在黑果腺肋花楸中共發酵里氏木霉和綠色木霉生產木聚糖酶

袁亞峰，姜秋實，程志強

(吉林農業大學 資源與環境學院，吉林 長春，130118)

木聚糖酶能夠降解木聚糖，在造紙[1]、木質纖維材料生物轉化以及果汁澄清[2]等方面有著廣泛的應用。目前研究表明，除了動物和植物，許多細菌和真菌都可以產生木聚糖酶，但是不同微生物生產的木聚糖酶性質有所差別，細菌生產的主要是酸性木聚糖酶[3]，真菌生產的大都是堿性木聚糖酶[4]。微生物發酵生產木聚糖酶具有經濟性好，對生產設備、場地要求簡單等諸多優勢，因而是目前規?；a木聚糖的主要方法。

木霉菌是能產生多種酶類的絲狀真菌，其中最主要的是木聚糖酶[5]和纖維素酶[6]等。國內外對木霉菌發酵產生木聚糖酶的研究較多。里氏木霉和綠色木霉生長周期短，產木聚糖酶的時間短，對環境要求低，是規?；a木聚糖酶的理想真菌。但是單一菌株生產木聚糖酶存在產酶時間長、酶系組成單一、產酶量低等問題。利用混合發酵可以有效地解決上述問題并提高酶的活力。GUTIERREZ-CORREA等[7]利用里氏木霉與黑曲霉或海棗曲霉共培養，在甘蔗渣上進行固體基質發酵生產木聚糖酶。鄒水洋等[8]發現較單獨培養康寧木霉相比，康寧木霉與米根霉混合培養形成了相互促進的共生關系，有效地提高了纖維素酶和木聚糖酶的酶活力。BALDRIAN[9]將哈茨木霉添加到白腐菌培養物中使漆酶活性增加40倍以上。但是真菌共發酵生產酶仍然面臨許多挑戰和尚未解決的問題，特別是真菌之間的分子相互作用以及由此產生的酶優化問題。但是目前共培養仍然是工業酶生產的一個發展領域，在實際應用之前，該技術的培養方面需要進一步改進。

木聚糖酶是一種誘導酶，選擇適合的培養基和培養條件會促進木霉菌產木聚糖酶。目前，為了降低木聚糖酶的生產成本，一般都是利用秸稈[10]、麩皮、玉米芯、稻草[11]等農業廢棄物作為主要基質，里氏木霉[12]、綠色木霉、哈茨木霉[13]等真菌進行發酵，多為固態發酵技術。由于固體發酵存在參數難控制，無法均勻混合，造成部分營養物質的浪費、回收成本高等問題，導致難以工業化生產木聚糖酶。農業廢棄物作為原料，使用易于大量生產的液體發酵技術生產木聚糖酶的產量低[10]。為了提高農業廢棄物生產木聚糖酶的產量，大都需要使用酸、堿等物質進行預處理，在提高木聚糖酶的產量的同時，預處理步驟提高了生產的成本，造成環境污染[14]。而以果渣作為碳源，使用液體發酵技術生產木聚糖酶產量高[4]，同時還利用了廢棄果渣，避免了資源的浪費。黑果腺肋花楸在東北地區生長范圍廣，產量高，主要在工業上加工成果汁[15]，產生大量果渣。果渣質量分數占未加工生漿果的16%，其中纖維含量約為60 g/100 g，這些纖維大多是不溶性纖維，無法得到合理利用[16]。綜上可知，黑果腺肋花楸果渣作為木霉菌發酵的碳源用于生產木聚糖酶是合理利用黑果腺肋花楸的有效途徑。

本文在液體深層發酵條件下，以廢棄的黑果腺肋花楸果渣作為基礎培養基，利用黑果腺肋花楸果渣豐富的纖維素和木質素作為碳源，誘導里氏木霉和綠色木霉共發酵產木聚糖酶，并通過正交試驗對基礎培養基進行優化，促進木霉菌低成本發酵生產木聚糖酶，為工業化生產木聚糖酶提供有效的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養基

1.1.1 菌種

里氏木霉(ATCC 24449)，瑞楚生物科技有限公司微生物菌種保藏中心；綠色木霉(ACCC 30206)，中國農業微生物菌種保藏管理中心；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato dextrose agar，PDA)，上海博微生物科技有限公司。

將綠色木霉和里氏木霉經過活化后分別接種PDA上，在28 ℃下培養3 d。用無菌水分別將PDA上的孢子沖洗下來后，得到里氏木霉孢子液和綠色木霉孢子液，分別使用血球計數法計數后，稀釋到106CFU/mL，并于4 ℃儲存，備用。

1.1.2 試劑

1.00%(質量分數)木聚糖溶液按照馮培勇等[17]的方法配制；DNS試劑參考MILLER等[18]的方法配制。

1.1.3 基礎培養基

黑果腺肋花楸(長白山)的果實經采摘后烘干，打粉，并過50目篩，得到黑果腺肋花楸果渣(后稱果渣)，儲存備用。果渣質量分數為25%，pH值自然(pH 3.56)，置于錐形瓶中，121 ℃滅菌30 min。

10%(質量分數)綠色木霉和里氏木霉孢子混合液(1×106CFU/mL，里氏木霉與綠色木霉按1∶1混合)接入已滅菌的培養基，28 ℃空氣浴搖床(160 r/min)培養1 d。

1.1.4 粗酶液的制備

通過液體深層發酵后，將培養基使用4層紗布初步過濾后，使用20 mL檸檬酸緩沖溶液沖洗后，得到的液體使用魏瑛等[19]的方法制備粗酶液。

1.2 測試方法

通過BAILEY等[20]的方法測定培養基中木聚糖酶的活性。將1.5 mL 1.00%木聚糖溶液置于50 ℃水浴鍋中預熱2 min，吸取0.5 mL使用檸檬酸緩沖溶液稀釋后的粗酶液加入木聚糖溶液中，立即計時，準確反應30 min后，迅速加入3 mL DNS試劑終止反應。然后在沸水浴中顯色5 min，取出后用去離子水定容到50 mL，搖勻，冷卻，于550 nm測定吸光度值?？瞻讓φ眨合认蚰揪厶侨芤褐屑尤隓NS試劑，置于沸水浴中，隨后加入稀釋酶液，按上述方法測定。

1.3 不同培養條件對木聚糖酶產量的影響

在1.1.3所述基礎培養基的條件下，通過單因素試驗分別探究氮源、接種質量分數、里氏木霉和綠色木霉的質量比例、果渣質量分數、培養時間、培養基初始pH對木聚糖酶產量的影響。氮源包括賴氨酸、精氨酸、NaNO3、胰蛋白胨、NH4NO3、尿素、酵母提取物。綠色木霉接種質量分數設定為6%～16%，接種質量比例(里氏木霉與綠色木霉的質量比例)設定為5∶0，4∶1，3∶2，2∶3，1∶4，0∶5，果渣的質量分數為14%～24%，培養時間設定為1～7 d，酸堿度設定為4.00～6.50。

1.4 正交優化里氏木霉和綠色木霉共發酵的培養基

根據單因素試驗結果，NH4NO3是里氏木霉和綠色木霉共發酵的培養基的最佳氮源；最佳培養時間為3 d；里氏木霉與綠色木霉的最佳質量比例為3∶2。對氮源質量濃度、果渣質量分數、接種質量分數、pH 4個培養條件進行四因素三水平L9(34)正交試驗，并測定木聚糖酶的活性，以確定不同條件相互組合的效果，并確定里氏木霉和綠色木霉共發酵的最佳培養基，因素水平見表1。

表1 培養條件正交試驗因素水平Table 1 Orthogonal experiment factor level of culture conditions

1.5 無機離子對木聚糖酶產量的影響

為測定無機離子對木聚糖酶活性的影響，分別將MgSO4(0、3、6、9、12、15、18、21 mg/L)、FeSO4(0、3、6、9、12、15、18、21 mg/L)、MnSO4(1、1.4、1.8、2.2、2.6、3.0、3.4 mg/L)、ZnCl2(0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2、3.6 mg/L)、CoCl2(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/L)添加到培養基中，里氏木霉和綠色木霉共發酵后測定培養基中木聚糖酶活性，探究無機離子對木聚糖酶產量的影響。

1.6 統計分析

數據采用單因素方差分析(analysis of variance，ANOVA)進行評估，圖中不同字母表示顯著差異(P<0.001)。每組實驗3個重復。

2 結果與討論

2.1 氮源種類對木聚糖酶活性的影響

氮源用于構成菌體細胞物質，木聚糖酶的合成受氮源種類和性質的影響非常大。本研究為了選取最適合木霉菌產木聚糖酶的氮源，在培養基中添加相同氮濃度的氮源。由圖1-a可知，較未添加氮源的培養基相比，添加賴氨酸、精氨酸、NaNO3、胰蛋白胨、NH4NO3、尿素、酵母提取物7種氮源到培養基培養6 d后，木聚糖酶的活性顯著增加(P<0.001)。添加酵母提取物、蛋白胨、NH4NO3后，培養基中木聚糖酶的活性最高，分別為83.30、83.35、84.19 U/mL?？紤]到培養基的成本及木聚糖酶的產量，選擇NH4NO3作為發酵的氮源。

2.2 培養時間對木聚糖酶活性的影響

兩菌共發酵時，培養時間通常會對發酵結果造成一定的影響。圖1-b反映了接入里氏木霉與綠色木霉后一周內粗酶液中木聚糖酶的活性變化情況。隨著時間的增加，木聚糖酶的活性呈現先增加然后趨于平緩的趨勢。發酵4 d及以后，隨著時間的增加，木聚糖酶活性增加的不明顯。所以，接種后培養4 d為里氏木霉與綠色木霉共發酵生產木聚糖酶的最佳培養時間，木聚糖酶活性為83.14 U/mL。

2.3 接種質量比例對木聚糖酶活性的影響

適合的接種質量比例有助于在共發酵培養基中促進里氏木霉和綠色木霉達到最佳共生狀態，促進木聚糖酶的產生。如圖1-c所示，里氏木霉和綠色木霉按照不同質量比接種后，發酵樣品中木聚糖酶的活性顯著變化(P<0.001)。當里氏木霉和綠色木霉接種質量比為3∶2時，溶液中木聚糖酶的活性最高，為85.36 U/mL。接種質量比例為5∶0，即只接種里氏木霉時，木聚糖酶活性為82.25 U/mL。而接種質量比例為4∶1時，培養基中里氏木霉在發酵初期吸收營養及繁殖的能力強于綠色木霉，會迅速成為優勢菌種，進一步限制綠色木霉的生長和繁殖，不利于2種菌共同發揮作用促進木聚糖酶的產生，但是綠色木霉的加入在一定程度上也會增加木聚糖酶的產量。當里氏木霉和綠色木霉接種質量比為2∶3時，由于里氏木霉和綠色木霉對營養及氧氣的競爭及2株菌之間的拮抗作用，導致里氏木霉和綠色木霉的生長緩慢，木聚糖酶的活性最小，為82.73 U/mL。而綠色木霉質量比例越來越高時，綠色木霉菌大量繁殖，不利于里氏木霉生長和代謝，所以溶液中木聚糖酶的活性增加，卻少于接種質量比為3∶2時。綜上，可能是由于里氏木霉和綠色木霉接種質量比為3∶2時，混合菌達到了一種良好的共生狀態，相互促進彼此的生長，增加了木聚糖酶的產量。

a-氮源；b-培養時間；c-接種質量比圖1 氮源、培養時間和接種質量比例對木聚糖酶活性的影響Fig.1 Effect of nitrogen source, culture time, and inoculated ratio on the xylanase activity

2.4 pH對木聚糖酶活性的影響

pH能夠改變微生物細胞膜的電荷屬性和培養基中營養物質的離子化程度，從而促進微生物吸收營養物質的能力發生改變，對里氏木霉與綠色木霉的生長和產木聚糖酶具有很大影響。圖2-a反映了隨著pH的增加(4.00～6.50)，木聚糖酶活性呈現先增加后減少的趨勢(P<0.001)。當培養基中pH為5.50時，培養基溶液中木聚糖酶活性最高，達到82.71 U/mL,與基礎培養基相比，木聚糖酶產量增加了10.15%。當培養基中pH<5.50時，隨著pH的增加，木聚糖酶的活性逐漸升高。pH>5.50后，木聚糖酶的活性隨著pH值的升高而降低。XIANG等[21]的研究表明，pH值5～6能夠有效地影響細胞膜所帶的電荷，使培養基中有機化合物分子很容易地進入細胞，從而促進細胞對營養物質的吸收，加快木聚糖酶的合成，使木聚糖酶的活性較其他pH值條件下更穩定。

a-pH；b-氮源濃度;c-果渣質量分數；d-接種質量分數圖2 培養條件對木聚糖酶活性的影響Fig.2 Effect of culture conditions on the xylanase activity

2.5 氮源濃度對木聚糖酶活性的影響

為了節約氮源的使用，提高木聚糖酶活性，測試了在培養基中加入不同質量濃度氮源對里氏木霉和綠色木霉共發酵產生木聚糖酶的影響(圖2-b)。隨著氮源質量濃度的增加，木聚糖酶活性先增加后減少(P<0.001)，當氮源質量濃度為0.4 g/L時，木聚糖酶的活性最高，達95.31 U/mL，與基礎培養基相比，木聚糖酶產量增加了26.93%。當氮源質量濃度<0.4 g/L時，木霉菌由于氮源不足，生長緩慢，不利于酶的合成。當氮源質量濃度過高，木霉菌快速生長，培養基中溫度過高，導致木聚糖酶合成水平下降。

2.6 果渣質量分數對木聚糖酶活性的影響

如圖2-c所示，隨著果渣質量分數的增加，木聚糖酶的活性呈現先增加后減少的趨勢(P<0.001)。當果渣質量分數為30%時，木聚糖酶活性最高，達到78.15 U/mL。當果渣質量分數較低時，培養基中碳源質量濃度太低導致木聚糖酶產量降低。當果渣質量分數較高時，培養基中水含量較少，里氏木霉和綠色木霉無法分散利用大量的碳源，且大量微生物聚集生長導致培養基中溫度過高，溶解氧的濃度太低，菌體對水分及溶解氧的競爭，導致木聚糖酶產量降低。

2.7 接種質量分數對木聚糖酶活性的影響

如圖2-d所示，隨著接種質量分數的增加，木聚糖酶的活性表現為先增加后減少的趨勢(P<0.001)。當接種質量分數為12%時，木聚糖酶的活性最高，達到78.00 U/mL。當接種質量分數<12%時，生物量過低，使產酶周期延長，產酶量降低。當接種質量分數>12%時，發酵前期菌體生長過快，造成培養基中溶解氧水平不足，且大量微生物生長導致培養基中局部溫度過高，從而使產酶量下降。

2.8 正交優化里氏木霉和綠色木霉共發酵的培養基

里氏木霉和綠色木霉共發酵培養基的正交試驗與方差分析結果見表2、表3。從表2中的極差分析可知，里氏木霉和綠色木霉共發酵的培養基最佳條件是A3B3C3D2，即氮源0.5 g/L，果渣質量分數35%，接種質量分數14%，pH 5.50。正交試驗中最佳培養基條件為A3B1C3D2，即氮源0.5 g/L，果渣的質量分數25%，接種質量分數14%，pH 5.50。對A3B3C3D2和A3B1C3D2兩組培養條件進行對比實驗，結果表明A3B1C3D2條件下木聚糖酶的活性更高，為121.62 U/mL，與第7組實驗結果相似(表2)。所以里氏木霉和綠色木霉共發酵的培養基最佳條件是氮源0.5 g/L，果渣質量分數25%，接種質量分數14%，pH 5.50。

對正交試驗結果進行方差分析(表3)，在里氏木霉和綠色木霉共發酵工藝正交試驗所選擇的因素和水平范圍內，因素A、B、C和D的影響均達到了極顯著性水平(P<0.001)，即氮源質量濃度、果渣質量分數、接種質量分數和pH均對培養基中木聚糖酶的活性有顯著影響。從表2的極差分析可知，各因素對里氏木霉和綠色木霉共發酵培養基溶液中木聚糖酶的活性影響的主次順序為氮源質量濃度(A)>pH(D)>接種質量分數(C)>果渣質量分數(B)。

表2 培養基條件的正交試驗結果Table 2 Orthogonal experimental results of the medium conditions

表3 方差分析結果Table 3 Analysis of variance results

2.9 無機離子對木聚糖酶產量的影響

如圖3所示，添加CoCl2，FeSO4，MgSO4，MnSO4，ZnCl2后，隨著無機離子濃度的增加，木聚糖酶活性均呈現先增加后減少的趨勢。添加低濃度CoCl2后，木聚糖酶活性顯著增加。當CoCl2質量濃度為1 mg/L時，木聚糖酶活性最高，為77.57 U/mL。繼續添加CoCl2后，會抑制木聚糖酶的產生。只有FeSO4質量濃度為12～15 mg/L時，添加FeSO4才會提高木聚糖酶的產量，木聚糖酶活性分別為75.35和76.65 U/mL。FeSO4濃度太低或者太高時都會抑制木聚糖酶的活性。添加少量的MgSO4會促進木聚糖酶的產生，當MgSO4質量濃度為12 mg/L時，木聚糖酶的活性最高，為80.79 U/mL。當MgSO4質量濃度高于15 mg/L時，MgSO4的添加會抑制木聚糖酶的產生。當MnSO4質量濃度為1.4 mg/L時，木聚糖酶的活性最高，達84.74 U/mL。繼續添加MnSO4，木聚糖酶活性逐漸降低，當MnSO4質量濃度高于3 mg/L時，MnSO4的添加會抑制木聚糖酶的產生。當ZnCl2質量濃度<1.6 mg/L時，培養基溶液中木聚糖酶的活性均高于未添加時木聚糖酶的活性，分別為75.27、75.87和76.56 U/mL。當ZnCl2質量濃度高于1.6 mg/L時，木聚糖酶的活性逐漸降低，且培養基溶液中木聚糖酶的活性均低于未添加ZnCl2時木聚糖酶的活性，ZnCl2的添加抑制了里氏木霉和綠色木霉共發酵產生木聚糖酶。由于MgSO4和MnSO4的添加對木聚糖酶產量的影響相對于其他3種離子的影響較大，為了節約資源以及簡化實驗，所以在培養基中添加12 mg/L MgSO4和1.4 mg/L MnSO4。

a-CoCl2；b-FeSO4；c-MgSO4；d-MnSO4；e-ZnCl2圖3 無機離子對木聚糖酶活性的影響Fig.3 The effect of inorganic ions on the xylanase activity

結合正交試驗的結果，里氏木霉和綠色木霉共發酵產生木聚糖酶的最佳培養基為氮源(NH4NO3)質量濃度0.5 g/L，果渣質量分數25%，里氏木霉與綠色木霉的質量比例3∶2，接種質量分數14%，pH 5.50，并添加12 mg/L MgSO4和1.4 mg/L MnSO4，28 ℃下培養4 d。在最優培養基條件下重復培養3次，培養基溶液中木聚糖酶活性達(127.25±0.09) U/mL，與基礎培養基相比，木聚糖酶產量增加了69.46%。

3 結論

木聚糖酶為誘導性酶，選擇合適培養基底物和最佳的培養基組成很關鍵。本實驗以黑果腺肋花楸作為主要培養基原料，通過單因素試驗和正交試驗，優化了里氏木霉和綠色木霉共發酵黑果腺肋花楸生產木聚糖酶的培養基，并探究了添加無機離子對木聚糖酶產量的影響。

方差分析結果表明對木聚糖酶的活性影響的主次順序為氮源濃度(A)>pH(D)>接種質量分數(C)>果渣質量分數(B)。極差分析表明最佳培養條件為A3B3C3D2，但正交試驗中最佳條件是A3B1C3D2與極差分析結果不同。對A3B3C3D2和A3B1C3D2兩組條件進行對比實驗，A3B1C3D2條件下木聚糖酶的活性更高，為121.62 U/mL，所以里氏木霉和綠色木霉共發酵黑果腺肋花楸生產木聚糖酶的最佳培養條件為A3B1C3D2，即氮源(NH4NO3)質量濃度0.5 g/L，果渣質量分數25%，里氏木霉與綠色木霉的質量比例3∶2，接種質量分數14%，pH 5.50，培養4 d。CoCl2，FeSO4，MgSO4，MnSO4，ZnCl2分別在添加1、15、12、1.4和1.6 mg/L時效果最佳，過多或者過少的無機離子都會抑制木聚糖酶的產生。但是MgSO4和MnSO4對里氏木霉和綠色木霉共發酵產木聚糖酶的影響高于CoCl2，FeSO4和ZnCl2。為了降低實驗成本以及簡化實驗步驟，選擇添加量是MgSO4為12 mg/L和MnSO4為1.4 mg/L。在上述條件下28 ℃培養4 d后木聚糖酶的活性高達(127.25±0.09) U/mL，與基礎培養基相比，木聚糖酶產量增加了69.46%。