冠突散囊菌對酒曲糖化能力的影響及其機制研究

楊鳳英，秦洋*

1(邵陽學院 食品與化學工程學院，湖南 邵陽，422000) 2(生態釀酒新技術與應用湖南省高校重點實驗室(邵陽學院)，湖南 邵陽，422000)

高粱、糯米、小麥、大米、玉米作為五糧型白酒釀造的主要原料，高含量的支鏈淀粉直接影響白酒的產量[1]。所以提高出酒率、糖化效率是釀酒工作的重點[2]，對白酒生產具有重要意義。

酒曲微生物區系分為霉菌(糖化)、細菌(產香)和酵母菌(發酵)，其中根霉屬為起到糖化作用的主要微生物[3]。通過適宜的方式提高酒曲糖化能力，是當前研究熱點之一。研究顯示，冠突散囊菌(Eurotiumcritatum)能夠分泌淀粉酶，將淀粉分解為小分子糖，供自身生長，且生長條件與霉菌相似[4]。這一生物學性質為E.critatum與根霉屬的協同糖化提供了重要的理論依據。此外，E.critatum作為一種益生菌，具有抑菌、降血糖、抗氧化等功效[5-6]。然而，在食品發酵領域，主要應用于茶葉、谷類等發酵[5,7]，在白酒釀造領域的研究鮮有報道。因此，利用E.critatum與根霉協同糖化并研究其影響機制，具有重要的意義及創新性。

糖化的本質是淀粉的水解[8]。因此，淀粉分子的一系列變化，包括直鏈淀粉比例、分子聚合度、晶體結構、微觀形態等均能夠直觀地反映出糖化的效率[9-10]。隨著現代分析手段的不斷發展，從淀粉分子的系列變化分析糖化效率發生改變的作用機制，已成為不可或缺的分析手段。

本實驗中，采用E.critatum與根霉協同糖化，通過添加E.critatum、酵母菌、根霉(以甜酒曲作為載體)和無菌水培養的酒曲，在相同條件下對糧醅進行糖化發酵。通過分析糧醅還原糖含量分析E.critatum對酒曲糖化能力的影響，并得出最佳的糖化工藝。同時，通過分析酒曲淀粉分子的系列變化分析E.critatum對酒曲糖化能力的影響機理，為E.critatum在白酒糖化發酵領域的應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：五糧，市售；制曲原料(小麥、稻殼等)，湖南湘窖酒業股份有限公司。

菌種：E.critatum，北京北納創聯生物技術研究院；釀酒酵母，本實驗室保存；甜酒曲(根霉菌約為1×106CFU/mL)，安琪酵母股份有限公司。

96%直鏈淀粉、87.2%支鏈淀粉、聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate, PMMA)，北京中科質檢生物技術有限公司；C6H12O6、NaOH、HCl,均為分析純，上?？道噬锟萍加邢薰?；DMSO試劑(色譜純)，南京化學試劑股份有限公司；察氏瓊脂培養基，YPD培養基，杭州西頓生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

HR-T16M臺式高速冷凍離心機，湖南赫西儀器裝備有限公司；XD-3型X射線衍射儀、Tescan Mi-ra3掃描電子顯微鏡，上海永傲精密儀器有限公司；Epoch全波長酶標儀、1525型凝膠滲透色譜儀、2414檢測器、Agilent PLgel 5 μm MIXED-C色譜柱，美國沃特世有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗室進行糧食預處理

選擇無霉變的糧食，將玉米粉碎至20目，按照經典五糧配方[11]，每份樣品50 g糧食(干重)，3組平行，進行溫水潤糧12 h，用紗布過濾水分，放入蒸鍋中蒸2.5 h，將蒸好的糧食攤涼至35 ℃，裝罐。

1.3.2 菌懸液的準備

將E.critatum在察氏瓊脂培養基上活化，酵母菌在YPD培養基上活化，選取長勢較好的單菌落，在液體培養基上擴培。分別在恒溫振蕩器上28 ℃、150 r/min培養5 d，30 ℃、150 r/min培養12 h得到實驗菌種，最終E.critatum濃度約為(1×105CFU/mL)，酵母菌濃度約為(1×106CFU/mL)。

1.3.3E.critatum與甜酒曲對糧醅糖化效率的影響

將30份100 g糯米浸泡12 h，用紗布過濾水分，蒸30 min，冷卻至35 ℃裝罐，分別加入5、10、15、20、25 mLE.critatum菌液，甜酒曲為0.4 g/100 g，3組平行，攪拌均勻，密封放置于培養箱，32 ℃培養糖化5 d，測定糧醅還原糖含量。

分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/100 g甜酒曲，E.critatum菌液20 mL/100 g，方法同上進行糖化。

1.3.4 單因素試驗

1.3.4.1E.critatum菌液添加量的確定

100 g空白曲中分別加入0、5、10、15、20、25 mLE.critatum菌液，酵母菌6 mL/100 g，甜酒曲2 g/100 g，水分含量44%，制成不同濃度的E.critatum的酒曲在曲房進行培養，分別取10 g曲粉到1.3.1糧食樣品中，進行實驗室釀酒實驗，32 ℃發酵7 d，根據糧醅還原糖含量優選3個較好的E.critatum添加量進行后續響應面優化實驗。

1.3.4.2 酵母菌液添加量的確定

酵母菌在白酒釀造過程中不可缺失，是白酒釀造微生物中重要的菌群之一。方法同上，分別加入0、2、4、6、8、10 mL/100 g酵母菌菌液，E.critatum15 mL/100 g，甜酒曲2 g/100 g，水分含量44%，根據糧醅還原糖含量優選3個較好的酵母菌液添加量進行后續響應面優化實驗。

1.3.4.3 甜酒曲添加量的確定

傳統酒曲中主要是根霉起到糖化作用，為了區分根霉的添加是否會影響E.critatum對酒曲的糖化能力。方法同上，分別加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/100 g甜酒曲，E.critatum15 mL/100 g，水分含量44%，酵母菌菌液6 mL/100 g，根據糧醅還原糖含量優選3個較好的甜酒曲添加量進行后續響應面優化實驗。

1.3.4.4 酒曲水分含量的確定

為了區分是菌種對酒曲本身還是水分含量的作用，方法同上，水分含量分別控制在26%、32%、38%、44%、50%、56%，E.critatum15 mL/100 g，甜酒曲2 g/100 g，酵母菌菌液6 mL/100 g，根據糧醅還原糖含量優選3個較好的水分含量進行后續響應面優化實驗。

1.3.5 響應面分析實驗

按表1制成不同的酒曲，方法同1.3.4，采用 Box-Behnken設計原理進行響應面分析實驗。

表1 響應面實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3.6 糧醅還原糖含量和酸度測定方法

參照DB34/T 2264—2014《固態發酵酒醅分析方法》。

1.3.7 酒曲淀粉提取

酒曲浸泡2 h后打漿，漿液過80目篩，靜置倒出上清液，沉淀用0.2%(質量分數)NaOH溶液[12]浸提攪拌4 h(料液比1∶5,g∶mL)，倒出上清液，用純水洗至清澈，4 000 r/min離心10 min，刮掉上層黃色物，洗滌沉淀重復離心3次，將淀粉沉淀在40 ℃下烘干24 h，過200目篩保存。

1.3.8 酒曲支/直鏈淀粉含量測定方法

參照焦夢悅等[13]的雙標單波長法測支鏈淀粉含量，以吸光度為縱坐標，支鏈淀粉含量為橫坐標，繪制標準曲線。標準曲線方程為y=-0.007 3x+0.795 7，R2=0.997 4。直鏈淀粉含量按公式(1)計算：

直鏈淀粉含量=100%-支鏈淀粉含量

(1)

1.3.9 酒曲淀粉分子質量分布測量

依次將分子質量為0、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%的PMMA標準品過柱并記錄各自的保留時間。以分子質量(Da)為縱坐標，保留時間(min)為橫坐標繪制標準曲線，標準曲線方程為y=-0.586 4x+13.059，R2=0.998 4，之后將待測淀粉樣品溶解過柱，根據其保留時間按照標準曲線方程計算其分子質量分布。

凝膠滲透色譜(gel permeation chromatography, GPC)前處理方法：8 mg樣品溶于4 mL DMSO試劑，溶解6 h，用0.45 μm濾膜過濾后上機測試。檢測條件：Waters 2414示差檢測器，色譜柱Agilent PLgel 5 μm MIXED-C，流動相為DMSO試劑，流速1 mL/min，2 mg/mL，進樣50 μL，檢測柱溫35 ℃，檢測35 min[14]。

1.3.10 酒曲淀粉微觀結構

參照陳青[15]的方法進行測定。

1.3.11 酒曲淀粉結晶度

前處理方法：直接上機。操作條件為：起始角2θ為10°，終止角2θ為80°，掃描速度8 °/min，參照SUN等[16]的方法進行實驗。

1.4 數據處理

運用SPSS Statistics 22軟件進行數據處理分析，且每組實驗重復3次(結果均以平均值±標準差表示)并進行相關性分析，應用Origin 2019畫圖。

2 結果與分析

2.1 E.critatum與甜酒曲對糧醅糖化效率的影響

如圖1-a和圖1-b所示，當甜酒曲添加量低于0.6 g/100 g時，E.critatum低于15 mL/100 g時，糧醅還原糖含量逐漸上升，由此可知，甜酒曲中的根霉與E.critatum具有良好的協同糖化作用，甜酒曲高于0.6 g/100 g時，E.critatum高于15 mL/100 g時，這種趨勢不再明顯，可能原因是E.critatum與根霉數量增加，在有限的O2和碳源條件下，不再進行糖化作用。所以，適宜的E.critatum與甜酒曲添加量在合適的條件下具有良好的協同糖化作用。

a-甜酒曲；b-E.critatum菌液圖1 甜酒曲、E.critatum菌液對糧醅 還原糖含量的影響Fig.1 Effects on the reducing sugar content of fermented grains by Jiuqu and E.critatum

2.2 E.critatum對酒曲糖化能力的影響

圖2-a結果顯示，當E.critatum菌液添加量低于10 mL/100 g時，糧醅還原糖含量隨E.critatum的增加而增加?？梢娫谝欢ǚ秶鷥?，E.critatum有利于酒曲的協同糖化作用。當E.critatum添加量高于10 mL/100 g時，這種趨勢不再明顯?？赡艿脑蚴谴罅康木涸谂嗲^程中需要足夠的碳源，與細菌、酵母有一定的競爭關系[17]，反而不利于E.critatum的生長繁殖[18]。糖化是在微酸性條件下進行，酸度過高不利于糧醅糖化，因此，較為理想的E.critatum添加量為10 mL/100 g。

2.3 酵母菌對酒曲糖化能力的影響

圖2-b結果顯示，當酵母菌液添加量低于4 mL/100 g時，酒曲在培養過程中，合適的酵母菌菌液增加與霉菌的生長與代謝保持較高的協同性，酒曲具有良好的糖化能力，還原糖含量增加。當酵母菌液添加量高于4 mL/100 g時，這種趨勢不再明顯，可能的原因是過量的酵母菌在酒曲培養過程中將小分子糖發酵為酒精[19]，抑制酒曲中糖化作用的微生物生長，發酵的糧醅酸度緩慢上升，還原糖逐漸下降[20]。所以適當添加酵母有利于酒曲培養過程中酵母、根霉的相互適應及良好生長。因此，較為理想的酵母液添加量為4 mL/100 g。

2.4 甜酒曲對酒曲糖化能力的影響

如圖2-c所示，當甜酒曲添加量低于1.0 g/100 g時，糧醅還原糖含量隨甜酒曲的增加而增加?？梢娫谝欢ǚ秶鷥?，根霉菌有利于酒曲的協同糖化作用。當甜酒曲添加量高于1.0 g/100 g時，這種趨勢不再明顯，糧醅酸度隨著甜酒曲的增加而增加?？赡艿脑蚴撬岫冗^高不利于E.critatum與根霉菌的糖化，糧醅還原糖含量緩慢降低[21]。因此，較為理想的甜酒曲添加量為1.0 g/100 g。

a-E.critatum菌液；b-酵母菌液；c-甜酒曲；d-酒曲水分含量圖2 E.critatum菌液、酵母菌液、甜酒曲、水分含量對糧醅還原糖含量和酸度的影響Fig.2 Effects of E.critatum liquid, yeast liquid, Jiuqu and water content on the reducing sugar content and acidity of fermented grains

2.5 水分對酒曲糖化能力的影響

圖2-d結果顯示，當水分含量低于38%時，糧醅還原糖含量隨水分含量的增加而增加?？梢娫谝欢ǚ秶鷥?，水分有利于酒曲中糖化作用微生物生長，有利于酒曲的協同糖化作用。當水分含量高于38%時，這種趨勢不再明顯?？赡艿脑蚴撬趾窟^高時，微生物生長緩慢。水分含量過低時曲坯中水分散失過快，不利于微生物的生長代謝活動[22]。糧醅酸度變化與還原糖含量變化趨勢一樣，因此，較為理想的水分含量為38%。

2.6 響應面分析結果

2.6.1 響應面結果

由響應面優化設計得出最佳還原糖含量的計算如公式(2)所示：

還原糖含量=6.54-0.21A+0.46B+0.41C-0.48D+0.092AB-0.62AC+0.47AD+0.22BC+0.24BD-0.40CD-1.81A2-0.80B2-0.90C2-1.00D2

(2)

2.6.2 方差及可信度分析

由表2可知，模型差異極顯著；失擬項差異不顯著。4個因素均對響應指標糧醅還原糖含量具有顯著影響，對糧醅還原糖含量的影響程度大小為D>B>C>A。Pred R2與Adj R2差值小于0.2。F值越大，說明兩兩交互作用越好，AC兩兩交互作用最佳，其次為AD。圖3結果與響應面二次模型方差分析結果一致。坡度相對陡峭，表明響應值對于處理條件的改變非常敏感。

表2 回歸模型的方差分析及顯著性結果Table 2 Analysis of variance and significance results of regression model

圖3 AC和AD因素交互作用對還原糖含量 影響的響應曲面Fig.3 Response surface of the interaction of AC and AD factors on reducing sugar content

2.6.3 驗證實驗

通過Design-Expert 10軟件進行數據分析，得到酒曲的最優條件：考慮實際生產條件，最佳發酵條件調整添加量為酵母菌為3.68 mL/100 g，E.critatum為11.43 mL/100 g，甜酒曲為1.692 g/100 g，水分為36.08%。進行3次驗證實驗，實驗糧醅還原糖含量為(6.95±0.25) g/100 g，與模型預測值差異不大。

因此，由上述實驗結果可知：E.critatum有助于酒曲的協同糖化，提高了糧醅糖化效率。

2.7 E.critatum對酒曲直鏈淀粉含量的影響

通過研究優化組酒曲淀粉(樣品A)與傳統酒曲淀粉(樣品B)的系列變化分析E.critatum對酒曲糖化能力的作用機制。

由1.3.8計算出樣品A、樣品B和制曲原料小麥支鏈淀粉含量分別為(57.26±1.49)%、(60.49±1.44)%、(67.74±1.54)%；直鏈淀粉含量分別為(42.74±1.11)%、(39.51±1.39)%、(32.26±1.24)%；支直比分別為1.34∶1、1.53∶1、2.10∶1。

在E.critatum對酒曲直鏈淀粉含量的影響下。樣品A的支鏈淀粉含量相對于小麥降低了10.48%，比樣品B降低了3.23%，樣品A直鏈淀粉含量相對于小麥增加了，比樣品B高。支鏈淀粉被酶水解為直鏈淀粉，淀粉的支直比越低，表明支鏈淀粉含量水解程度越高[23]即冠突散囊菌促進了淀粉分子的水解作用。酒曲作為投糧產生作用，可以提高糧食利用率[24]?？梢?，E.critatum有利于酒曲的協同糖化作用。

2.8 E.critatum對酒曲淀粉分子質量分布的影響

由表3可知，樣品A淀粉分子質量0.2×105～1.0×105Da的占比為64%，B占比為59%；淀粉分子質量20 000 Da以下樣品A占比為25%，B占比為30%。說明樣品A淀粉分子質量分布越小，越集中。B平均分子質量為96 930 Da，A為94 325 Da，平均分子質量比B小，表明小分子淀粉含量增加。由2.7可知，樣品A的直鏈淀粉含量比B高，可以推測經過E.critatum對酒曲的協同糖化作用后，部分大分子淀粉被水解而導致淀粉平均分子質量降低[25]，說明實驗組酒曲將淀粉大分子水解的能力比傳統酒曲強。

表3 實驗組酒曲(樣品A)與傳統酒曲(樣品B)的 淀粉GPC結果Table 3 GPC results of experimental group Jiuqu starch (sample A) and traditional Jiuqu starch (sample B)

2.9 E.critatum對酒曲淀粉微觀結構的影響

由圖4可知，兩者淀粉分子呈扁圓形、不規則形態，直徑在20 μm左右，小于10 μm淀粉顆粒表面比較光滑。樣品A大多數淀粉上有裂紋，裂紋處有大凹痕和小孔，樣品B淀粉上有少許凹痕，相對于A，淀粉B比較圓潤，小顆粒淀粉占比多于A，由GPC數據得出，樣品A淀粉分子質量分布小于B，比B集中，與掃描電鏡結果符合。從2.7得知，樣品B直鏈淀粉含量比A低[26]，直鏈淀粉處于淀粉顆粒內部，支鏈淀粉分布在外層，A淀粉表面支鏈淀粉被分解為小分子淀粉，說明E.critatum對酒曲的協同糖化會對淀粉顆粒有分解作用。

a-實驗組酒曲；b-傳統酒曲圖4 酒曲的淀粉掃描電鏡圖Fig.4 SEM photographs of Jiuqu starches

2.10 E.critatum對酒曲淀粉結晶度的影響

如圖5所示，樣品A和B淀粉的X-射線衍射均在2θ為15°、17°、18°、20°、23°、27°出現峰值，A在2θ為27°峰比較明顯，有研究發現小麥粉的淀粉在2θ為15°、17°、18°、23°出現峰值，小麥淀粉結晶度是20%～23%[27]。樣品A淀粉的結晶度為17.96%，B淀粉的結晶度為18.92%，相對于小麥淀粉結晶度有所降低，可能原因是B小顆粒淀粉占比多于A，A直鏈淀粉含量高，造成結晶度低，所以E.critatum對酒曲的協同糖化可以促進支鏈淀粉的水解，使直鏈淀粉增加，淀粉結晶度與直鏈淀粉含量相關[28]，淀粉顆粒上的裂紋導致A淀粉結晶度減弱，減少了結晶面積[29]。

圖5 酒曲淀粉X-衍射圖Fig.5 XRD curves of Jiuqu starches

綜上，實驗組A的直鏈淀粉含量增加，淀粉平均分子質量減少，掃描電鏡圖顯示高含量的直鏈淀粉和淀粉顆粒上的裂紋造成了A淀粉結晶度比B結晶度低，E.critatum對酒曲的協同糖化作用明顯比傳統酒曲水解支鏈淀粉能力增強，糖化作用增強。

3 結論

本研究結果顯示，E.critatum可以提高糧醅的還原糖含量，提高酒曲的糖化效率，最佳條件為酵母菌添加量為3.68 mL/100 g，E.critatum添加量為11.43 mL/100 g，甜酒曲添加量為1.692 g/100 g，酒曲水分含量為36.08%；添加有E.critatum的實驗組酒曲直鏈淀粉含量增加，GPC顯示淀粉分子質量降低，掃描電鏡圖淀粉結構變化明顯，X-衍射結晶度降低，晶體結構明顯，這些現象表明淀粉分子表達了E.critatum與根霉協同糖化下的作用機理。

本實驗培曲條件有限，培曲的量與實際培曲有差別，采用的是實驗室釀酒實驗，沒有進行工業化，但是得到的結果比較明顯，后續可基于E.critatum的糖化機理，作用于其他酒曲和白酒工業化生產，以提高酒曲糖化能力，并提高糧食利用率和出酒率。