PCR-DGGE技術分析韓式大醬與中式大醬中微生物多樣性

曾玲，金清

(延邊大學 農學院，吉林 延吉，133002)

東北三省素有“大豆之鄉”的美譽，其大豆制品通常分為發酵豆制品和非發酵豆制品。傳統發酵大豆食品包括豆醬、豆豉、豆漿、醬油、臭豆腐與腐乳等產品[1]。而東北傳統大醬是以大豆為原料，經天然存在的細菌和真菌發酵而成的半固體狀調味食品[2]。在厭氧發酵過程中，厭氧菌快速繁殖，微生物群落的動態變化會對大醬發酵產生一定的影響[3]，蛋白質在酶的作用下分解為小分子的肽、氨基酸，從而產生獨特風味。因此傳統發酵大豆制品營養豐富、質地獨特、風味醇厚，且在其發酵過程中會發生非酶褐變并產生褐色物質——類黑精，即大豆中富含的蛋白質及其分解產物與還原糖類發生美拉德反應的產物[4-5]。類黑精作為非消化性高分子物質，除具有食物纖維的生理功能外[6]，還具有降血壓[7]、抗氧化[8]、抗腫瘤[9]等多種作用生物活性。

但傳統豆醬發酵工藝為自然發酵，因此其品質因參與發酵的微生物種類而異?；?6S rRNA與26S rRNA基因的非培養技術能夠揭示微生物群落結構，為規避傳統微生物群落分析的局限性而開發的各種非培養的方法中，變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)分析是用于快速、經濟地研究微生物多樣性的最廣泛應用的分子方法之一。一般在聚丙烯酰胺凝膠電泳時，雙鏈DNA分子遷移距離由其分子大小與電荷決定，因此同樣長度的DNA片段在膠中的遷移距離相同，從而不能被區分出來，DGGE技術在一般的聚丙烯酰胺凝膠基礎上加入了變性劑梯度，從而能夠把同樣長度但序列不同的DNA片段區分開來。

因此，本研究以自制的韓式大醬與中式大醬為原料，不進行微生物培養，直接提取樣品總DNA，采用聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis, PCR-DGGE)測定分子指紋圖譜，比較生物體所攜帶基因中的保留性結合序列(conserved region)來確認微生物的變化，分析中式與韓式大醬中的優勢菌群，對傳統醬類由原材料和加工方法引起的發酵微生物群落變化進行補充，為大醬的標準化生產與質量控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

瓊脂糖，上海源葉生物科技有限公司；PBS、TAE緩沖液，江蘇恩莫阿賽生物技術有限公司；DNA提取試劑盒，廣州健侖生物科技有限公司；聚丙烯酰胺凝膠試劑盒，上海生工生物工程有限公司；SYBR Green，Invitrogen公司。

1.2 儀器與設備

FA1104分析天平，上海天平儀器有限公司；Z400K冷凍離心機，萊比信(中國)科技發展有限公司；SX-700高壓蒸汽滅菌器，日本TOMY公司；Bio-Rad T100型PCR儀、電泳儀、變形梯度電泳儀、GelDoc XR凝膠成像儀，伯樂生命醫學產品(上海)有限公司；SW-CJ-IFD超凈工作臺，上海新苗醫療器械機械制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 韓式大醬制作工藝流程

大豆→浸泡→瀝水蒸煮→破碎→造型→稻草捆綁→吊掛→自然發酵→醬曲

醬曲→清洗晾曬→破碎→裝壇→加鹽水(25%，質量分數，下同)→自然發酵→去除醬油→破碎→裝壇→撒食鹽→白布封口→封蓋發酵

1.3.2 中式大醬制作工藝流程

大豆→浸泡→瀝水蒸煮→破碎→造型→包裝紙包裝→自然發酵→醬曲

醬曲→清洗晾曬→破碎→裝壇→加鹽水(25%)→自然發酵

1.3.3 大醬樣品DNA提取

分別稱取10 g樣品與20 mL PBS(pH 7.0)混勻均質并經4層濾布過濾，將濾液于4 ℃下400×g離心5 min，棄上清液，沉淀用PBS重復洗滌3次后重新加入3 mL PBS，使用基因組DNA提取試劑盒提取其DNA，并在10 g/L瓊脂糖凝膠上對DNA的產量與質量進行電泳分析，將提取DNA作為PCR模板以擴增16S rRNA與26S rRNA基因[10]。

1.3.4 PCR擴增

PCR反應體系均為50 μL，體系包括5 μL 10×Buffer(含有Mg2+)，4 μL 25 mmol/L dNTP混合物，1 UTaqDNA聚合酶，每種引物50 pmol，DNA模板用量為1 μL。Reconditioning PCR用來消除普通PCR過程中的雜合雙鏈DNA污染。

A：16S rRNA基因V3區PCR擴增條件：引物為341F GC和518R。PCR反應程序為94 ℃預變性4 min后進入30個循環，94 ℃ 1 min；65 ℃ 1 min(注：每循環二次后溫度降低1 ℃)；72 ℃ 1 min，最后72 ℃延伸10 min。Reconditioning PCR反應程序：94 ℃預變性4 min后進入循環，94 ℃ 1 min：65 ℃ 1 min；72 ℃ 1 min，5至10個循環后72 ℃延伸10 min。

B：26S rRNA基因PCR擴增條件：引物為NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)與LS2(5′- ATTCCCAAACAACTCGACTC-3′)，并且在NL1的5′端上加入富含GC的DNA片段(5′-CGCCCGCCGC GCGGCGGGCGGGGCGGGGGC-3′)。PCR反應程序為94 ℃預變性4 min進入30個循環，94 ℃ 1 min；50 ℃ 1 min；72 ℃ 1 min，最后72 ℃延伸10 min。Reconditioning PCR反應程序：94 ℃預變性4 min后進入循環，94 ℃ 1 min；55 ℃ 1 min；72 ℃ 1 min，8個循環后72 ℃延伸10 min。

1.3.5 DGGE

PCR產物采用Bio-Rad DCode檢測系統進行DGGE分析。將80 g/L聚丙烯酰胺凝膠置于TAE緩沖液中，上樣后在100 V下電泳200 min，并在40%～60%的變性梯度下實現了最佳分離，然后用SYBR green染色45 min，使用GelDoc XR凝膠成像儀對凝膠進行拍照[11]。

1.3.6 DGGE條帶回收、PCR擴增與測序

參考鄭艷等[12]的方法，將DGGE后的凝膠，置于凝膠成像儀上，選取目標條帶切割后放入無菌離心管中，加入60 μL的滅菌去離子水清洗后加入60 μL的滅菌去離子水并于4 ℃靜置過夜。取儲存樣品液2 μL作為PCR反應模板，進行PCR擴增并測序。

2 結果與分析

2.1 韓式大醬與中式大醬中的細菌多樣性分析

擴增大醬樣品中微生物的16S rRNA基因，并通過變性梯度凝膠電泳方法調查細菌的群落分布。韓式大醬PCR-DGGE結果如圖1所示，并對出現的每個條帶進行堿基序列分析，鑒定結果如表1所示。韓式大醬中芽孢桿菌屬(Bacillus)為優勢種，其次為不動桿菌屬(Acinetobacter)、四聯球菌屬(Tetragenococcus)和嗜鹽單胞菌屬(Halomonas)。芽孢桿菌在發酵過程中能分泌多種酶類與抗生素，可協助真菌分解大豆中的蛋白質和淀粉。此外，醬曲在清洗晾曬、破碎裝壇后使用鹽水浸泡發酵，分離出的四聯球菌屬和單胞菌屬都具有一定的耐鹽性，是大豆產品發酵過程中常接種的微生物之一[13]，可用于釀造醬油、腐乳、黃豆醬等制品中，改善產品風味。

圖1 韓式大醬中16S rRNA擴增產物的DGGE指紋圖譜Fig.1 DGGE fingerprints of 16S rRNA amplification products in Korean soybean paste

表1 韓式大醬中PCR-DGGE指紋圖譜上條帶的測序結果Table 1 Sequencing results of PCR-DGGE fingerprints in Korean soybean paste

中式大醬PCR-DGGE結果如圖2所示，并對出現的每個條帶進行堿基序列分析，鑒定結果如表2所示。在中式大醬中，乳酸菌如片球菌屬(Pediococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、明串珠菌屬(Leucanostoc)和腸桿菌屬(Enterobacter)均為優勢種，且與芽孢桿菌屬相比分布更多。

圖2 中式大醬中16S rRNA擴增產物的DGGE指紋圖譜Fig.2 DGGE fingerprints of 16S rRNA amplification products in Chinese soybean paste

表2 中式大醬中PCR-DGGE指紋圖譜上條帶的測序結果Table 2 Sequencing results of PCR-DGGE fingerprints in Chinese soybean paste

乳酸菌是人體腸道系統中最主要的有益菌，通常在發酵食品中分離得到，在成品醬風味形成過程中也起到了重要作用，能產生良好的感官風味和豐富的營養物質[14-16]。在大醬發酵過程中，乳酸菌將酪氨酸、精氨酸、組氨酸分解，對蘇氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸等進行異型脫羧基作用從而生成多類化合物，這些化合物對豆醬風味形成有重要的貢獻。

左麗麗等[17]對傳統發酵豆醬中乳酸菌進行分離和鑒定，初步推斷出戊糖片球菌是吉林市農家醬發酵過程中的優勢乳酸菌群，對傳統豆醬的風味起著至關重要的作用。此外，不動桿菌屬、四聯球菌屬和嗜鹽單胞菌屬也顯示為優勢種。

2.2 韓式大醬與中式大醬中的真菌多樣性分析

擴增大醬樣品中微生物的26S rRNA基因，并通過變性梯度凝膠電泳方法調查真菌的群落分布，韓式大醬PCR-DGGE結果如圖3所示，并對出現的每個條帶進行堿基序列分析，鑒定結果如表3所示。

圖3 韓式大醬中26S rRNA擴增產物的DGGE指紋圖譜Fig.3 DGGE fingerprints of 26S rRNA amplification products in Korean soybean paste

表3 韓式大醬中PCR-DGGE指紋圖譜上條帶的測序結果Table 3 Sequencing results of PCR-DGGE fingerprints in Korean soybean paste

韓式大醬的真菌分布呈多樣性，根毛霉屬(Rhizomucor)、青霉菌屬(Penicillium)、毛霉屬(Mucor)、外瓶霉屬(Exophiala)、曲霉屬(Aspergillus)等分布廣泛。其中，曲霉屬通常能夠分泌較復雜酶系，如蛋白酶、谷氨酰胺酶、淀粉酶、果膠酶、纖維素酶等，且具有較強的酶活性，能利用單糖、淀粉、低聚糖、酒精、有機酸等作為碳源，利用氨基酸、尿素、蛋白質等作為氮源，廣泛應用于食品發酵[18];毛霉屬能產生果膠酶、凝乳酶和脂肪酶等，可用于制曲和釀酒[19]。因此，有必要對大醬的微生物多樣性進行研究，了解大醬的微生物群落結構，充分利用優勢菌株。

中式大醬PCR-DGGE結果如圖4所示，并對出現的每個條帶進行堿基序列分析，鑒定結果如表4所示。從表4可以看出，魯氏接合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)分布較多，其次是熊蜂生斯塔莫酵母(Starmerellabombicola)但與韓式大醬相比，其真菌種類較為單一。

圖4 中式大醬中26S rRNA擴增產物的DGGE指紋圖譜Fig.4 DGGE fingerprints of 26S rRNA amplification products in Chinese soybean paste

魯氏接合酵母是豆醬發酵應用相對較多的酵母菌，該菌具有較好的酒精發酵力，且耐鹽性極強、抗高滲透壓，在高鹽濃度下可發酵麥芽糖、葡萄糖產生甘露醇、甘油、乙醇、阿拉伯糖醇、琥珀酸、異戊醇、異丁醇等，此外還可以與乳酸菌代謝產物作用生成酯類物質，產生大醬的特有香味。

近年來，Starmerella屬因其優良的發酵特性引起了很多研究興趣[20]，Starmerellabombicola與Starmerellabacillaris是該屬的典型種[21-22]，TU等[23]分離鑒定出StarmerelladavenportiiDo18并進行初步的發酵研究和發酵產物的檢測，結果發現該菌能產生濃郁的香氣和有機酸，降低膽固醇，對高糖、低pH、膽鹽等各種抑制劑具有耐受性，并能模擬胃腸環境。

表4 中式大醬中PCR-DGGE指紋圖譜上條帶的測序結果Table 4 Sequencing results of PCR-DGGE fingerprints in Chinese soybean paste

3 結論

韓式與中式大醬由于制作方法與水分含量的不同，其微生物的分布也不同。制作韓式大醬時，采用稻草捆綁醬曲進行發酵，枯草芽孢桿菌可由稻草分離得到，因此韓式大醬中的芽孢桿菌屬較有優勢，且制作過程中去除了醬油(醬鹵)，其水分含量低，適合霉菌生長。此外，分離出的四聯球菌屬與嗜鹽單胞菌屬具有一定的耐鹽性，是豆制品發酵過程中常接種的微生物之一。

中式大醬的制作過程中未去除醬油，水分含量高，多為乳酸菌，如片球菌屬、乳桿菌屬、明串珠菌屬、腸桿菌屬等，這些菌株可將氨基酸進行異型脫羧基從而生成多類化合物，在大醬風味形成過程中起到了重要作用。此外，魯氏接合酵母與熊蜂生斯塔莫酵母不僅具有一定的耐鹽性，發酵過程中產生的醇類物質還可與乳酸菌產生的酸類物質發生酯化反應，從而賦予大醬獨特的醬香味。

本研究成功提取了大醬宏基因組DNA，并經PCR擴增靶基因后可較完整地反映相應微生物群落組成，顯示出了菌群多樣性，從未培養角度證實了微生物在大醬發酵過程中具有重要地位。但PCR-DGGE只能分析在總微生物數量上占有一定優勢的微生物，由于其分析的DNA片段較短，信息量較小，所以只能分析到一定范圍內。綜上所述，DGGE可以作為分析豆醬中微生物組成的方法，對豆醬中微生物種類進行估算，其精確分析則需要結合其他方法。此外，要了解微生物的生態功能，尤其是特殊菌種在大醬生產中的具體應用，仍需要得到它們的純培養，因此傳統分離培養仍然是研究微生物多樣性不可缺少的手段。本研究對大醬的微生物區系結構進行了初步探討，但對與之相對應的功能還有待進一步研究。