葛根蛋白組分提取、抗氧化活性及功能特性研究

董紅影，王英博，龐會娜，肖鳳琴，張紅印，范琳，韓榮欣，嚴銘銘，邵帥

(長春中醫藥大學 吉林省中藥保健食品科技創新中心，吉林 長春，130117)

葛根為豆科植物野葛[Puerarialobata(Willd.)Ohwi]的干燥根，始載于《神農本草經》，具有解肌退熱、生津止渴、透疹、升陽止瀉、通經活絡和解酒毒等功效[1]?，F代研究表明，葛根在維持心血管系統穩定性、保護腦神經、抗氧化、防止肝腎損傷、改善代謝與免疫功能等方面均有顯著療效[2]。因此，藥用價值極高的葛根，素有“亞洲人參”之美譽。2002年葛根被國家衛生部正式批準成為首批“藥食同源”植物，市場上出現了大批含有葛根的保健食品，具有很高的應用價值和經濟價值。

研究表明，葛根中除了含有大量異黃酮類功效成分外，還含有豐富的淀粉、膳食纖維、礦物元素等營養成分，以及多種人體必需氨基酸，尤其是人體不能合成的必需氨基酸含量更高[3]。本課題組前期已經對葛根總蛋白的提取工藝及抗氧化活性進行了研究[4]，但是對于葛根分級蛋白的相關研究并未公開。因此，為了更好地開發葛根這一優質蛋白資源，本研究以葛根為原料，采用Osborne法對葛根蛋白進行分級提取，比較4種分級蛋白的理化特性和抗氧化活性，以及谷蛋白的功能特性。旨在為葛根蛋白的深入研究和對葛根資源進行更合理有效的利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葛根藥材，吉林省長春市同仁堂大藥房。

考馬斯亮藍G-250、牛血清白蛋白、甘油、PBS(pH 7.4)、丙烯酰胺、溴酚藍、四甲基乙二胺(N,N,N′,N′-tetramethylethylenediamine, TEMED)、維生素C、ABTS、低分子質量蛋白Marker，北京索萊寶科技有限公司；甲醇、無水乙醇，安耐吉化學；冰醋酸，天津市津東天正化學試劑廠；DPPH，上海麥克林生化科技股份有限公司；30%H2O2，索爾維集團；十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、過硫酸銨、FeCl3、NaCl、NaOH、NaH2PO4、Na2HPO4、K3[Fe(CN)6]、FeSO4·7H2O，西隴科學股份有限公司；三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)，天津化學試劑有限公司。所有試劑均為分析純。

UV-1700紫外分光光度計，日本島津(中國)有限公司；Mini-PROTEAN Tetra電泳儀，美國Bio-Rad公司；微型離心機，德國Sigma有限公司；DF-101S磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋，金壇市佳美儀器有限公司；A300全自動氨基酸分析儀，德國 membraPure GmbH公司；低溫離心機，美國貝克曼庫爾特有限公司；酶標儀，SW-CJ蘇州蘇潔凈化設備有限公司；FTIR-850傅里葉變換紅外光譜儀，天津港東公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 葛根蛋白組分提取

參考文獻[5]采用Osborne法對葛根蛋白進行分級提取，具體工藝如圖1所示。所得上清液A、B、C、D于4 ℃透析，冷凍干燥，分別得到清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。

圖1 葛根分級蛋白提取工藝流程圖Fig.1 Extraction process flow chart of P.lobata grading protein

1.2.2 葛根分級蛋白的定量和定性分析

1.2.2.1 考馬斯亮藍法測定分級蛋白含量

參照考馬斯亮藍說明書，分別吸取0、20、40、60、80、100、120 μL牛血清蛋白標準溶液(1 mg/mL)，加0.01 mol/L PBS補足至3 mL，考馬斯亮藍染色，采用紫外分光光度法在595 nm處測定不同濃度的蛋白質溶液吸光度。以不同濃度的牛血清蛋白為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標，繪制標準曲線。葛根分級蛋白樣品溶液用上述方法測定，由標準曲線求其質量分數。

1.2.2.2 SDS-PAGE電泳分析

參照LAEMMLI等[6]方法。分別將葛根蛋白組分與上樣緩沖液，按1∶1(體積比)混合，100 ℃煮沸5 min，冷卻至室溫，上樣。分離膠濃度12%、濃縮膠濃度5%，樣品上樣量20 μL。采用垂直板電泳，濃縮膠電壓70 mV，時間30 min，分離膠電壓140 mV，時間60 min。電泳結束后，采用考馬斯亮藍R250染色30 min，脫色后，Invitrogen iBright FL 1000掃描成像。

1.2.3 葛根分級蛋白的氨基酸組成測定

參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》方法。分別稱取葛根分級蛋白凍干樣品30.00 mg于水解管中，加入6 mol/L HCl溶液，抽真空，封管，110 ℃水解24 h，吸取800 μL水解液蒸干，用0.02 mol/L HCl溶液稀釋，采用A300全自動氨基酸分析儀進行測定。

1.2.4 葛根分級蛋白的二級結構測定

參照林鳳英[7]的方法，采用FT-IR進行葛根分級蛋白的二級結構測定。分別稱取葛根分級蛋白4 mg，與200 mg KBr粉末混合研磨壓片。以KBr作為空白對照，通過傅里葉變換紅外光譜儀在波數為500～4 000 cm-1測定吸收光譜，分辨率為4 cm-1。

1.2.5 葛根分級蛋白的體外抗氧化活性測定

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力

參照徐武等[8]的方法并略作修改。分別移取葛根分級蛋白溶液1 mL于試管中，加入2 mL 0.004%(質量分數) DPPH溶液，混勻于暗室反應30 min，在517 nm處測定吸光度值A1；空白組用1 mL蒸餾水代替樣品溶液，測定吸光度值A0；樣品對照組用2 mL甲醇代替DPPH溶液，測定吸光度值A2。以甲醇作為空白調零，維生素C作為陽性對照組，DPPH自由基清除率按公式(1)計算：

DPPH自由基清除率/%=[A0-(A1-A2)]/A0×100

(1)

1.2.5.2 ·OH清除能力

參照文獻[8]的方法并略作修改。分別移取葛根分級蛋白溶液1 mL于試管中，加入1 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液和1.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液，混勻，再加入1 mL 0.75 mmol/L FeSO4溶液和1 mL 0.01%(體積分數，下同)H2O2溶液，混勻，37 ℃水浴反應1 h，在536 nm處測定吸光度值A1；正常組以2 mL蒸餾水代替1 mL樣品溶液和1 mL 0.01% H2O2溶液，測定吸光度值A0；陰性組以1 mL蒸餾水代替樣品，測定吸光度值A2；樣品對照組以3 mL蒸餾水代替1 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液、1 mL 0.75 mmol/L FeSO4溶液、1 mL 0.01% H2O2溶液，測定吸光度值A3。以蒸餾水作為空白調零，維生素C作為陽性對照，·OH清除率按公式(2)計算：

·OH清除率/%=(A1-A3-A2)/(A0-A2)×100

(2)

1.2.5.3 ABTS陽離子自由基清除能力

參照文獻[8]的方法并略作修改。取0.4 mL ABTS陽離子儲備液，用pH 7.4磷酸鹽緩沖溶液稀釋，保持溶液在常溫下734 nm處吸光值為(0.7±0.02)，制成ABTS工作液。分別將200 mL ABTS工作液與10 mL不同濃度的樣品溶液混勻，室溫避光反應6 min，于734 nm處測定吸光值A1。用10 mL磷酸鹽緩沖溶液代替樣品溶液作為對照組，測定吸光值A0，以維生素C為陽性對照組，ABTS陽離子自由基清除率按公式(3)計算：

ABTS陽離子自由基清除率/%=[1-(A0-A1)/A0]×100

(3)

1.2.5.4 總還原能力

參照文獻[8]的方法并略作修改。分別稱取葛根分級蛋白溶液加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液和2.5 mL 1%(質量分數) K3Fe(CN)6溶液，50 ℃水浴反應20 min，冷卻，加入2.5 mL 10%(體積分數)三氯乙酸，離心，取上清液2.5 mL，依次加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%(質量分數) FeCl3溶液，搖勻，靜置，在700 nm處測定吸光度值A1；以2.5 mL蒸餾水代替2.5 mL 1% K3Fe(CN)6溶液，其余步驟相同，測定吸光度值A2。以蒸餾水作為空白調零，維生素C作為陽性對照組?？傔€原能力按公式(4)計算：

總還原能力=A1-A2

(4)

1.2.6 葛根谷蛋白的功能特性測定

1.2.6.1 pH值對蛋白質功能特性的影響

總而言之，因為網絡需要對大量的應用與數據進行承載，從而導致需要具備大量的安全審計數據信息。所以通過提取與處理這些數據信息，而且能夠確保通過對其所含有的網絡入侵行為的特征量進行萃取，已經成為網絡安全防范工作中極其重要的問題。同時因為網絡入侵檢測屬于對安全審計信息進行處理與操作，不斷對數據挖掘技術進行引入，確保在大量的數據中網絡系統，不僅能夠對潛在的知識信息進行快速的判斷與提取，也能夠對其是否存在具體的網絡攻擊行為進行判別。所以需要不斷對基于數據挖掘的網絡入侵安全保護系統進行研究與探討，從而確保充分地發揮網絡入侵安全防護系統的效能。

稱取葛根谷蛋白樣品適量配制成一定濃度，用0.1 mol/L HCl溶液或NaOH溶液將pH調至2、3、4、5、6、7，分別測定不同pH值對葛根谷蛋白的持水性(waterabsorption capacity, WAC)、持油性(oil absorption capacity, OAC)、起泡性(foam capability, FC)及起泡穩定性(foam stability, FS)、乳化性(emulsion capability, EC)及乳化穩定性(emulsion stability, ES)的影響。

1.2.6.2 溫度對蛋白質功能特性的影響

稱取葛根谷蛋白樣品適量配制成一定濃度，分別置于30、40、50、60、70 ℃水浴鍋中加熱10 min，冷卻后分別測定不同溫度對葛根谷蛋白WAC、OAC、FC、FS、EC及ES的影響。

1.2.6.3 NaCl濃度對蛋白質功能特性的影響

稱取葛根谷蛋白樣品適量配制成一定濃度，分別置于0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mol/L的NaCl溶液，測定不同離子強度對葛根谷蛋白WAC、OAC、FC、FS、EC及ES的影響。

1.2.6.4 功能特性指標測定

參照文獻[9]的方法，WAC和OAC分別按公式(5)和(6)計算。

(5)

(6)

參照文獻[9]的方法，EC和ES按公式(7)和(8)計算。

(7)

(8)

式中：h，液體總高度，cm；h1，乳化層高度，cm；h2，再次乳化層高度，cm。

參照文獻[9]的方法，FC和FS按公式(9)和(10)計算。

(9)

(10)

式中：V0，攪拌前液體體積，mL；V1，靜止前泡沫體積，mL；V2，下層液體體積，mL；V3，靜止后泡沫體積，mL。

1.2.7 數據統計與分析

每個試驗均重復3次，結果以均值±標準差表示。采用 Excel 2010、SPSS 20.0、Origin Pro 2019 對試驗所得數據進行統計分析、相關性分析及圖像繪制。

2 結果與分析

2.1 葛根4種分級蛋白的含量

采用Osborne分級法提取葛根分級蛋白，分別得到清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，再采用考馬斯亮藍法測定4種蛋白含量。以不同濃度的牛血清蛋白質量為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標，得到線性回歸方程：Y=38.799X+0.546 6，R2=0.994 5。由圖2可知，谷蛋白質量分數最高為253.2 mg/g。球蛋白次之，為82.7 mg/g，所得醇溶蛋白和清蛋白較少。

圖2 葛根4種分級蛋白的質量分數Fig.2 Mass fraction of four P.lobata grading proteins

2.2 葛根分級蛋白的SDS-PAGE分析

利用SDS-PAGE對葛根分級蛋白進行相對分子質量的表征。由圖3可知，在還原條件下，葛根總蛋白和分級蛋白亞基條帶區別顯著?？偟鞍自?5～60 kDa內亞基條帶分布明顯，主要有6個亞基；清蛋白、球蛋白和谷蛋白的亞基主要分布在15～25 kDa，醇溶蛋白無明顯亞基條帶。

圖3 葛根分級蛋白的SDS-PAGEFig.3 SDS-PAGE results of P.loabta grading protein

2.3 葛根分級蛋白的氨基酸組成分析

氨基酸是人體必需的營養成分。缺乏氨基酸時，人體正常的生長發育就會受到抑制或導致疾病產生(表1)。

由表1可知，4種組分蛋白中均含有8種必需氨基酸和9種非必需氨基酸，Osborne法分級分離結果表明，葛根中的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白含量分別為1.81%、17.28%、1.36%和25.26%，葛根蛋白以球蛋白與谷蛋白為主，二者各種氨基酸含量有很大相似之處，酸性氨基酸(天冬門氨酸、谷氨酸)含量最高，其中球蛋白中含有22.91%，谷蛋白中含有23.44%；而谷氨酸是生物機體內氮代謝的基本氨基酸之一，在代謝上具有重要意義，其能與氨結合生成谷氨酰胺，能夠增加血氨的去路，可用于治療肝昏迷[10]。

表1 葛根分級蛋白的氨基酸組成和含量 單位：g/100 g

2.4 葛根分級蛋白的二級結果分析

FT-IR技術是分析分子結構最有效的技術之一。如圖4所示，蛋白質的紅外光譜中有許多特征吸收峰，在3 400～3 300 cm-1處為酰胺A帶的吸收峰(N—H伸縮振動)。

a-清蛋白;b-球蛋白;c-醇溶蛋白;d-谷蛋白圖4 葛根組分蛋白紅外分析譜圖Fig.4 Infrared analysis spectrum of P.lobata grading protein

2.5 葛根分級蛋白抗氧化活性分析

2.5.1 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基在有機溶劑中非常穩定，呈紫色，在517 nm處有一個特征吸收峰，自由基清除劑可與DPPH自由基的孤對電子配對，使其在最大吸收波長處的吸光度變小，顏色從紫色褪至黃色。因此，通過測定吸光度的變化可評價對DPPH自由基的捕獲能力。該方法靈敏、簡便、實用且重現性好，多用于天然有機化合物和植物提取物的抗氧化活性評價[13]。由圖5可知，4種葛根分級蛋白均具有對DPPH自由基的清除能力，且呈現良好的劑量依賴性。在質量濃度為0～1.6 mg/mL時，DPPH自由基清除能力隨葛根分級蛋白濃度升高而增大，在1.6 mg/mL后各組分蛋白清除率趨于穩定，DPPH的IC50值由小到大依次為谷蛋白(0.118 mg/mL)、球蛋白(0.221 mg/mL)、清蛋白(0.300 mg/mL)、醇溶蛋白(0.700 mg/mL)。

圖5 葛根分級蛋白DPPH自由基清除能力Fig.5 DPPH radical scavenging ability of P.lobata grading protein

2.5.2 ·OH清除能力

圖6 葛根分級蛋白·OH清除能力Fig.6 ·OH free radical scavenging ability of P.lobata grading protein

2.5.3 ABTS陽離子自由基清除能力

ABTS陽離子用于測定親水性和親脂性物質的抗氧化能力。K2SO4可以催化ABTS生成穩定的綠色自由基。生物活性物質的抗氧化活性可以通過ABTS陽離子自由基清除率來評估[16]。當某物質與ABTS陽離子自由基反應后，如果在734 nm處的吸光值降低，則說明該化合物具有自由基清除活性。吸光值下降越多則其清除率越高。

圖7 葛根分級蛋白ABTS陽離子自由基清除能力Fig.7 ABTS free radical scavenging ability of P.lobata grading protein

由圖7可知，葛根分級蛋白隨濃度增加ABTS陽離子自由基清除能力呈逐漸上升趨勢，與其DPPH自由基清除能力趨勢相似，當蛋白濃度達到3.2 mg/mL時，ABTS陽離子自由基清除能力趨于平穩，谷蛋白達到90.22%，接近維生素C的清除率，球蛋白達到84.32%，清蛋白達79.29%，醇溶蛋白清除能力最差，只有59.21%。谷蛋白、球蛋白、清蛋白和醇溶蛋白的IC50值分別為0.089、0.135、0.307、1.281 mg/mL。

2.5.4 還原能力

抗氧化劑使K4[Fe(CN)6]被還原成K4Fe(CN)6，Fe3+與K4Fe(CN)6可以發生反應，產生普魯士藍，普魯士藍在700 nm處有強吸收峰，還原力與抗氧化劑的能力成一定正比例，所以吸光度值越大，產生的普魯士藍越多，說明其抗氧化能力越強[17]。本實驗利用上述原理表征還原能力。由圖8可知，葛根4種分級蛋白及維生素C對Fe3+有還原能力，但4種蛋白還原能力遠低于維生素C，盡管如此，谷蛋白的還原能力仍優于其他蛋白，還原能力達1.33。

2.6 葛根谷蛋白功能特性分析

2.6.1 pH對葛根谷蛋白功能性質的影響

由圖9可知，隨著pH值增大，持水性、持油性、乳化性、乳化穩定性和起泡性都是先降低后升高，在pH 4.0時都達到了最低值；而起泡穩定性變化不明顯?？赡苁莗H值在等電點附近時，變性形成粗糙聚集物，致使溶解度很低，降低了蛋白的持水性、乳化性、乳化穩定性及起泡性[18]。當pH值大于或小于等電點時，蛋白溶解度增加，使得蛋白的持水性、持油性、乳化性、乳化性穩定性及起泡性也隨之增加。

圖8 葛根分級蛋白還原能力Fig.8 Reducting ability of P.lobata grading protein

a-持水性和持油性;b-起泡性和起泡穩定性;c-乳化性和乳化穩定性圖9 pH值對谷蛋白功能特性的影響Fig.9 Effect of pH value on functional characteristics of glutenin

2.6.2 溫度對葛根谷蛋白功能性質的影響

由圖10可知，溫度對葛根谷蛋白功能特性影響較大。隨著溫度的升高，葛根谷蛋白的持水性、乳化穩定性呈現先下降后上升再下降趨勢。持油性、乳化性與起泡性趨勢相反。當溫度為60 ℃時，乳化性降到最低值為65%，乳化穩定性則升到最大值為90%。在溫度為50 ℃時，起泡性達到最大值為40.78%。在50～60 ℃時，可能是因為蛋白質在較低溫度時，其結構變得疏散，增加了蛋白質持水性和起泡性，而在較高溫度的作用下，破壞了水表面的泡沫結構[19]，從而起泡穩定性降低。

a-持水性和持油性;b-起泡性和起泡穩定性;c-乳化性和乳化穩定性圖10 溫度對谷蛋白功能特性的影響Fig.10 Effect of temperature on functional characteristics of glutenin

2.6.3 NaCl濃度對葛根谷蛋白功能性質的影響

離子強度對谷蛋白功能性質的影響見圖11，隨著離子強度的增大，持水性、乳化性及乳化穩定性呈下降趨勢，持油性、起泡性及起泡穩定性變化不明顯。當離子濃度為1.0 mol/L時，乳化性、乳化穩定性及起泡穩定性最好?？赡苡捎邴}濃度達到一定程度時形成大量的蛋白質網絡結構，從而導致穩定性增加[20]。

a-持水性和持油性;b-起泡性和起泡穩定性;c-乳化性和乳化穩定性圖11 NaCl濃度對谷蛋白功能特性的影響Fig.11 Effect of NaCl concentration on functional characteristics of glutenin

3 結論

本次試驗根據Osborne分級分離方法提取葛根分級蛋白后對其進行定量和定性分析，通過SDS-PAGE、傅里葉紅外光譜及氨基酸組分測定分析其分子質量分布及二級結構，并對其抗氧化活性進行評價與比較。結果表明谷蛋白的蛋白含量較高。SDS-PAGE表明醇溶蛋白沒有明顯條帶，可能提取出的成分主要是低分子質量的肽類成分，球蛋白的條帶最明顯，分子質量主要分布在15～25 kDa。紅外光譜分析谷蛋白的二級結構較穩定。氨基酸組分分析結果表明，球蛋白與谷蛋白的氨基酸含量較高，2種蛋白中酸性氨基酸與支鏈氨基酸含量較高，在代謝與延緩疲勞方面具有重要作用。

新陳代謝產生的自由基會導致機體內生物膜、蛋白質、酶及活細胞產生過氧化損傷，從而加速機體衰老及導致多種疾病的發生，添加抗氧化劑能夠有效清除自由基、預防疾病、延緩機體衰老。本實驗抗氧化活性研究結果表明4種蛋白均有較好的體外抗氧化能力，谷蛋白的DPPH自由基、·OH、ABTS陽離子自由基的清除率及還原能力較好，且與維生素C接近。綜上表明在葛根組分蛋白中，谷蛋白具有良好的抗氧化活性。谷蛋白的功能特性結果表明，pH值、溫度及離子強度對谷蛋白功能特性產生一定的影響。

綜上所述，葛根谷蛋白是一個氨基酸含量豐富、抗氧化活性強、值得開發和利用的優質蛋白質。本研究結果為葛根谷蛋白在產品開發及其在食品加工中的應用提供基礎實驗支撐。