前庭神經鞘膜瘤外泌體對小鼠耳蝸基底膜的影響研究

王朝暉 駱華鴻 火子榕 吳皓 張治華

上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院耳鼻咽喉頭頸外科(上海 200029）

上海交通大學醫學院耳科學研究所(上海 200029）

上海市耳鼻疾病轉化醫學重點實驗室(上海 200029）

前庭神經鞘膜瘤（Vestibular Schwannoma,VS），是主要起源于前庭神經鞘膜雪旺細胞的良性腫瘤，占橋小腦角腫瘤的80%～90%[1]。瘤體在生長過程中對臨近重要結構產生壓迫、包繞、浸潤，產生相應腦神經及中樞癥狀，如聽力下降、耳鳴、眩暈、面癱等。感音神經性聽力下降（Sensorineural Hearing Loss,SNHL）為VS 最主要癥狀，發生率高達95%[2]，嚴重影響患者社交生活和生存質量[2]，且對側耳聾風險也將明顯增加[3]（可能是VS分泌物通過腦脊液或血液滲透到達對側耳所致）。目前普遍采用隨訪觀察、手術和立體定向放療作為VS 經典處理策略[4]。Friedman AH 等人研究發現[5]，只有不到15.7%的VS患者可嘗試聽力保留術式，聽力保留率為53.7%，聽力提高率更是微乎其微（16.7%）。因此，研究VS 致聾機制，尋找可能的藥物治療靶點，對VS防聾治聾具有重大意義。

研究證明，VS 患側耳蝸結構明顯退化[6]，這意味著除了腫瘤機械性壓迫蝸神經外，耳蝸功能障礙也可能是VS 引起聽力下降的重要原因之一。而VS 腫瘤分泌物可通過內聽道抵達耳蝸[7]，誘發蝸神經退行性變[8]和蝸性病變從而導致聽力下降[9]?；诖?，對VS 腫瘤分泌物的研究聚焦于其耳毒性或神經毒性成分[10]。外泌體（exosome）作為一種遞送細胞遺傳物質的分泌物，是細胞內多囊泡體與細胞膜融合后，釋放到胞外基質的膜性囊泡，直徑約40-160nm，分布和來源廣泛，可由多種細胞所分泌[11]。其磷脂雙分子層結構和接近于病毒直徑大小的特性，是外泌體能夠順利透過血-迷路屏障從而到達耳蝸內部的保障[12]。外泌體內容物豐富，攜帶有蛋白、DNA、miRNA 等遺傳物質，參與免疫應答、抗原遞呈、胞間通訊等多種生理過程，發揮遞送細胞遺傳物質和信息交流的重要作用[13]?；赩S患者顳骨組織病理結果，本研究聚焦于VS 外泌體對小鼠耳蝸基底膜的損傷，重點關注毛細胞形態及數量的變化。

1 材料與方法

1.1 病例收集

為盡可能減少腫瘤大小對聽力的影響，我們收集Ⅱ、Ⅲ期中小型VS 作為研究對象。VS 腫瘤組織樣本均取自2020年9月至2021年6月于我院接受手術治療的患者，記錄患者的一般信息。根據AAO-HNS 聽力分級系統[15]對患者分組，將聽力分級為A、B 級（純音聽閾≤50dB 且言語識別率≥50%）的患者分為聽力好組（Good hearing，GH），將聽力分級為C、D 級(純音聽閾大于50dB 且言語識別率≥50%或言語識別率＜50%)的患者作為聽力差組（Poor hearing，PH）。

VS 腫瘤組織離體后立即置于干冰上轉移至-80℃超低溫冰箱保存；另取部分組織置于裝有DMEM培養基的離心管中，用于原代細胞培養。樣本采集得到醫院人類受試者保護委員會的批準，所有捐贈樣本的患者均簽署《生物樣本捐贈知情同意書》。

將收集到的兩組腫瘤組織酶解得到VS原代細胞，用含有10%去外泌體胎牛血清的DMEM 培養液于37℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。當細胞融合度達到70%～80%時，收集細胞上清用于提取外泌體。

1.2 提取和鑒定外泌體

采用超速離心法提取外泌體。將兩組VS原代細胞上清液以3000g 離心10 mins，棄沉淀，保留上清液；以4:1 的比例加入Exosomoe Concentration Solution（ECS 試劑），渦旋振蕩器混勻1min，于4℃靜置2h；混合液于4℃以10000g 離心60 mins，棄上清，沉淀中富含外泌體顆粒；用PBS重懸沉淀，得到外泌體，-80℃保存。用透射電鏡檢測外泌體的形態；納米流式檢測外泌體的粒徑大小及分布；Western blot檢測外泌體marker蛋白的表達。

1.3 新生鼠基底膜體外培養

選擇2～3天C57BL/6J小鼠，購自上海吉輝實驗動物飼養有限公司。75%乙醇浸泡消毒，眼科剪斷頭后將耳蝸與顳骨分離，放入預冷的PBS中，去除耳蝸殼、血管紋、螺旋韌帶、蝸軸等結構，得到完整的基底膜。將基底膜放入35mm 培養皿中，加入含有1%N2 和2%B27 的DMEM／F12 培養基，置于37°C和5% CO2中培養，隔日更換培養基。耳蝸基底膜離體培養12h 后，添加不同濃度PH 組外泌體（PHexo）和GH 組外泌體（GH-exo），未處理組為對照組；繼續孵育48h后終止培養。

1.4 免疫熒光染色

終止培養后，PBS 洗3 次，加入4%多聚甲醛固定30 mins；blocker 液（5% BSA+0.3% Triton X-100）封閉30 mins 后，加入一抗Myosin7A（1:300），4°C 孵育過夜；PBS 清洗3 次，加入Alexa Fluor 標記的羊抗兔二抗488（1:400），避光孵育1h；PBS 洗3 次后，加入含dapi 的抗熒光淬滅劑封片。leica 共聚焦顯微鏡觀察，統計每100μm 內毛細胞數量以評估外泌體的耳毒性作用。

1.5 統計學分析

2 實驗結果

2.1 外泌體的觀測與鑒定

外泌體提取流程如圖1A所示。VS患者信息如表1所示。電鏡圖片顯示外泌體呈典型的茶托狀（圖1B）。納米流式結果顯示（圖1C），外泌體直徑分布在40～220nm，PH組外泌體平均直徑為58.20±9.85nm，GH 組外泌體平均直徑為58.99±10.24nm。Western blot 檢測結果如圖1D 所示，成功檢測外泌體標志蛋白CD63和TSG101。透射電鏡、納米流式、Western Blot結果證實VS外泌體提取成功。

表1 患者信息表Table 1 Patient characteristics

圖1 VS 外泌體的提取與鑒定。A：超速離心法提取并純化外泌體；B：電鏡下VS 外泌體；C:納米流式分析外泌體的粒徑大??；D：Western blot 檢測外泌體標志蛋白CD63，TSG101。Fig.1 Extraction and identification of VS exosomes.A: Extraction and purification of exosomes by ultracentrifugation.B: Image of exosome electron microscopy.C: Nanoflow analysis of the particle size of exosomes.D: Protein marker CD63,TSG101 were measured by Western blot.

2.2 VS外泌體對耳蝸基底膜的毒性作用

不同濃度外泌體培養48h 后，發現PH-exo 可誘導基底膜毛細胞損傷。如圖2所示，對照組毛細胞排列正常，內毛細胞計數結果為14.0±0.32/100μm、13.2±0.37/100μm、13.6±0.40/100μm（對應頂、中、底圈）；當濃度為1μg/μl 時，PH 組毛細胞嚴重丟失，排列紊亂，形態異常，內毛細胞計數結果為5.4±0.51/100μm、5.0±0.32/100μm、4.8±0.37/100μm，與對照組相比具有統計學差異（頂圈：t=14.33,P＜0.001;中圈：t=16.74,P＜0.001;底圈t=16.07,P＜0.001），提示1μg/μl PH-exo 對毛細胞具有明顯的耳毒性作用；而GH 組毛細胞排列正常且形態完好，內毛細胞計數結果為13.2±0.37/100μm、12.6±0.40/100μm、13.4±0.40/100μm，與對照組相比無統計學差異（頂圈：t=1.63,P=0.141;中圈：t=1.10,P=0.305;底圈t=0.354,P=0.733）。當濃度為0.5μg/μl時，PH組毛細胞出現極少數量的丟失，形態輕度異常，內毛細胞計數結果為12.8±0.49/100μm、12.2±0.37/100μm、13.0±0.45/100μm，與對照組相比內毛細胞僅在中圈統計學存在統計學差異（頂圈：t=2.06,P=0.074;中圈：t=2.65,P=0.029;底圈t=1.00,P=0.347）。

圖2 外泌體對基底膜的毒性作用。A:4 組MyosinⅦA 標記的毛細胞的代表性圖片；對照組毛細胞形態正常且無細胞丟失；當外泌體濃度為1μg/μl 時，PH 組基底膜嚴重損傷，GH 組基底膜影響甚微；當外泌體濃度為0.5μg/μl 時，PH 組基底膜輕度損傷，內毛細胞極少數丟失（Scale bar=50nm）；B C D:內毛細胞計數，每100μm 的內毛細胞的個數變化以反映外泌體對基底膜的損傷（n=5，Mean ± SEM，*P ＜0.05，***P ＜0.001）。Fig.2 Ototoxic effects of exosomes on the basement membrane.A: Representative pictures of four groups of Myosin VIIA-labeled basement membrane hair cells.The morphology of hair cells in the control group was normal and there was no cell loss; When the exosome concentration was 1 μg/μl,the basement membrane in the PH group was severely damaged,and the basement membrane in the GH group was not greatly affected; when the exosome concentration was 0.5 μg/μl,the basement membrane in the PH group was mildly damaged and a few inner hair cells were lost.B C D: Number of cells was quantified for inner hair cell per 100 μm.(n=5，Mean ±SEM，***P ＜0.001).Scale bar:50μm(A).

3 討論

VS 患者聽力下降的病因分為醫源性和腫瘤性。醫源性聽力下降與手術徑路、手術技巧、蝸神經血供保存、放療等因素直接相關[15]。而腫瘤性聽力下降則與腫瘤的生長方式、生長速度、位置、耳蝸病理改變、異常炎癥反應、內聽道擴大比例等因素密切相關[16-19]。通常情況下，腫瘤對蝸神經、腦干耳蝸核的機械壓迫是VS 致聾重要的因素之一，較大的腫瘤可能會導致更嚴重的壓迫，影響血液供應，隨之引起的缺血性變化導致感覺神經性聽力障礙。Gerganov V 等人分析了99 例VS 患者的影像和術前聽力水平，發現聽力水平與腫瘤分期顯著相關[16]；Bathla等人研究發現在小型VS中，腫瘤體積與純音聽閾、言語識別率相關[20]。然而，更多研究表明聽力下降與腫瘤大小/體積無關[21-25]。

耳蝸功能障礙是VS患者聽力下降的另一個重要因素。在外周聽覺系統中，耳蝸是傳導、感受聲波的重要結構，耳蝸結構異常直接影響聽力。Mahmud 等人對11 名VS 患者尸檢分析，結果顯示聽力下降嚴重患者的腫瘤側耳蝸毛細胞減少、血管紋和螺旋韌帶變性[9]；Merchant 等人證實了這一病理結果[6]。受限于尸檢樣本，VS 患者耳蝸結構退化與聽力下降之間的相關性分析難以開展研究?；儺a物耳聲發射（Distortion Product Otoacoustic Emission，DPOAE）可用于評估耳蝸外毛細胞功能，Antonio P 等人發現在多個頻率段VS患者腫瘤側耳的DPOAE 反應幅度均出現降低[26]，證明了VS 患者耳蝸功能受損。除了耳蝸異常，一些研究觀察到VS 患者耳蝸外淋巴液中的蛋白質水平升高，在T2加權MRI掃描中表現為低信號[27,28]。

炎癥途徑的異常上調是VS 重要的發病機制，在大多數VS 中可觀察到免疫浸潤[29]。COX-2、阿司匹林等非甾體抗炎藥都與VS 腫瘤增殖、凋亡息息相關[30,31]。但炎癥與聽力下降之間的關系卻很少被研究。在耳蝸基底膜培養的體外模型中，腫瘤分泌物引起的耳蝸基底膜損傷程度與VS患者聽力相關，對腫瘤分泌物進一步分析確定TNFα 是耳毒性分子[7]。Moon I 等人研究發現，VS 中炎癥相關基因高表達，聽力差患者的NLRP3 和IL-1? 表達水平高于聽力好患者[18]。除炎癥因子外，生長因子和其他腫瘤分泌物也被證實與VS患者聽力下降相關。在2型神經纖維瘤?。ㄖ饕憩F為雙側VS）中，升高的VEGF 會導致腫瘤生長和聽力下降，抗VEGF 治療可以通過使腫瘤血管正?；?、改善血管灌注以改善聽力[32,33]。近期，Stankovic KM 等人發現，血漿和腫瘤分泌物中MMP-14 的表達水平與患者聽力下降程度相關，MMP-14 可誘導螺旋神經節神經元纖維和突觸的損傷[34]。

本課題組推測在中小型VS 患者中，腫瘤對蝸神經及血管、腦干壓迫較小，此時耳蝸損傷是VS導致聽力下降的主要因素。腫瘤分泌物可經內聽道抵達耳蝸[7]，作為腫瘤與耳蝸之間的媒介影響耳蝸結構與功能。外泌體作為旁分泌的一種重要形式，將蛋白質、DNA、RNA、脂質等包裹在富含膽固醇的磷脂囊泡中以保證所包裹的物質不會被酶解，有利于進行細胞間的物質交換與信息傳遞。且外泌體已被證實能夠穿透血腦屏障[35]，這對治療中樞神經系統疾病具有重要意義。因此，外泌體具有穿過內耳血-迷路屏障的可能；同時，在解剖上外泌體由VS 分泌后進入毗鄰的迷路動脈，最終通過耳蝸后動脈進入耳蝸；以上兩點為研究VS 外泌體經血液途徑抵達耳蝸提供了理論基礎。因此相較于其他腫瘤分泌物，外泌體進入耳蝸的可行性更加充分。在本研究中，我們研究了不同聽力分級的中小型VS外泌體對耳蝸基底膜的影響。結果顯示，聽力差（PH）組外泌體對耳蝸基底膜毛細胞產生毒性作用，而聽力好（GH）組對耳蝸基底膜無明顯毒性作用。兩種外泌體的差異內容物是造成耳毒性差異現象的關鍵因素，進一步研究須針對外泌體進行microRNA 測序或蛋白組學分析，深入了解VS 外泌體導致聽力下降的分子途徑。此外，新生鼠耳蝸基底膜體外模型具有局限性，僅能進行短期評估，且在體外實驗與體內實驗中可能產生不同的結果，需進一步構建動物模型研究VS外泌體對聽力的影響。

4 結論

VS 外泌體具有不同程度的耳毒性，導致小鼠耳蝸基底膜毛細胞丟失且對毛細胞的損傷具有濃度依賴性。