滲透壓對黑曲霉菌絲形態和葡萄糖氧化酶活力的影響

任文強，張鎮松，李春震，李潔，李紅華*

1(中國科學院 生態環境研究中心，北京，100085)2(北京化工大學 生命科學與技術學院，北京，100029)

葡萄糖氧化酶(glucose oxidase，EC 1.1.3.4 GOD)是一種二聚體的蛋白酶，可以高度專一地催化β-D-葡萄糖轉化為葡萄糖酸，同時生成過氧化氫[1-2]。GOD最早在黑曲霉的無細胞培養液中被發現，并由MULLER進行了報道[3]。在隨后的研究中，多種微生物培養液都檢測到GOD，并且以曲霉屬和青霉屬為主，近年來基因工程技術的發展，也有助于高產GOD菌株的培育[4]。20世紀70年代，我國成立研究協作組，對GOD開展系統深入研究，內容涉及到菌種選育、發酵工藝優化、酶的分離純化以及特性研究等[5]。GOD在食品工業、畜禽養殖業和醫藥行業中有著廣泛的應用[6]。

多種動物、植物、昆蟲、紅藻和微生物的體內都有GOD存在，而微生物(黑曲霉屬和青霉菌屬)具有生長繁殖快、成本低等優勢，常被用作GOD發酵生產的主要菌種[7]。黑曲霉(Aspergillusniger)滿足美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Administration，FDA)在食品工業中的安全性要求[5]，并且我國農業部在2013年12月發布的《飼料添加劑品種目錄(2013)》中，明確了飼料中的GOD可以使用青霉和黑曲霉進行工業生產[8]。在過去的幾十年里，黑曲霉常被用于制醬、釀酒、制醋、抗生素、生產酶制劑和有機酸等有價值的生化產品的生產中[9]。

黑曲霉絲狀真菌是一種形態復雜的微生物，在整個生命周期中會表現出不同的生長形式：高度游離的菌絲、菌絲纏繞緊密的顆粒球和菌絲發散的菌絲團[10]。不同的菌絲形態有利于不同發酵產物的積累，如菌絲顆粒球形態適宜生產糖化酶，發散菌絲團適于生產檸檬酸[11]。除了菌體自身的特性之外，許多環境因素也會影響真菌的形態，比如孢子接種量和pH的調整，會影響菌體的群體效應，有效控制黑曲霉的生長特征[12]；溶氧系數和攪拌條件的改變，可以控制菌絲球的結構，增加發酵效率[13]。這些培養條件的調整都會間接導致滲透壓的改變，但是直接研究外部滲透壓對真菌菌絲形態影響的報道還很少。因此，本文深入研究了培養基中不同種類的底物所產生的滲透壓對菌絲體形態的影響，通過光學顯微鏡的圖像分析，得到了滲透壓和絲狀真菌形態之間的關系，采用分光光度法測定了不同滲透壓下葡萄糖氧化酶的活力。

1 材料與方法

1.1 菌株

黑曲霉(Aspergillusniger)FF11-01，為實驗室保藏菌種。

1.2 培養基成分與試劑

合成培養基組成(g/L)：葡萄糖 25，KCl 0.2，KH2PO40.15，MgSO4·7H2O 0.24，(NH4)2HPO40.6，酵母膏 3.0，蛋白胨4.0，瓊脂 20。吖啶橙染色劑、鄰聯茴香胺、辣根過氧化物酶、GOD標準品，Sigma公司。磷酸鈉緩沖液、葡萄糖、鹽酸(均為分析純)，國藥集團。

1.3 主要儀器設備

SW-CJ標準潔凈工作臺，蘇凈集團安泰空氣技術有限公司；STY-1A型滲透壓測定儀，天大天發科技有限公司；SW-CJ-1F回轉式恒溫調速搖瓶柜，上海欣蕊自動化設備有限公司；501型恒溫水浴鍋，鞏義市予華儀器有限責任公司；7200型分光光度計，尤尼柯上海儀器有限公司；DM-500型光學顯微鏡，徠卡顯微系統(上海)貿易有限公司。

1.4 發酵培養

使用合成培養基在30 ℃下培養72 h，以保證孢子懸浮液濃度達到107孢子/mL?；罨蟮暮谇规咦右恨D移至盛有100 mL底液的500 mL三角瓶中繼續培養，接種量5%(體積分數)，溫度30 ℃，搖床轉速220 r/min，培養時間48 h。菌體外部滲透壓通過滲透壓測定儀測定，并采用生理鹽水作為對照組。

1.5 酶活力測定方法

根據葡萄糖氧化酶的催化反應機制，酶活力的測定主要有以下3種方法：電化學法[14]、滴定法[15]和分光光度法[16]。分光光度法樣品處理簡便，反應時間短，滿足快速實驗的要求，是目前最普遍使用的酶活力測定方法。利用鄰聯茴香胺作為顯色供體，待測樣品的吸光值可以反映GOD酶活力的大小，且該方法得到了眾多科研工作者的認可[16-18]。

1單位量的GOD指的是在25 ℃、pH 6.0條件下每分鐘氧化1 μmol葡萄糖需要的酶量。反應液的體積為300 μL，其中包括20 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 6.0)、0.7 mmol/L 鄰聯茴香胺、100 mmol/LD-葡萄糖、20 μg/L辣根過氧化物酶和20 μL待測樣品。微體系在25 ℃下反應10 min，用等體積的4 mol/L鹽酸溶液停止反應。反應結束后的上清液測定波長540 nm的吸光值，根據標準曲線換算得到葡萄糖氧化酶的活力[16]。

1.6 吖啶橙染色和菌絲形態觀察

將待測樣品與96%的乙醇混合，80 ℃條件下，混合液在顯微鏡的載玻片上固定1 h，再用吖啶橙溶液染色[19]，蒸餾水清洗多余的染色劑，并在室溫下干燥。使用DM-500型光學顯微鏡觀察黑曲霉的菌絲形態，經吖啶橙染色后，核糖核酸(RNA)豐富區和貧乏區，分別會表現出橘黃色和綠色[20]。

2 結果與討論

2.1 滲透壓對黑曲霉生長形態的影響

能源物質在微生物發酵培養過程中起到了至關重要的作用，選取葡萄糖、果糖、蔗糖、甘油和聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)作為碳源[21]，NaCl為對照，探討了滲透壓對黑曲霉生長形態的影響。以質量分數0.9%的生理鹽水模擬菌體內環境，產生的滲透壓值OS為 287.28 mOsmol/(kg·H2O)。由于基質組分、溫度等因素，滲透壓測定值會出現一定范圍內的波動，較難推算出準確的碳源濃度，因此以葡萄糖梯度增長的濃度值作為參考，對不同底物的滲透壓(OT)進行了測定，結果見表1?？梢园l現，對于每一種底物而言，滲透壓與濃度都會呈現出明顯的正相關性，并且同一濃度不同底物會表現出差異性的結果。因此，液體培養基的滲透壓可以通過添加不同種類和劑量的底物來控制。

表1 不同培養基底物引起的滲透壓變化Table 1 Osmotic pressures by different compounds in substrate

參考表1中的滲透壓，以葡萄糖作為底物碳源，黑曲霉生長過程中菌體呈現出了圖1-a～1-f的多種形態。當培養基滲透壓為900.71 mOsmol/(kg·H2O)時，黑曲霉菌絲團開始逐漸形成，繼續增大滲透壓菌絲會出現明顯的擴散現象。此外，其他5種底物的培養過程呈現出了圖1-g～x的多種形態，可以發現無論在哪種底物實驗中，黑曲霉在低濃度的劑量下都會呈現出菌絲纏繞的顆粒球狀的生長形態，而隨著濃度的增加，會向著發散的菌絲團狀轉變。除聚乙二醇(PEG)外，其他5種底物滲透壓大于2 000 mOsmol/(kg·H2O)時，菌落數量明顯下降，出現了畸形生長甚至死亡的現象。在90 g/L NaCl的平板培養基中(圖1-x)，未發現存活的菌株，而同樣高滲透壓(OT/OS=10.40)條件下，500 g/L蔗糖平板中(圖1-l)，卻有少量的絲狀菌體生長，這可能是因為蔗糖可以作為碳源用于黑曲霉的生長，而NaCl卻不能作為能源物質。這些結果說明黑曲霉在低滲透壓和高滲透壓下，會表現出菌絲纏繞的顆粒球狀和發散的菌絲團狀的形態差異，可能也會進一步影響到菌體的新陳代謝途徑[22]，導致葡萄糖氧化酶活力的改變。

a-20 g/L葡萄糖；b-100 g/L葡萄糖；c-200 g/L葡萄糖；d-300 g/L葡萄糖；e-400 g/L葡萄糖；f-500 g/L葡萄糖； g-20 g/L果糖；h-200 g/L果糖；i-500 g/L果糖；j-20 g/L蔗糖；k-200 g/L蔗糖；l-500 g/L蔗糖； m-20 g/L PEG；n-50 g/L PEG；o-80 g/L PEG；p-100 g/L PEG；q-200 g/L PEG；r-300 g/L PEG; s-20 g/L甘油；t-70 g/L甘油；u-200 g/L甘油；v-18 g/L NaCl；w-45 g/l NaCl；x-90 g/L NaCl圖1 滲透壓變化對黑曲霉形態的影響Fig.1 Effects of osmotic pressure changes on the morphology of Aspergillus niger

2.2 吖啶橙染色確定活性區域的分布

吖啶橙染色劑與單鏈的RNA和雙鏈的DNA相互作用時，會發出橘黃色和綠色的熒光。GOD等活性蛋白質主要由單鏈RNA的翻譯合成，而吖啶橙可以鑒別出真菌微生物RNA的豐富區和貧乏區，因此可以確定出活性蛋白的分布區域。

選取濃度20和500 g/L葡萄糖培養的黑曲霉菌體，經過吖啶橙染色可以明確區分菌體中的RNA豐富區(橘黃色)和RNA貧乏區(綠色)[20]。圖2和圖3分別展示了低滲透壓作用下菌絲纏繞的顆粒球狀和高滲透壓作用下發散菌絲團狀的染色結果。低滲透壓作用下黃色熒光區域集中在球團的外部邊緣，表明絲狀區域主要用來分泌GOD等活性蛋白，而球心綠色區域證實了菌體繁殖產生大量DNA的分布。高滲透壓作用下菌絲團發散體積明顯膨脹，雖然活性區域仍然出現在絲狀的表面，但是貧乏區卻沒有明顯顯示效果。此外，溶解在培養基中游離的菌絲體上(圖3-d)沒有明顯的RNA豐富區和貧乏區的界限。由此可見，菌株形態的不同將會導致活性蛋白分布區域的不同，菌絲球芯越小，菌體的活性體積就越大。

2.3 葡萄糖調控滲透壓對菌體形態參數和GOD活力的影響

葡萄糖是黑曲霉培養的最佳碳源[5]，但是適宜的添加濃度以及相應的滲透壓需要進一步驗證。表2總結了不同濃度葡萄糖控制的滲透壓導致菌體形態變化的參數。隨著滲透壓的增大，微球的直徑減小，相應邊緣部位的菌絲長度增加。同時，菌絲體微球的數量也有明顯的增長?？偙砻娣e和總體積均呈現出了先下降后上升的趨勢，最低點出現在了滲透壓值OT/OS=3.13(質量濃度為200 g/L)的實驗組中，而值得注意的是，比表面積最大值也出現在該組實驗中。結合本文之前得到滲透壓變化影響細胞形態的結論，可以進一步確認，滲透壓的增大會引起黑曲霉菌絲體生長形貌由大球團狀向發散網狀的轉變。

a-×40，顆粒球狀；b-×100，顆粒球外層； c-×200，顆粒球外層；d-×200，顆粒球核心圖2 在低滲透壓下生長的顆粒球狀形態活性區域檢測Fig.2 Morphologically active regions of pellets grown of A.niger under low osmotic pressure

a-×40，發散菌絲團狀；b-×100，絲狀外層； c-×200，絲狀外層；d-×200，培養基中游離菌絲圖3 在高滲透壓下生長的菌絲團狀形態活性區域檢測Fig.3 Morphologically active regions of filamentous mass grown of A.niger under high osmotic pressure

表2 葡萄糖培養基控制的菌絲球團參數Table 2 Summary of the key parameters of A.niger pellets obtained by different glucose concentration in substrate

圖4展示了與表2相應梯度的葡萄糖濃度(相應的滲透壓值列舉在表1中)對黑曲霉生物量和GOD活力的影響。經過48 h的發酵培養，最低的GOD活力3.82 U/mL出現在滲透壓值OT/OS= 0.47實驗組中，這可能是由于較低含量的葡萄糖不能為菌體生長和代謝提供充足的營養造成的。在滲透壓值OT/OS為3.13和4.64的實驗組中，得到較高的GOD活力11.23和11.01 U/mL，菌體生物量為43.2和44.7 g/L，兩組實驗的結果無明顯差異，為節約生產工藝的成本，選取200 g/L葡萄糖實驗組數據作為后續實驗的參考依據。當滲透壓值超過OT/OS=4.64時，菌絲體的生物量和GOD活力均呈現出明顯下降的趨勢。因此，葡萄糖不僅可以作為GOD基因轉錄的主要誘導劑，而且可以通過改變菌體形態來決定GOD的活力[23]。

圖4 不同滲透壓葡萄糖培養基的GOD活力和菌體生物量Fig.4 GOD activity and cell concentration of A. niger under different osmotic pressures regulated by glucose concentration in initial substrate

2.4 滲透壓對GOD活力影響

采用2種方法評估了滲透壓對GOD活力的影響，即不同濃度底物相似滲透壓實驗和相同濃度底物不同滲透壓實驗。

首先，確保滲透壓的一致性，以200 g/L葡萄糖產生的滲透壓900.71 mOsmol/(kg·H2O)為參考依據，底物中葡萄糖被果糖、蔗糖、甘油、PEG和NaCl替代后，5種替換底物的質量濃度依次為100.0、200.0、70.0、200.0和18.0 g/L，相應的滲透壓變化范圍在850～950 mOsmol/(kg·H2O)。通過分光光度法測定的GOD活力見圖5，果糖、蔗糖和甘油作為底物得到的GOD活力分別為 10.32、9.14和10.21 U/mL，與葡萄糖為底物的GOD活力最高值11.23 U/mL相比，大約下降了10%～20%，下降趨勢并不明顯，這也進一步說明了發酵液滲透壓對菌絲體形態的影響是決定GOD活力的關鍵因素。然而，在PEG和NaCl為底物的實驗中，GOD活力顯著下降，僅為3.29和0.48 U/mL，與葡萄糖為底物的GOD活力相比，分別下降了70.70%和95.73%。這可能是因為PEG和NaCl對黑曲霉的代謝起到了嚴重的抑制作用[24]，這也與本文前面描述的菌體不能在高濃度NaCl培養基上生存相一致。

圖5 不同底物相似滲透壓培養的GOD活力Fig.5 GOD activity by A.niger under similar osmotic pressure maintained by different additions

其次，選取木糖、果糖和葡萄糖為底物，評估相同底物濃度控制的不同滲透壓對GOD活力的影響。底物中分別添加200 g/L的木糖、果糖和葡萄糖，得到滲透壓值依次為543.52、1 281.72和900.71 mOsmol/(kg·H2O)。如圖6所示，在木糖和果糖的實驗組，GOD的活力僅為2.21和3.09 U/mL，而添加葡萄糖的實驗組則表現出了較強的酶活力10.91 U/mL，大約提升了3～5倍。同時菌絲體生物量在葡萄糖作用下可以達到24.33 g/L，比木糖和果糖的實驗組分別增加了59.87%和10.70%。這一現象與HATZINIKOLAOU等[23]報道的結果相一致，葡萄糖作為GOD轉錄基因的主要誘導物可能是造成這種顯著差異的主要原因。由此可見，培養基中的滲透壓對GOD的活力起到非常關鍵的控制作用。

圖6 相同濃度底物不同滲透壓培養的GOD活力Fig.6 GOD activity by A.niger using different carbon sources under different osmotic pressure

2.5 討論

黑曲霉自身生長特性與細菌和酵母不同，在液態發酵培育中傳質和傳氧與菌體生長呈負相關性[25]。有研究表明，真菌生命周期中的顆?；瘯е屡囵B基黏度的降低，進而有助于底物混合效率和傳質效果[26]，也有利于簡化下游的固液分離工藝流程。但是在顆粒球狀生長階段，由于質量傳遞的局限性，微生物對溶解氧和營養物質的吸收受到抑制，會導致菌體內部的自溶[27-29]。相比之下，在微球嵌入到絲狀真菌的網狀結構的生長階段，培養基的黏度會發生改變，菌絲吸收營養物質的接觸面積將會增大[30]。

絲狀真菌在發酵培養過程中會呈現出菌絲球狀、發散網狀和游離絲狀的多種形態，形態學分析手段為控制菌絲特性，發酵液流變特性和代謝產物的研究提供了良好的依據。很多學者在黑曲霉產葡萄糖氧化酶的研究中，關注于常見工藝參數的優化，如：培養基組成、pH、溫度、溶解氧和二氧化碳等[12]，這些因素都會間接影響菌體生長環境的滲透壓。本文通過直接控制滲透壓的方法，研究了黑曲霉菌絲體生長形態和GOD活力的變化。在一定滲透壓范圍內，菌絲體呈現發散絲狀的生長形態并分泌較高活力的GOD。此項研究工作為GOD生產工藝放大和其他生物制品的發酵生產提供了參考依據。在今后的研究中，將以此為基礎繼續探究其他底物種類、pH、攪拌等引發的滲透壓改變對菌絲體形態和GOD活力的影響。

3 結論

培養基中的滲透壓會嚴重影響黑曲霉的生長形態和GOD活力。隨著滲透壓的增長，菌絲體形態呈現出了從菌絲纏繞的顆粒球狀向發散菌絲團狀的轉變。吖啶橙染色的結果表明，RNA豐富的蛋白活性區域分布在絲狀形態中和顆粒球團的外層上。菌絲體生長形態的改變會導致內部代謝途徑的改變，進而影響到GOD的活力。在200 g/L葡萄糖培養基中產生的滲透壓為900.71 mOsmol/(kg·H2O)，可以獲得最高的GOD活力(11.23 U/mL)。發酵工藝優化研究中滲透壓參數通常被忽視，不同微生物對環境的適應能力也存在著差異，在大規模工業生產中，穩定適宜的滲透壓環境可以提高目標物產量和增加經濟效益。