海南稻作區稻瘟病菌AvrPik等位基因的變異監測與多樣性分析

危藝可 王倩 吳偉懷 陸英 賀春萍 梁艷瓊 易克賢

摘要 海南省地處熱帶。由于具有國內其他地區無可比擬的光溫資源優勢，每年有大量的水稻材料在南繁區繁育與種植，給稻瘟病菌的變異及傳播帶來了極大的便利。自20世紀70年代以來，Pik等位基因已被廣泛地用作水稻抗稻瘟病育種的主要抗源。為了解海南稻瘟病菌AvrPik等位基因的變異及多樣性，本研究從海南稻作區采集穗莖瘟病樣，通過單孢分離獲得100株稻瘟病菌株。利用AvrPik基因特異性引物擴增病原菌DNA，所得PCR產物經克隆、測序后與參考序列進行比對分析。結果從100株菌株中鑒定出AvrPik_A、AvrPik_B、AvrPik_D、AvrPik_E和AvrPik_F共5種等位基因類型。其中AvrPik_D類型最多，出現頻率為50.00%;其次為AvrPik_E類型，出現頻率為32.08%;第三為AvrPik_B類型，出現頻率為8.49%。在AvrPik等位基因核苷酸多樣性方面，非信號肽區域多樣性要明顯高于信號肽區域。就群體受到的選擇壓而言，南繁種植區與常規種植區的稻瘟病菌群體的Ka/Ks值均大于1，分別為2.703 1和1.236 6，表明，無論是南繁區還是常規種植區，AvrPik等位基因均受到了強烈的正選擇壓，且南繁區群體受到的選擇壓更強。上述5種不同基因型的代表菌株中菌株20MG48 （AvrPik_F）長勢最快，其產孢量卻最少。本研究初步明確了海南稻作區AvrPik等位基因的群體結構，為本稻作區抗性品種的布局以及抗瘟育種計劃提供參考。

關鍵詞 稻瘟病菌;?AvrPik等位基因;?多樣性

中圖分類號： S 435.111.41

文獻標識碼：?A

DOI：?10.16688/j.zwbh.2021682

Abstract Hainan province is located in the tropical region. Because of the incomparable advantages of light and temperature resources in Hainan over the other regions in China， a large number of rice varieties are bred and planted in off-season breeding areas in Hainan every year， which brings great convenience to the variation and transmission of Magnaporthe oryzae. The major resistant gene Pik for rice blast and its alleles have been extensively exploited as sources of genetic resistance in rice breeding programs since 1970s. In order to understand the variation and diversity of AvrPik alleles in Magnaporthe oryzae in rice-growing areas of Hainan， 100 M. oryzae strains were isolated from the rice growing areas of Hainan. The AvrPik genes were cloned from the genomic DNA， sequenced and then compared with the reference sequences. Finally， five main allele genotypes including AvrPik_A， AvrPik_B， AvrPik_D， AvrPik_E and AvrPik_F were identified. The frequencies of AvrPik_D， AvrPik_E and AvrPik_B were 50.00%， 32.08%， 8.49%， respectively. In terms of the nucleotide diversity of AvrPik alleles， the nucleotide diversity of non-signal peptide regions was obviously higher than that of signal peptide regions. In terms of selection pressure on populations， the Ka/Ks ratios of M.oryzae populations from off-season breeding area and the conventional cultivation area were all greater than 1 （2.703 1 and 1.236 6， respectively）. These results indicated that AvrPik alleles in both growing areas were subjected to strong positive selection pressure， and the pressure on AvrPik alleles in off-season breeding area were stronger than that in the conventional area. The hypha of strain 20MG48 （AvrPik_F） grew fastest， but its spore production was the least among the five representative strains. The population structure of Avrpik alleles was preliminarily clarified in rice-growing areas of Hainan province， which provides a reference for the planting of resistant varieties and the breeding program for blast resistance in the rice growing area.

Key words Magnaporthe oryzae;?AvrPik alleles;?diversity

海南省地處熱帶，素有“天然大溫室”之美稱，具有國內其他地區無可比擬的光溫資源優勢，是我國著名的南繁基地。幾十年來，“南繁”在加速水稻品種改良、原原種擴繁和制種方面為國家農業發展做出了巨大貢獻。我國育成的雜交水稻新組合中80%以上經過了南繁加代選育。生產上使用品種的更新周期由過去的10年以上縮短到目前的5～7年［1］。南繁已經成為新品種選育的“孵化器”和“加速器”，而南繁基地則被譽為中國種業的“硅谷”［2］。與此同時，南繁成為“全國和世界危險性有害生物的匯集地及中轉站”的風險也逐漸加大。生物安全將成為南繁最大的威脅，如控制不力，海南將成為有害生物的大“染缸”。就水稻稻瘟病而言，作為水稻新品種培育、種子生產和質量鑒定的南繁基地，每年都有大批的種子、種苗頻繁出入基地，給稻瘟病菌的變異及傳播帶來了極大的便利。

稻瘟病是全球水稻生產上最具毀滅性的病害之一［3］。種植抗病品種是防治該病最經濟、環保的策略。然而，水稻寄主特異抗性的表達不僅取決于該品種本身的抗病基因型，還取決于稻瘟病菌的無毒基因型［4-5］。因此，準確地了解稻瘟病菌無毒基因的群體結構及其變異規律，是實現抗性品種合理培育與利用，以及病情預測預報所面臨的課題。

Pik位點是位于水稻第11號染色體長臂近端粒處的一個主效抗稻瘟病位點。由于該位點具有Pi-k、Pi-kp、Pi-km、Pi-kh等多個等位基因［6-12］，且均對水稻稻瘟病具有較高的抗性，因此，自20世紀70年代以來，這些基因被廣泛地用作水稻抗稻瘟病育種的主要抗源［6， 10， 13-14］。目前該位點的合理持續應用仍有很大的挖掘潛力［6， 13， 15-17］。與Pik等位基因對應的無毒基因為AvrPi-k/-kp/-km/-kh （后續簡寫為AvrPik）［16， 18-20］。

無毒基因AvrPik從稻瘟病菌Magnaporthe oryzae日本菌株Ina168中發現，編碼由113個氨基酸組成的分泌蛋白，含有2個保守結構域，該蛋白能被水稻抗性基因Pik編碼的蛋白識別，并引起防御響應［18］。田間稻瘟病菌群體中AvrPik等位基因既有基因存在/缺失，又有單堿基突變，Yoshida等檢測了日本田間稻瘟病菌菌株的AvrPik等位基因型，并將不同點突變類型命名為AvrPik_A、AvrPik_B、AvrPik_C、AvrPik_D、AvrPik_E等［18］。Wu等分析了來自我國廣東、湖南、黑龍江、遼寧的240株稻瘟病菌菌株的AvrPik等位基因，發現在編碼區共存在16個SNP （single nucleotide polymorphism， SNP），其中4個SNP在所測試的菌株中廣泛存在，且與Pik等位基因之間存在階梯性“軍備競賽”關系［19］。Zhang等利用Avr基因特異性引物對1975年－2009年從美國南部商業農田采集的258株稻瘟病菌基因組DNA進行PCR擴增及測序，檢測出AvrPik_F、AvrPik_G、AvrPik_H、AvrPik_I、AvrPik_J、AvrPik_K等新類型［21］。然而，海南作為水稻的南繁區以及重要生產區，其稻瘟病菌無毒基因AvrPik的群體結構及其變異仍不清楚。為此本文開展了海南稻作區無毒基因群體結構的研究，研究結果將有助于抗瘟材料的創制及應用，對保障國家糧食安全和種業發展安全具有不可替代的作用。

1?材料與方法

1.1?病樣采集與單孢分離

在水稻生長季節，從海南三亞、陵水、樂東、保亭、東方、瓊中、白沙、屯昌、瓊海、定安、文昌等地水稻田采集穗莖瘟病樣。獲得的稻瘟病樣品于室內常溫保濕，24 h后于超凈臺上進行單孢分離。用于本研究的100個菌株來源信息見表1。其中61個菌株來自三亞、陵水、樂東、保亭和東方的南繁育種區，39個菌株來自瓊中、白沙、屯昌、瓊海、定安和文昌的常規種植區。所獲菌株保存于中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所。

1.2?菌絲體的培養及DNA提取

將單孢菌株從PDA試管轉移至PDA平板培養，5 d后挑取2～3個菌絲塊于液體培養基（1%葡萄糖，0.3%酵母粉）中，28℃，180 r/min振蕩培養4～5 d。用滅菌紗布和濾紙過濾收集菌絲體，凍干后于-20℃冰箱中保存備用。病原菌基因組總DNA提取參照OMEGA真菌DNA小量提取試劑盒說明書進行。

1.3?PCR擴增與AvrPik基因克隆測序

參照GenBank登錄號AB498875～AB498879的序列設計AvrPik等位基因的特異性引物AvrPikF （5′-GAAGGTCACGGTTTGAAGAGG-3′）和AvrPikR （5′-ATTATCTTATGAGCCGTCAACCA-3′）。引物由英濰捷基（廣州）貿易有限公司合成。以該引物擴增各菌株的總DNA，預期大小為615 bp。PCR反應總體系為20 μL：包含10×PCR buffer 2 μL，10× dNTPs 1.6 μL，rTaq酶 0.2 μL，10 μmol/L正、反向引物各0.5 μL，模板DNA 1.0 μL，ddH2O 14.2 μL。PCR擴增條件為：94℃預變性3 min;94℃變性30 s，60℃退火15 s，72℃延伸50 s，34個循環;72℃延伸5 min，最后于4℃保存。PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據擴增產物的純度直接或回收后與克隆載體pEASYTM連接。連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞，經藍白斑篩選后選取3個陽性克隆送英濰捷基（廣州）貿易有限公司測序。

1.4?AvrPik等位基因的FNP分型

每個克隆的序列去除載體序列后，以AB498875～AB498879標準序列［18］作為參考，對編碼區第136、139、143、200、233、234等6個功能性核苷酸多態性位點（functional nucleotide polymorphism，FNP）進行比對。上述位點堿基如與AB498876一致則該序列（菌株）記為AvrPik_A型;如與AB498877一致則該序列（菌株）記為AvrPik_B型;如與AB498878一致則該序列（菌株）記為AvrPik_C型;如與AB498875一致則該序列（菌株）記為AvrPik_D型;如與AB498879一致則該序列（菌株）記為AvrPik_E型。其余類型則參照Zhang等［21］。

1.5?DNA核苷酸多態性與選擇壓分析

核苷酸多態性主要由Tajimas π指標［22］來反映。π值通過軟件DnaSP version 5.0［23］計算。選擇壓通過Ka/Ks值來反映。利用DnaSP version 5.0分別計算Ka （非同義替換率， non-synonymous substitution rate）與Ks （同義替換率， synonymous substitution rate），進而計算Ka/Ks值。如果Ka/Ks＞1，則認為存在正選擇效應;如果Ka/Ks=1，則認為存在中性選擇效應;如果Ka/Ks＜1，則認為存在負選擇效應。

1.6?具有不同AvrPik等位基因類型菌株培養觀察

經序列比對篩選，選取具有不同AvrPik 等位基因類型的菌株，于PDA平板上培養，10 d后測量菌落直徑。于超凈臺中，加少量滅菌蒸餾水用藥勺將氣生菌絲刮洗干凈，置于自制產孢箱28℃培養2～4 d，加1 mL滅菌雙蒸水（ddH2O）配制孢子懸浮液，于顯微鏡下觀察分生孢子形態，通過血球計數板計算產孢量。

2?結果與分析

2.1?AvrPik等位基因關鍵FNP位點分型

利用AvrPikF/AvrPikR引物擴增菌株DNA，100個菌株DNA中有93個菌株DNA擴增出預期大?。?15 bp）的特異條帶（圖1），其余7個菌株擴增出雙條帶，其中一條與目標條帶大小一致（615 bp），另外一條略大于目標條帶（1 115 bp） （圖2）。

93個條帶單一菌株的PCR產物克隆后經測序比對發現，其中6個菌株（20MG158、20MG167、20MG201、20MG204、20MG206、MG42）存在兩種不同類型的AvrPik等位基因，因此共得到99條DNA序列。而7個雙條帶的菌株（20MG102、20MG103、20MG105、20MG108、20MG122、20MG131、20MG136），經膠回收測序后序列比對表明，同一樣品的兩個條帶均含有完整且相同的AvrPik等位基因，只是比目標條帶大的條帶（1 115 bp）在編碼區終止密碼子后有一個500 bp的序列插入，故均只保留目標條帶序列用于后續分析。

最終，從供試的100個菌株中共獲得了106條AvrPik等位基因序列。其中來自南繁區菌株序列63條，常規種植區菌株序列43條。經與已報道的參考序列進行比對，在342 bp的編碼區中存在6個FNP位點（#136、#139、#143、#200、#233、#234）。最終鑒定出AvrPik_A、AvrPik_B、AvrPik_D、AvrPik_E、AvrPik_F共5種AvrPik等位基因型（表2）。其中AvrPik_D檢出最多，其檢出頻率為50.00%，為優勢類型;其次為AvrPik_E，其檢出頻率為32.08%。然而，在這106條菌株序列中沒有檢測到AvrPik_C類型。

2.2?AvrPik等位基因核苷酸多樣性與選擇壓分析

將測序獲得的106條序列輸入MEGA軟件進行比對，發現AvrPik等位基因的編碼區中共存在62個SNP位點，其中9個同義突變（#43、#87、#96、#111、#150、#162、#246、#249、#279），53個非同義突變。非同義突變中C136A、C139G、G143A、C200A、T233A、G234A位點普遍存在，即關鍵的6個FNP位點。

進一步從結構域與群體水平方面分析AvrPik等位基因核苷酸多樣性。在結構域水平上，整個編碼區共檢測到62個SNP位點，其中7個來自信號肽區，55個來自非信號肽區。非信號肽區的核苷酸多樣性（0.008 92）明顯高于信號肽區（0.002 97）。表明AvrPik等位基因核苷酸多樣性在這兩個結構域之間存在明顯差異（表3）。在群體方面，南繁區與常規種植區群體檢測出變異位點數分別為43個和24個，其對應的核苷酸多樣性也是南繁區（0.009 26）高于常規種植區（0.005 02） （表3）。

結構域與群體的Ka/Ks檢驗表明，Ka/Ks值在非信號肽區與信號肽區分別為2.054 8與3.223 8?？梢夾vrPik等位基因受到正選擇壓作用（表3）。在群體方面，南繁區（2.703 1）的Ka/Ks值明顯高于常規種植區（1.236 6）。表明，南繁區的AvrPik等位基因受到了強烈的正選擇壓，且強于常規種植區受到的選擇壓（表3）。

2.3?不同AvrPik等位基因的菌株生長特性比較

經序列比對確認后，選取只在6個FNP位點存在差異（其余位點均一致）的菌株，即20MG56 （AvrPik_A）、20MG189 （AvrPik_B）、20MG108 （AvrPik_D）、20MG27 （AvrPik_E）、20MG48 （AvrPik_F）共5個菌株進行表型觀察。培養10 d后，5個菌株的菌落形態均為圓形;除20MG27 （AvrPik_E）菌絲體為黑灰色外，其余菌株菌絲均為灰白色（圖3）。在生長速率方面，菌株20MG48 （AvrPik_F）生長最快，其平均菌落直徑為65.8 mm;菌株20MG189 （AvrPik_B）生長最慢，其平均菌落直徑為46.9 mm （表4）。顯微鏡觀察顯示，各個菌株的孢子形態無差異。在產孢方面，菌株20MG189 （AvrPik_B）和20MG108 （AvrPik_D）的產孢量較大，平均產孢數分別為8.75×107個/皿和8.55×107個/皿;菌株20MG48 （AvrPik_F）的產孢量最少，平均產孢數為9.0×106個/皿（表4）。

3?結論與討論

海南省雖然不是中國的稻米生產大省，但得天獨厚的氣候優勢使其成為全國雜交水稻種子生產大省。海南雜交水稻種子生產優勢區域規劃面積約為1.27萬 hm2，主要集中在北部的臨高，南部的樂東、三亞、陵水及周邊地區［1］。與南繁基地形成鮮明對比的是，常規水稻生產分布于全島，多為小農戶生產模式，管理粗放，部分稻田稻瘟病、白葉枯病、稻飛虱、稻縱卷葉螟等病蟲害發生嚴重［2］。由于水稻生產在海南尚未形成一個高效產業，故在水稻病蟲害防控及科研投入方面還比較薄弱。針對海南稻瘟病菌的研究主要側重于水稻品種對稻瘟病的抗性調查、鑒定與評價方面［2， 24］。

然而，無論是南繁育種區還是常規水稻種植區，稻瘟病均是水稻生產所面臨的障礙。因此，系統、準確地了解海南稻瘟病菌的群體遺傳結構及其變異規律是一個不可回避的課題。朱名海等對6個無毒基因（ACE1、AvrPia、AvrPik、AvrPita、AvrPiz-t和PWL2）在南繁核心區和非核心區60個稻瘟病菌菌株中的分布情況進行了PCR檢測，初步明確了這6個無毒基因在南繁區稻瘟病菌菌株中的分布規律［25］。本研究利用AvrPik基因特異性引物對海南稻作區分離的100株穗莖瘟菌株進行DNA擴增并對PCR產物進行克隆和序列分析。結果鑒定出AvrPik_A、AvrPik_B、AvrPik_D、AvrPik_E和AvrPik_F共5種主要等位基因類型，其中AvrPik_D類型最多，出現頻率為50.00%。2012年Kanzaki等［26］對來自歐洲（3個）、美洲（6個）、非洲（7個）、亞洲（23個）共計39個稻瘟病菌菌株的AvrPik等位基因型進行了分析，其中AvrPik_D為主要類型，本研究結果與其一致。不同的是Kanzaki等沒有檢測出AvrPik_B類型，而本研究未檢測出AvrPik_C類型。Li等對我國云南省東南、西南、東北以及西北稻作區的366個稻瘟病菌株進行檢測，發現AvrPik等位基因檢出率為66.7%～90.3%，并且除AvrPik_A、B、C、D、E類型之外，還鑒定出5個不同的等位基因類型［27］。由此可見，AvrPik等位基因存在地理分化，在不同水稻生產區出現了不同的變異，因此在生產應用過程中，種植含有Pik等位基因抗性品種時，應掌握目標區域AvrPik等位基因類型的組成和分布情況，科學地進行水稻稻瘟病抗性品種布局，有的放矢地開展抗瘟育種工作。

對南繁區與常規種植區病原菌群體核苷酸多樣性及其所承受的選擇壓分析表明，南繁區病原菌AvrPik等位基因的核苷酸多樣性與選擇壓均高于常規種植區。其原因可能是兩個區域稻種資源的抗性水平存在差異。與常規種植區相比，南繁區稻種資源更豐富，每年有大量包括Pik等位基因在內的抗源材料或抗性品種進入南繁區選育、加代種植等。而在稻瘟病菌與水稻長期協同進化過程中，AvrPik等位基因受到了水稻抗性基因Pik的定向選擇，與此同時，AvrPik等位基因為了逃避Pik等位基因的識別產生了更加豐富的變異。

本研究觀察了5個含有不同AvrPik等位基因型的代表菌株的生長特性和產孢能力。結果表明，5個菌株在菌落生長以及產孢能力方面存在一定差異。這一結果與郭敬瑋等對云南羅平120個田間稻瘟病菌株性狀研究結果一致［28］。本研究中5個菌株的差異是否與AvrPik等位基因型相關聯，還有待選取更多的田間菌株進行培養比較，以及進一步通過克隆與遺傳轉化，獲得單個基因的陽性克隆子進行深入研究。

參考文獻

［1］?鐘兆飛. 海南省雜交水稻種子產銷情況分析［J］. 雜交水稻， 2014， 29（3）： 35-37.

［2］?唐清杰， 嚴小微， 孟衛東. 海南水稻生產現狀分析及發展對策［J］. 雜交水稻， 2015， 30（1）： 1-5.

［3］?ZHANG Shijie， XU Jinrong. Effectors and effector delivery in Magnaporthe oryzae?［J/OL］. PLoS Pathogens， 2014， 10（1）： e1003826. DOI： 10.1371/journal.ppat.1003826.

［4］?ZHANG Shulin， WANG Ling， WU Weihuai， et al. Function and evolution of Magnaporthe oryzae avirulence gene AvrPib responding to the rice blast resistance gene Pib ［J/OL］. Scientific Reports， 2015， 5（1）： 11642. DOI： 10.1038/srep11642.

［5］?ORTIZ D， GUILLEN K D， CESARI S， et al. Recognition of the Magnaporthe oryzae effector AVR-Pia by the decoy domain of the rice NLR immune receptor RGA5 ［J］. Plant Cell， 2017， 29（1）： 156-168.

［6］?陳子強， 田大剛， 梁廷敏， 等. 229份水稻品種及重要育種材料抗稻瘟病Pik位點基因型鑒定［J］. 福建農業學報， 2016， 31（6）： 553-559.

［7］?SHARMA T R， MADHAV M S， SINGH B K， et al. High-resolution mapping， cloning and molecular characterization of the Pi-kh gene of rice， which confers resistance to Magnaporthe grisea?［J］. Molecular Genetics and Genomics， 2006， 274（6）： 569-578.

［8］?LI Luoye， WANG Ling， JING Jinxue， et al. The Pikm gene， conferring stable resistance to isolates of Magnaporthe oryzae， was finely mapped in a crossover-cold region on rice chromosome 11 ［J］. Molecular Breeding， 2007， 20（2）： 179-188.

［9］?XU Xin， HAYASHI N， WANG Chuntai， et al. Efficient authentic fine mapping of the rice blast resistance gene Pik-h in the Pik cluster， using new Pik-h-differentiating isolates ［J］. Molecular Breeding， 2008， 22（2）： 289-299.

［10］WANG Ling， XU Xiaoke， LIN Fei， et al. Characterization of rice blast resistance genes in the Pik cluster and fine mapping of the Pik-p locus ［J］. Phytopathology， 2009， 99（8）： 900-905.

［11］YUAN Bin， ZHAI Chun， WANG Wenjuan， et al. The Pik-p resistance to Magnaporthe oryzae in rice is mediated by a pair of closely linked CC-NBS-LRR genes ［J］. Theoretical & Applied Genetics， 2011， 122（5）： 1017-1028.

［12］ZHAI Chun， ZHANG Yu， YAO Nan， et al. Function and interaction of the coupled genes responsible for Pik-h encoded rice blast resistance ［J/OL］. PLoS ONE， 2014， 9（6）： e98067. DOI： 10.1371/journal.pone.0098067.

［13］張羽， 馮志峰， 崔明珠， 等. 稻瘟病抗性基因Pi-km 在陜西省稻種資源中的分布狀況［J］. 分子植物育種， 2013， 11（3）： 311-316.

［14］ZHAI Chun， LIN Fei， DONG Zhongqiu， et al. The isolation and characterization of Pik， a rice blast resistance gene which emerged after rice domestication ［J］. New Phytologist， 2011， 189（1）： 321-334.

［15］劉輝， 孟德龍， 査日揚， 等. 江蘇水稻品種稻瘟病主效抗性基因鑒定及應用評價［J］. 福建農業學報， 2015， 30（5）： 452-458.

［16］ZDRZAEK R， KAMOUN S， TERAUCHI R， et al. The rice NLR pair Pikp-1/Pikp-2 initiates cell death through receptor cooperation rather than negative regulation ［J/OL］. PLoS ONE， 2020， 15（9）： e0238616. DOI： 10.1371/journal.pone.0238616.

［17］PENG Zhirong， LI Ling， WU Shenghai， et al. Frequencies and variations of Magnaporthe oryzae avirulence genes in Hunan province， China ［J］. Plant Disease， 2021， 105（12）： 3829-3834.

［18］YOSHIDA K， SAITOH H， FUJISAWA S， et al. Association genetics reveals three novel avirulence genes from the rice blast fungal pathogen Magnaporthe oryzae?［J］. Plant Cell， 2009， 21（5）： 1573-1591.

［19］WU Weihuai， WANG Ling， ZHANG Shu， et al. Stepwise arms race between AvrPik and Pik alleles in the rice blast pathosystem ［J］. Molecular Plant Microbe Interactions， 2014， 27（8）： 759-769.

［20］MAIDMENT J H R， FRANCESCHETTI M， MAQBOOL A， et al. Multiple variants of the fungal effector AVR-Pik bind the HMA domain of the rice protein OsHIPP19， providing a foundation to engineer plant defense ［J/OL］. Journal of Biological Chemistry， 2021， 296： 100371. DOI： 10. 1016/j. jbc. 2021.100371.

［21］ZHANG Zhen， JIA Yulin， WANG Yanli， et al. A rapid survey of avirulence genes in field isolates of Magnaporthe oryzae ［J］. Plant Disease， 2020， 104（3）： 717-723.

［22］TAJIMA F. Statistical method for testing the neutral mutation hypothesis by DNA polymorphism ［J］. Genetics， 1989， 123（3）： 585-595.

［23］LIBRADO P， ROZAS J. DnaSP v5： a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data ［J］. Bioinformatics， 2009， 25（11）： 1451-1452.

［24］唐清杰， 王效寧， 云勇， 等. 海南普通野生稻稻瘟病的抗性鑒定與評價［J］. 中國野生植物資源， 2010， 29（6）： 8-10.

［25］朱名海， 趙美， 舒燦偉， 等. 南繁區稻瘟病菌無毒基因的檢測［J］. 華中農業大學學報， 2017， 36（4）： 21-25.

［26］KANZAKI H， YOSHIDA K， SAITOH H， et al. Arms race co-evolution of Magnaporthe oryzae AVR-Pik and rice Pik genes driven by their physical interactions ［J］. The Plant Journal， 2012， 72（6）： 894-907.

［27］LI Jinbin， WANG Qun， LI Chengyun， et al. Novel haplotypes and networks of AVR-Pik alleles in Magnaporthe oryzae ［J/OL］. BMC Plant Biology， 2019， 19（1）： 204. DOI： 10.1186/s12870-019-1817-8.

［28］郭敬瑋， 肖倩， 李怡然， 等. 云南羅平田間稻瘟菌株性狀及無毒基因研究［J］. 植物病理學報， 2021， 51（2）： 235-247.

（責任編輯：楊明麗）