渝黔地區細菌發酵型豆豉食用安全性及風味特點比較分析

楊智博，譚小琴，周才瓊,2*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(重慶市特色食品工程技術研究中心，重慶，400715)

細菌型豆豉是一種主要利用枯草芽孢桿菌在較高溫度下于蒸熟大豆上發酵而成的豆豉，通過其蛋白酶生產出獨特的風味[1-2]。我國細菌型豆豉歷史久遠，主要分布于重慶、貴州、四川、山東和云南等地，傳統細菌發酵型豆豉多在冬天生產，一般是將大豆浸泡后蒸至軟熟，然后用紗布包裹后置于洗凈后控干水分的鳶尾草中(利用鳶尾草作為天然枯草芽孢桿菌源)，置于溫暖的火塘邊發酵，產生白色絲狀物后即發酵完成，然后會根據當地環境條件和食用方式進行相應處理，短期食用的一般拌料后直接食用或加煮豆水直接食用(濕豆豉)，其中添加煮豆水的稱“水豆豉”；如需長期食用，則會采用風干或烘干的方式使豆豉脫水至含水量在25%左右(干豆豉)。

目前對于細菌型豆豉的研究報道多集中在豆豉的特性及功能性成分[1,3]和發酵菌株篩選及工藝優化[4-5]等。但目前我國細菌型豆豉的生產多為作坊式并采用傳統自然發酵工藝，受環境條件和發酵原材料等因素的影響，豆豉產品品質差異較大，甚至可能會引起一些食品衛生和安全問題[6-10]，包括原輔料安全性問題[11]、微生物安全性問題[12]、化學性及工藝控制[13-15]危害和物理性[16]危害等。傳統細菌型豆豉制作過程中發酵菌種多采用帶枯草芽孢桿菌的稻草或鳶尾草等為菌源，常會摻雜其他菌種，發酵品質把控多依靠個人的經驗，豆豉產品的風味還受產地喜好性影響，風味存在一定的隨機性[17-18]，本研究在采集樣品過程中就發現部分干型的細菌發酵豆豉樣品有特別的臭襪子或汗臭氣味。

考慮細菌發酵型豆豉生產方式及發酵完成后不同的處理方式，可能帶來食品衛生安全問題。同時風干或烘干過程中會形成臭味，因此有必要對其食品衛生和風味進行深入的研究，以引導安全消費并為后續細菌發酵型豆豉商品化提供相關風味的支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

豆豉樣品：以貴州和重慶各地農貿市場為采樣點，共采集了17個樣品，每個樣品2 kg。為方便比較分析，以樣品拌料后直接食用或加煮豆水食用者為濕豆豉，以拌料后風干者為干豆豉。樣品名稱、產地如表1所示。

表1 細菌發酵型豆豉種類及產地Table 1 Types of different bacterial-fermented Douchi samples and their originality

1.2 主要試劑

葡萄糖、DNS、茚三酮、MgO、硼酸、三氯乙酸、乙酸鋅、硼砂、對氨基苯磺酸、Na2S2O3、石油醚、甲基紅，重慶市鈦新化工有限公司；鹽酸、三氯甲烷，重慶川東化工(集團)有限公司；AgNO3、酚酞、冰乙酸、可溶性淀粉，成都市科隆化學品有限公司；鹽酸萘乙二胺、K2CrO4，上海麥克林生化科技有限公司；硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)、KI，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；K4Fe(CN)6，大連美侖生物技術有限公司；亞甲基藍，上海源葉生物科技有限公司；以上均為分析純。亮氨酸，中國食品藥品檢定研究院。

1.3 主要儀器設備

FA2004A電子天平，上海精天電子儀器有限公司；DHG-9245A電熱恒溫鼓風干燥箱，上海齊欣科學儀器有限公司；722型可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；ZD-85氣浴恒溫振蕩器，常州朗越儀器制造有限公司；TG16G高速離心機，常州崢嶸儀器有限公司；AQ-180E食品磨粉機，慈溪市耐歐電器有限公司；LGJ-10真空冷凍干燥機，上海風褚實業有限公司；GCMS-QP2010氣相色譜質譜聯用儀，日本島津公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 水分含量測定

參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標準 食品中水分的測定》，采用直接干燥法測定。

1.4.2 理化及微生物指標分析

揮發性鹽基氮(total volatile basic nitrogen，TVB-N值)參照GB/T 5009.228—2016《食品安全國家標準 食品中揮發性鹽基氮的測定》，采用半微量凱氏定氮法測定；亞硝酸鹽含量參照GB 5009.33—2016《食品安全國家標準 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中鹽酸萘乙二胺法測定；TBA值的測定參照章佳佳等[19]的方法；過氧化值(peroxide value，POV)的測定參照GB 5009.227—2016《食品安全國家標準 食品中過氧化值的測定》中滴定法；菌落總數按照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》中傾注法平板計數；乳酸菌按照GB 4789.35—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》中涂布法平板計數；霉菌和酵母菌參照GB 4789.15—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》涂布平板法計數。

1.4.3 風味特點分析

滋味品質分析：總酸測定采用GB 12456—2021《食品安全國家標準 食品中總酸的測定》中酸堿滴定法；總可溶性糖采用DNS比色法[20]，標準曲線(r2=0.999；y=0.673 5x-0.017 7)；游離氨基酸采用茚三酮比色法[21]，標準曲線(r2=0.999；y=0.024 2x-0.000 4)；NaCl測定采用GB 5009.44—2016《食品安全國家標準 食品中氯化物的測定》中銀量法。

揮發性風味分析[22]：采用頂空-固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用法(headspace solid-phase microextraction-mass spectrometry coupled with gas chromatography-mass spectrometry, HS-SPME-GC-MS)。取5 g粉碎后的樣品，放入15 mL固相微萃取樣品瓶中，密封。將已經高溫凈化的固相微萃取針頭插入，將萃取纖維頭推出暴露到樣品瓶頂空中，60 ℃水浴萃取20 min，最后將萃取頭插入GC-MS，進樣器中解吸。

定性定量分析：將GC-MS中各樣品圖譜每個峰與NISTlibrary和Wiley library 2個檢索庫中相關化合物按相似度>800(最大值1 000)進行匹配，按峰面積歸一法計算各組分相對含量。

1.5 數據處理

結果以平均值±標準差表示，采用Origin 2019作圖，SPSS 20.0進行主成分分析。

2 結果與分析

2.1 渝黔地區細菌發酵型豆豉含水量特點

采集渝黔地區不同產地傳統細菌發酵型干豆豉和濕豆豉樣品17個，分析其含水量，見表2。含水量分布在16.42%～67.29%，其中濕豆豉平均含水量58.52%(變異系數11.41%)，干豆豉平均含水量23.72%(變異系數26.74%)(表4)，表明干豆豉含水量分布差異更大，從短期食用的高含水量濕豆豉到長期食用的低含水量干豆豉，含水量分布的差異受不同產地食用方式和保藏需要的影響。不同含水量不僅影響豆豉感官品質，也影響其貯藏性能和食用安全性，因此，有必要對市場中傳統細菌發酵型豆豉進行食品安全性分析和品質評價以引導合理消費，為細菌發酵型豆豉的商品化開發提供支持。

表2 細菌發酵型濕/干豆豉含水量及菌落總數Table 2 Water content and total viable counts in bacteria-fermented wet/dry Douchi

2.2 細菌發酵型豆豉食品衛生指標分析

2.2.1 微生物群系分析

發酵食品中微生物代謝及胞外酶有促進蛋白質和脂肪降解的作用，但微生物數量控制不當會影響產品品質。對采集各豆豉樣品菌落總數進行分析，結果見表2，各樣品菌落總數在5.0～8.4 lg CFU/g，與林榕姍[23]報道細菌型豆豉菌落總數在同一水平，表明細菌型豆豉產品在貯藏中菌落總數變化不大。在105～106稀釋倍數下未檢出酵母菌、霉菌和乳酸菌，原因可能是優勢菌芽孢桿菌抑制了其他菌種的生長。進一步對照《伯杰氏細菌鑒定手冊》進行微生物生理生化鑒定，發現各樣品中主要為枯草芽孢桿菌，其他有短小芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、球形芽孢桿菌、凝結芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和堅強芽孢桿菌，個別樣品檢出了漢遜酵母菌、乳桿菌和片球菌，表明豆豉在貯藏中仍處于持續發酵變化中。

2.2.2 脂肪氧化指標TBA值和POV分析

如圖1所示，各樣品TBA值在1.50～2.89 mg/100 g，干豆豉和濕豆豉TBA均值分別為1.98 mg/100 g(變異系數20.71%)和1.94 mg/100 g(變異系數14.20%)，干豆豉變異系數大于濕豆豉。

圖1 細菌型豆豉TBA含量Fig.1 TBA content of bacteria-femented Douchi

如圖2所示，各樣品POV均符合T/GZSX 014—2018豆豉標準中POV限量值(≤0.25 g/100 g)。濕豆豉和干豆豉POV均值分別為0.004 4 g/100 g(變異系數166.1%)和0.003 4 g/100 g(變異系數75.09%)(表4)，差異較大，表明不同豆豉樣品初級氧化產物差異大。這可能與市場不同豆豉樣品含水量差異、常溫貯藏條件及生產時間有關。

圖2 細菌型豆豉POV含量Fig.2 POV content of bacteria-fermented Douchi

2.2.3 TVB-N及亞硝酸鹽含量分析

TVB-N是蛋白質分解產生的氨以及胺類等堿性含氮物質，含量越高，表明氨基酸被破壞得越多。如圖3所示，各樣品TVB-N值在0.58～5.13 mg/g，濕豆豉TVB-N均值3.28 mg/g(變異系數43.96%)，干豆豉TVB-N均值1.72 mg/g(變異系數49.79%)(表4)，有顯著差異，與畜肉、蠔油、蝦醬的TVB-N上限值(依次分別為15、50、450 mg/100 g)相比處于較高水平[15]。濕豆豉TVB-N均值高于干豆豉，可能與高含水量下微生物活動導致蛋白質分解有關。

圖3 細菌型豆豉TVB-N含量Fig.3 TVB-N content of bacteria-fermented Douchi

如圖4所示，各樣品亞硝酸鹽含量在0.6～2.3 mg/kg，濕豆豉和干豆豉亞硝酸鹽含量均值分別為1.3 mg/kg(變異系數33.45%)和1.9 mg/kg(變異系數11.66%)，濕豆豉變異系數大于干豆豉。所有樣品亞硝酸鹽含量均遠低于GB 2760—2014食品添加劑使用標準規定的安全標準(≤30 mg/kg)，與GB 2762—2017《食品安全國家標準 食品中污染物限量》非有意添加自然生產的亞硝酸鹽(限量3～5 mg/kg)相比，均未超過限值，表明亞硝酸鹽含量較低，可安全食用。

圖4 細菌型豆豉亞硝酸鹽含量Fig.4 Nitrite content of bacteria-fermented Douchi

前述食品衛生分析顯示，市場上不同含水量傳統細菌型豆豉食品衛生指標差異較大，但均處于安全水平，可安全食用。

2.3 濕豆豉和干豆豉風味特點比較分析

2.3.1 滋味品質特點比較分析

滋味品質成分分析如表3，各樣品游離氨基酸、總酸、可溶性總糖和NaCl含量分別在0.17%～7.02%、0.30%～1.95%、1.57%～8.02%和2.95%～11.45%，差異較大。17號樣品中游離氨基酸、總酸和可溶性總糖均較高，10號和15號樣品總酸含量高；12號樣品鹽含量最高，分析結果顯示不同產地樣品具有差異性。

濕豆豉和干豆豉均值及變異系數分析如表4，濕豆豉游離氨基酸、總酸、可溶性總糖含量均值均低于干豆豉，變異系數高于干豆豉；干豆豉食鹽含量均值遠高于濕豆豉(二者變異系數接近)。這些差異來自大豆發酵、發酵完成后的拌料及豆豉貯藏中持續的發酵過程。表明不同地區豆豉滋味特征除了受發酵本身影響外，還受發酵后處理方式及當地對滋味的喜好有關，如拌料中添加的鹽、糖及味精等均影響豆豉的滋味特征。

表3 濕豆豉和干豆豉滋味品質成分分析(可食部)Table 3 Taste and quality components of wet and dry Douchi (edible part)

表4 濕豆豉和干豆豉含水量、衛生指標以及滋味 指標含量均值和變異系數Table 4 Mean values and coefficients of variation of water content, hygienic indexes, and taste indexes in wet and dry Douchi

2.3.2 濕豆豉和干豆豉揮發性風味成分比較分析

豆豉風味與發酵、拌料及拌料后的處理方式有關?？紤]含水量、地域等，抽取了干豆豉和濕豆豉各4個樣品，分析各樣品揮發性風味物質組成(表5)，共檢出79種風味物質。8個樣品依序分別檢出58、55、60、60、56、54、41和45種；1號和3號含量最高的為帶有刺激性氣味和汗臭味的異戊酸，分別為17.57%和16.36%；6號、10號和15號含量最高的為呈辛辣味的2-甲基丁酸，分別為13.12%、16.83%和17.81%；9號樣品帶新鮮橙子香的D-檸檬烯(18.68%)含量最高；12號樣品含量最高的為有苦味3-甲基戊酸(16.58%)；13號樣品中則為呈焙烤香的四甲基吡嗪(45.17%)含量最高。這些特征香氣顯示不同地域和加工方式的差異及風味的多樣性。

表5 渝黔地區細菌型豆豉揮發性風味物質分析Table 5 Relative content of volatile flavor substance of bacteria-fermented Douchi in Chongqing-Guizhou area

續表5

2.3.2.1 揮發性成分種類及含量變化

細菌型豆豉揮發性成分可分為羧酸類、酯類、醇類、吡嗪類、烴類、醚類、酮類和酚類等(圖5)，不同來源豆豉均以烴類物質種類最多，酮類和酚類較少。

圖5 渝黔地區細菌型豆豉揮發性成分種類的變化Fig.5 Variation of volatile components of bacteria-fermented Douchi in Chongqing-Guizhou area

從相對含量看，濕豆豉1、3、6、9號樣品中揮發性風味物質相對含量最高的依次分別是羧酸類(52.28%)、羧酸類(44.78%)、羧酸類+烴類(58.52%)和羧酸類+烴類(50.21%)，干豆豉10、12、13、15號樣品相對含量較高的依次分別是羧酸類(52.15%)、羧酸類(50.07%)、吡嗪類(56.88%)和羧酸類(53.95%)(圖6)。這可能與干豆豉失水方式有關，烘干時的高溫可能會產生具有烘炒香的吡嗪類，高含水的濕豆豉或緩慢風干方式制備的干豆豉則可能持續的發酵產酸等，使羧酸類增加。這些結果顯示渝黔地區細菌型豆豉風味特征主要受羧酸類和烴類物質影響。

圖6 渝黔地區細菌型豆豉揮發性成分含量的變化Fig.6 Changes of volatile components in bacteria-fermented Douchi in Chongqing-Guizhou area

2.3.2.2 揮發性物質主成分分析

對樣品中各類揮發性物質相對含量進行主成分分析，得到各主成分特征值、方差貢獻率、累計方差貢獻率(表6)，特征根λ1=3.716，λ2=2.852，λ3=1.358，前3個主成分累計方差貢獻率達88%，即涵蓋了大部分信息。

主成分特征向量與載荷值見表7，第1主成分與醇類高度正相關，與吡嗪類和其他類高度負相關，醇類物質對第1主成分貢獻最大；第2主成分與醚類和酚類高度正相關，醚類物質對第2主成分貢獻最大；第3主成分與酮類高度正相關，酮類物質對第3主成分貢獻最大。主成分分析結果顯示醇類、醚類、酮類和酚類也是豆豉風味重要貢獻者。

表6 主成分特征根和貢獻率Table 6 Principal component characteristic root and contribution rate

表7 主成分的特征向量與載荷Table 7 The eigenvectors and loads of principal components

2.3.2.3 揮發性物質歸類和氣味貢獻值(odor contribution value，OCV)分析

對揮發性氣味物質種類按香型特征進行歸類(圖7)，各樣品均具相當的辛辣刺激性氣味和甜味感，具有花果香和焙烤香，但13號樣品少了能產生出油脂味和苦味的物質，產生果香味的物質種類也較其他樣少，且含有由吲哚產生的腳臭味，這可能與其采用失水方法不同有關。

圖7 揮發性物質的氣味類型Fig.7 Odor types of volatile substances

查閱風味成分氣味閾值[24-25]，按公式(1)(2)分別計算氣味值(stink valve,SV)和OCV：

(1)

(2)

如表8和圖8所示，1、3、6、10、12和15號主要受帶苦味的3-甲基戊酸、玉蘭香的芳樟醇和/或檸檬香的D-檸檬烯影響，其中1、10、12和15號3-甲基戊酸OCV分別為39.73%、41.83%、40.01%和49.71%，苦味明顯；9號最高的是D-檸檬烯和芳樟醇(OCV合計43.17%)，帶檸檬和玉蘭香氣；13號樣品中SV最高的是2,3,5-三甲基吡嗪，其次是D-檸檬烯，焙烤香中帶有檸檬味。這表明不同來源及不同處理豆豉風味的巨大差異，包括持續發酵產生的苦味肽、干制溫度的影響及拌料中添加的姜米和橘皮帶來的風味等均參與了傳統細菌發酵豆豉風味的形成。

圖8 渝黔地區細菌型豆豉氣味貢獻值Fig.8 Odor contribution value of bacteria-fermented Douchi in Chongqing-Guizhou area

細菌發酵型豆豉，特別是經過風干或烘干的干豆豉，多帶有程度不同的汗臭或腳臭氣味，而成為1種地方性臭味美食，對于沒有消費習慣的人群較難接受。本研究發現各樣品均含具有腳臭和汗臭味的異戊酸，SV在0.796～32.537，OCV在0.04%～1.57%，均以13號最低，這可能與豆豉發酵后13號樣品采用的烘干方式有關。濕豆豉中不含或僅含少量吲哚，可賦予豆豉茉莉或孜然風味，隨著干制中含水量下降，吲哚含量升高，13號樣品中吲哚的SV和OCV分別達24.286和1.24%，使干制豆豉散發特有氣味。因此，豆豉發酵完成拌料后濕豆豉如何控制貯藏條件、干豆豉的干制方式及含水量控制都影響豆豉的風味，傳統細菌型豆豉的商品化還需要從貯藏和干制條件等做更多的研究。

表8 渝黔地區細菌型豆豉氣味值及其風味描述Table 8 Odor value and flavor description of bacteria-fermented Douchi in Chongqing-Guizhou area

3 結論

水分含量是食用品質的重要組成部分。經檢測分析渝黔地區17個細菌型豆豉樣品，結果顯示濕豆豉和干豆豉平均含水量分別為58.52%和23.72%，干豆豉含水量分布差異更大。

食品衛生指標分析顯示，濕豆豉和干豆豉TBA均值含量差異不大；POV差異較大，但均符合T/GZSX 014—2018標準限量(≤0.25 g/100 g)；濕豆豉和干豆豉的TVB-N值與畜肉、耗油等食品限量相比，處于較高水平，濕豆豉均值大于干豆豉；亞硝酸鹽含量遠低于GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》規定的安全標準(≤30 mg/kg)，也低于GB 2762—2017《食品安全國家標準 食品中污染物限量》非有意添加自然生產的亞硝酸鹽(限量3～5 mg/kg)限值。微生物分析顯示，各樣品菌落總數在5.0～8.4 lg CFU/g范圍內，在105～106稀釋倍數下未檢出酵母菌、霉菌和乳酸菌，進一步對照《伯杰氏細菌鑒定手冊》進行微生物生理生化鑒定，個別樣品檢出了漢遜酵母菌、乳桿菌和片球菌，表明豆豉在貯藏中仍處于持續發酵變化中。這些結果表明傳統細菌發酵型豆豉可安全食用。

滋味品質分析顯示，不同來源及不同含水量豆豉的酸、鮮、甜和咸的味感差異大，濕豆豉游離氨基酸、總酸和可溶性總糖含量均值低于干豆豉，變異系數高于干豆豉，干豆豉食鹽含量均值遠高于濕豆豉，這些差異來自大豆發酵、發酵完成后的拌料及豆豉貯藏中持續的發酵過程。揮發性風味成分分析顯示羧酸類、烴類、酯類和醇類是影響傳統細菌型豆豉主要的風味成分，且樣品均含具有汗臭或腳臭味的異戊酸，構成了細菌型豆豉特征風味，但13號樣品中主要為呈焙烤香的四甲基吡嗪，這可能與其干燥方式有關，該樣品還含較高的吲哚。其他樣品主要為羧酸類和烴類。不同地區在豆豉發酵完成后，由于對風味的喜好以及食用方式不同，采用的處理方式不同，從而導致風味產生差異。

本研究可為后續渝黔地區細菌發酵型豆豉合理貯藏、控制干制方式等提供理論依據，以提升豆豉的風味，并為細菌發酵型豆豉的商品化提供支持。

致謝：感謝西南大學食品科學學院實驗教學中心張玉老師為本研究提供GC-MS檢測服務。