選效率[22-23]，所以本研究采用96孔板進行高通量培養，配合DNS法快速檢測酶活性，篩選高酶活性的突變體，以期為DFA-Ⅲase突變體文庫的快速篩選，菊二糖的大量生產、性質研究以及菊糖這一代謝途徑的補充奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒

大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE3)、EscherichiacoliDH5α，生工生物工程(上海)股份有限公司、含ArthrobacterchlorophenolicusA6來源的DFA-Ⅲase基因的重組質粒pET22b-AcDFA-Ⅲase由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，保藏在本實驗室。

1.1.2 工具酶

PrimeSTAR HS DNA Polymerase高保真酶和DpnⅠ消化酶，TaKaRa公司。

1.1.3 培養基與主要試劑配制

LB培養基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，調整pH至7.0，固體培養基在此基礎上加入20 g/L瓊脂粉，121 ℃高壓滅菌20 min。液體培養基中加入氨芐青霉素至50 μg/mL，固體培養基中添加至100 μg/mL。配好的液體培養基于室溫存放，平板置于4 ℃冰箱存放。

純化所用緩沖液參考文獻[18]的配制方法。Binding buffer：500 mmol/L NaCl、50 mmol/L NaH2PO4和50 mmol/L Na2HPO4，pH 7.4；Wash buffer：在Binding buffer基礎上添加50 mmol/L的咪唑，用于洗除雜蛋白；Elution buffer：在Binding buffer基礎上添加200 mmol/L咪唑，用于洗脫結合在柱子上的目的蛋白；酶透析液Ⅰ:Binding buffer中不添加NaCl和咪唑但添加10 mmol/L EDTA，用于去除蛋白溶液中的高濃度鹽分和金屬離子；酶透析液Ⅱ：在透析液I的基礎上不添加EDTA，目的是進一步去除溶液中的鹽分、金屬離子以及EDTA。

DNS試劑：18.2 g酒石酸鉀鈉溶解于50 mL去離子水中，趁熱加入0.63 g DNS，2.1 g NaOH和0.5 g苯酚，攪拌至溶解，冷卻后定容至100 mL，貯于棕色瓶中，室溫保存，放置1周后使用。

1.1.4 主要儀器

ProFlex PCR儀，美國賽默飛公司；Nano-300微量分光光度計，杭州奧盛公司；酶標儀，南京拜爾沃公司；電泳儀，美國BIO-RAD公司；4600SF凝膠成像儀，上海天能公司；GL-21MS離心機，盧湘儀離心機儀器有限公司；臺式搖床，上海知楚儀器公司；超聲波細胞粉碎機-粗頻變桿，南京非奇經貿。

1.2 實驗方法

1.2.1 突變體的構建

基于AcDFA-Ⅲase生物信息學分析、晶體結構，理性設計突變位點?；贏cDFA-Ⅲase基因序列設計含有突變氨基酸的PCR引物，序列見表1，其中C387A是重復本課題組之前的工作[18]。

表1 定點突變所用引物Table 1 Primers for site-directed mutagenesis

以重組質粒pET22b-AcDFA-Ⅲase為模板，通過重疊延伸PCR引進突變。PCR體系：5×PrimeSTAR Buffer 10 μL，dNTP Mixture 4 μL，引物各100 pmol，模板10 ng，DNA聚合酶0.5 μL，加入滅菌水至50 μL。反應條件：98 ℃預變性3 min，98 ℃變性10 s；55 ℃退火5 s，72 ℃延伸6.5 min；72 ℃延伸10 min。PCR產物用DpnI酶消化質粒模板，消化產物轉化E.coliDH5α感受態，涂布于含有氨芐青霉素的抗性平板上，過夜培養后挑取單菌落送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序成功后返回質粒，轉化至E.coliBL21(DE3)感受態細胞中，涂布于抗性平板，37 ℃過夜培養得到重組菌。

1.2.2 高通量孔板初篩

在已滅菌的超凈工作臺中，用移液排槍將LB培養基分裝于已滅菌96深孔板，每孔分裝600 μL。用滅菌槍頭/牙簽挑取單菌落轉至深孔板中，用已滅菌的紗布或96孔板硅膠蓋封住深孔板。將96孔板固定在搖床上，37 ℃、900 r/min培養過夜。按2%(體積分數)接種量轉接至裝有600 μL LB培養基的96深孔板，37 ℃、900 r/min培養至OD600為0.6～0.8，向孔板中添加終濃度為1 mmol/L的IPTG，于28 ℃低溫誘導6 h。發酵結束后，對深孔板進行離心，向其中加入200 μL溶菌酶(750 g/L)進行破碎，并加入400 μL磷酸鹽緩沖液進行稀釋。使用DNS法測定酶活性，直接在96孔板中進行反應，用酶標儀批量測定540 nm下的吸光值，DNS法測酶活性時，酶活性定義為pH 6.5，55 ℃條件下，1 min生成1 μg葡萄糖還原當量的還原糖所需酶量為1個酶活性單位。

1.2.3 搖瓶復篩驗證

將初篩得到的酶活性提高的突變體菌株接種于10 mL含氨芐青霉素抗性的LB液體培養基中，37 ℃、200 r/min條件下培養過夜后，按2%接種量轉接至200 mL含氨芐青霉素抗性的LB液體培養基中，37 ℃、200 r/min條件下，培養至OD600達0.6～0.8時，加入IPTG(終濃度為1 mmol/L)，置于28 ℃搖床中培養6 h，在4 ℃、10 000 r/min下離心15 min收集細胞，用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4，50 mmol/L)洗滌并懸浮，在冰水浴的條件下用超聲波破碎儀破碎細胞(300 W，開1 s，停2 s，破碎10 min)，破碎液在冰水浴中離心15 min，取上清液用于后續的蛋白純化。蛋白純化采用Ni-NTA柱親和層析法，用不同濃度的咪唑進行洗脫，收集各部分洗脫液。收集液進行SDS-PAGE，驗證純度。得到純酶后，用HPLC法進行酶活性測定。

1.2.4 酶學性質測定

酶活性測定：酶促反應體系1 mL包括10 g/L DFA-Ⅲ、100 nmol/L純酶液、50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.5)，反應溫度55 ℃，反應時間10 min。沸水浴滅酶活性后，10 000 r/min離心10 min，上清液過膜后進行HPLC檢測。色譜柱：NH2P-50 4E氨基柱；流動相：65%乙腈；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測器：示差折光檢測器。HPLC法測定時的酶活性定義為在pH 6.5，55 ℃條件下，1 min生成1 μmol菊二糖所需的酶量為1個酶活性單位。

最適溫度：分別在30～80 ℃(間隔5 ℃)下測定酶活性，把最適溫度下的酶活性定義為100%，計算其他溫度下的相對酶活性。

最適pH：通過檸檬酸鈉鹽緩沖液(pH 5.0～6.5)、磷酸鹽緩沖液(pH 6.5～7.0)、Tris-HCl緩沖液(pH 7.0～8.0)配制10 g/L的DFA-Ⅲ底物，在最適溫度條件下反應后測酶活性，把最適pH下的酶活性定為100%，計算其他pH下的相對酶活性。

動力學研究：100 nmol/L的純酶液與2.0～50 mmol/L的DFA-Ⅲ在pH 6.5、55 ℃時反應10 min。反應后測定酶活性，根據雙倒數法或者非線性擬合方法計算動力學參數。

1.2.5 D380A同源建模

將D380A氨基酸序列提交至SWISS-MODEL在線蛋白質模型構建服務器(http://www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL.html)進行同源建模，模式選定為自動構建模式。選定AcDFA-Ⅲase晶體結構(PDB ID：5ZKS)作為模板進行三聚體結構的構建，模型的立體化學質量主要是通過Wincoot軟件的拉氏構象圖來判定，而原子模型(3D)和氨基酸序列(1D)兼容性的合理性是通過ASVES服務器的VERIFY-3D模塊進行判定(http://services.mbi.ucla.edu/SAVES/)。最后使用可視化軟件PyMOL對模擬結構進行展示和分析。

2 結果與討論

2.1 突變位點的選擇

AcDFA-Ⅲase的晶體結構已經被解析出(PDB ID：5ZKS)，AcDFA-Ⅲase和底物雙果糖酐復合物的結構也被解析出(PDB ID：5ZKU)，AcDFA-Ⅲase是1個同源三聚體，活性口袋位于2個相鄰亞基形成的裂縫中，口袋中心的活性殘基分為親水和疏水殘基兩部分，親水殘基有Ser84、Tyr163、Glu210、Arg258、Gln391、Asp177、Asp199、Gln222、Phe80、Ile85、Phe256以及Trp309?；钚钥诖戏酱嬖?個具有重要調控作用的loop環(將其稱為活性口袋上方的蓋子，區域為Asp378～Asp402)[18]，loop區是蛋白最柔性部分，保守性低，選擇這個區域的氨基酸殘基可以避免改變酶蛋白的保守結構，而且活性中心以及蓋子周圍的氨基酸殘基對催化起重要作用[24-25]。所以最終選擇了這些區域的關鍵位點進行理性設計，例如Ala209位點是關鍵催化位點Glu210附近的殘基，Ser82在活性口袋里，以及Thr310在活性口袋且與蓋子交界處，Val379、Asp380、Ala381、Phe388、Ala397處于蓋子區域，改變這些位點的殘基有可能影響到酶的催化能力。

2.2 雙果糖酐水解酶DFA-Ⅲase突變文庫的高通量篩選

DNS法是還原糖測定常用的經典方法，但應用傳統方法對大批量樣品檢測仍較繁瑣，所以有必要建立微型化DNS法。本研究利用微孔板進行還原糖與DNS試劑反應，并用酶標儀測定540 nm波長下的吸光度。在96孔板中進行DNS法比色時，標準曲線為y=5.59x-0.026回歸系數為0.993 4，線性良好，能滿足實驗測定的需要。而且利用96孔板作為反應容器時可同時處理96個樣品，樣品處理完再利用移液排槍轉移至酶標板，幾分鐘內即可讀取數據，操作簡便；另外在96孔板中反應時，反應體系小，可節約試劑。所以微孔板結合DNS法檢測有望成為酶活性高通量分析的方法。

將設計的突變體利用96孔板同步發酵培養，DFA-Ⅲase在大腸桿菌中是以胞內酶形式表達，利用96孔板對菌體進行發酵培養時，盡量保持每個孔的菌體濃度一致，為了保持結果的重復性，將同一樣品的重組酶液分裝在深孔板中，利用粗酶和底物反應，采用DNS法對水解物進行測定，結果如圖1所示。

圖1 原始酶和突變體的酶活性結果Fig.1 Enzyme activities of wild enzyme and mutants

對原始AcDFA-Ⅲase進行定點突變得到的突變體酶仍然具有水解雙果糖酐的能力，但是大部分突變體的酶活性大幅度降低，只有D380A和C387A的酶活性有明顯提高。利用此方法測出D380A的酶活性是AcDFA-Ⅲase的152.5%，C387A的酶活性是AcDFA-Ⅲase的168.5%，而之前課題組用HPLC法測得C387A純酶的相對酶活性是AcDFA-Ⅲase的185.2%[18]，2種方法所得結果比較一致?？梢猿醪秸J定，D380A也是1個正向突變體，但是之前并未有人利用DNS法來檢測DFA-Ⅲase的酶活性，所以還需進一步用HPLC法對其可信度進行驗證。

2.3 搖瓶復篩

將D380A突變體在LB培養基中進行搖瓶發酵，經過鎳柱親和層析純化，純化后的SDS-PAGE結果如圖2所示，有2條清晰的單條帶，純度較高，D380A的相對分子質量在47 kDa左右，和AcDFA-Ⅲase一致，可以進行酶活性測定。

M-蛋白marker；1-AcDFA-Ⅲase；2-D380A圖2 純化后的AcDFA-Ⅲase和突變體D380A的 SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of the purified AcDFA-Ⅲase and the mutant D380A

酶活性測定以DFA-Ⅲ為底物，在pH 6.5、55 ℃條件下，采用HPLC檢測原始酶和突變酶的活性，突變體D380A的酶比活性為164.33 U/mg，原始菌株AcDFA-Ⅲase的酶比活性為101.25 U/mg，突變體D380A酶活性顯著高于原始酶，是AcDFA-Ⅲase的162.3%。而DNS法初篩結果得出，D380A的酶活性是AcDFA-Ⅲase的152.5%，初篩和復篩結果一致。突變體庫初篩時采用的96孔板和搖瓶培養復篩在體積、溶氧以及酶的純度等參數上存在較大的差異，在這種情況下，2種測定方法的結果仍然有較好的一致性，這表明96孔板結合DNS法可以作為AcDFA-Ⅲase的酶活性篩選手段，大大提高篩選效率，減少勞力和成本。

2.4 AcDFA-Ⅲase和D380A的酶學性質

如圖3所示，突變體D380A和原始酶的最適溫度和最適pH均為55 ℃和6.5，在40～65 ℃以及pH 5.0～7.5范圍內，酶活性仍能保持50%以上，結果表明理性設計可以在不改變酶的最適反應條件下進行。

a-溫度；b-pH圖3 AcDFA-Ⅲase和突變體D380A的最適反應條件Fig.3 Optimum reaction conditions of AcDFA-Ⅲase and the mutant D380A

2.5 AcDFA-Ⅲase和D380A的反應動力學

對AcDFA-Ⅲase和D380A進行反應動力學分析，計算出它們的動力學參數，結果如表2所示。D380A的Km值較原始酶AcDFA-Ⅲase有所下降，說明突變之后D380A對底物雙果糖酐的親和力提高了，而且D380A催化效率提高到了原始酶的1.5倍。

表2 AcDFA-Ⅲase和突變體D380A的動力學參數Table 2 Kinetic parameters of AcDFA-Ⅲase and the mutant D380A

2.6 D380A同源建模

針對突變體D380A酶活性高的原因進行分析，首先以野生酶的晶體結構(PDB ID:5ZKS)為模板，利用SWISS-MODEL進行同源建模。所構建的模型通過Wincoot在拉氏圖(Ramachandran plot)進行氨基酸分析。結果顯示，94.52%、4.80%和0.68%的氨基酸殘基分別坐落于核心區、允許區和非允許區域。當落在核心區和允許區的氨基酸殘基占整個蛋白質的比例高于90%，便可認為該模型的構象符合立體化學規則，而D380A模型拉氏圖中核心區和允許區的氨基酸所占比例總和高達99.32%。同時，D380A模型有91.14%氨基酸殘基的平均3D-1D分數在0.2以上。蛋白質原子三維結構模型(3D)和一級氨基酸序列(1D)的匹配程度(兼容性)也是一個模型合理性的判定依據，一般要求80%的氨基酸殘基平均3D-1D分數達到0.2以上即可判定此模型較合理。綜合這兩方面的檢測結果，所構建的D380A模型合理，可用于后續研究分析。

均方根偏差(relative mean square deviation，RMSD)可用于分析試驗獲得的數據和實際數據的偏差，2種酶之間RMSD值越小，說明其差異越小。D380A模型結構與AcDFA-Ⅲase結構比對的RMSD值為0.015 7 nm，說明380位點氨基酸突變并沒有引發酶整體結構的變化。圖4-a所示，野生酶AcDFA-Ⅲase活性口袋上方有1個loop環結構，類似蓋子封住口袋，有利于口袋疏水微環境的形成和催化。此蓋子富含疏水氨基酸，380位點的天冬氨酸與周邊氨基酸并沒有形成相互作用。且380毗鄰的379、381、382位點以及對立的397位點皆為疏水性氨基酸，這些疏水氨基酸的存在使水分子不易進入活性中心。將380位點突變為丙氨酸后(圖4-c)，這5個位點全部為疏水性氨基酸，蓋子區域疏水性顯然增強(圖4-d相對圖4-b中的疏水面積更大)。因此，外界水分子更加不易通過蓋子上方進入活性口袋內部，口袋中疏水微環境增強，更加有利于催化，即表現在380位點突變后的活性增加。

a-AcDFA-Ⅲase活性口袋區域結構及氨基酸殘基 (活性口袋中底物DFA-Ⅲ為黃色)；b-AcDFA-Ⅲase 活性口袋區域疏水性(疏水區域為粉紅色)； c-D380A活性口袋區域結構及氨基酸殘基； d-D380A活性口袋區域疏水性圖4 D380A活性提高機制分析Fig.4 Enhancement mechanism of D380A activity

3 結論

為了解決酶在實際生產和應用過程中穩定性差，活性不高等問題，需要對酶進行合理的改造，如定點突變，定向進化，這些方法取得了很大的成功。但是巨大的突變體庫增加了篩選難度以及篩選的成本，解決此問題的關鍵是建立高通量篩選技術。

本研究對AcDFA-Ⅲase進行了分子改造，并基于DFA-Ⅲase與DFA-Ⅲ反應生成還原糖，建立了96孔板結合DNS法高效檢測DFA-Ⅲase活性的方法。利用高通量方法篩選與HPLC法驗證，成功從17個突變體中篩選到1個酶活性提高62.3%的突變體D380A。利用同源建模模擬分析得出，將380位天冬氨酸突變為丙氨酸，增強了蛋白活性口袋上方loop區的疏水性，使水分子不易進入活性中心，更益于催化，提高了酶的催化活性。

本研究建立的DFA-Ⅲase的高通量篩選方法，在人工操作的情況下可重復性高，耗時短，操作簡單，提高了菌株的篩選效率。篩選得到的菌株為菊二糖的大量生產和性質研究提供了可能性，也為催化機制解析提供了基礎數據。但是構建的重組DFA-Ⅲase生產菌的酶活性仍有較大的提升空間，接下來可以嘗試通過多位點改造或隨機突變等手段來進一步提高酶活性，提升其工業利用價值。