QuEChERS-GC-MS/MS法同時測定青貯玉米飼料中20種農藥殘留

余 磊 趙志燊

（1．貴陽學院，貴州 貴陽 550005；2．貴州生態環境中優勢農產品殘留農藥降解關鍵技術研究重點實驗室，貴州 貴陽 550005）

玉米作為主要的糧食作物以及重要的飼料原料，在不同生長發育階段，收割玉米莖稈和果穗進行切碎加工并貯藏發酵，可以制得青貯玉米飼料[1-3]。青貯玉米具有產量高、營養豐富的特點，是重要的飼料來源[4-7]。為了減緩飼料作物的病蟲害，在玉米、大豆等主要飼料原料的農作物生產中使用農藥，會對飼料的生產安全造成隱患。施用的農藥不能完全消除，會隨著制成的飼料進入動物體內，會在一定程度上對肉、蛋、奶的品質造成影響，進而影響人類的健康[8]。因此，檢測青貯玉米飼料中的農藥殘留十分必要[9]。

目前，國內現有飼料中農藥殘留檢測相關標準《飼料中有機磷農藥殘留量的測定 氣相色譜法》（GB/T 18969—2003）僅限于有機磷類農藥殘留的測定。飼料樣品提取液經Envi-18柱、Envi-Carb柱、Sep-PakNH2柱凈化后上機分析，該方法樣品前處理時間長，提取液經3種不同凈化柱凈化時操作煩瑣，且凈化柱價格昂貴，會增加分析時間，提高價格成本。因此，需要一種更加簡便、準確、適應現代化檢測需求的新方法。本試驗采用改良的QuEchERS 技術前處理飼料樣品，以乙腈作為萃取溶劑，結合氣相色譜—三重四級桿串聯質譜法（GCMS/MS）檢測了飼料中20種農藥殘留，為確保飼料質量安全提供有效的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青貯玉米飼料為市售，共10 份，使用研磨儀粉碎，于2～4 ℃冷藏；敵敵畏、速滅磷、異丙威、禾草敵、硫磷嗪、滅線磷、治螟磷、久效磷、甲拌磷、甲基對硫磷、馬拉硫磷、殺螟硫磷、五氯硝基苯、殺撲磷、三唑磷、特丁硫磷、毒死蜱、對硫磷、苯硫磷、伐滅磷標準品，純度≥98.0%，購自德國Dr. Ehrenstorfer 公司；乙腈（色譜純）購自國藥集團化學試劑有限公司；氯化鈉（分析純）購自天津海昌試劑有限公司；丙酮、乙酸乙酯（色譜純）購自德國Dr. Ehrensorfer公司。

1.2 儀器與設備

QP-2020 氣相色譜質譜聯用儀購自日本島津公司；Fritsch 可變速高速旋轉粉碎機購自北京飛馳科學儀器有限公司；DMT-2500 多管旋渦混勻儀購自南京互川電子有限公司；LD5-2A臺式冷凍離心機購自常州杰博森儀器有限公司；ESJ220-4A 全自動電子分析天平購自沈陽龍騰電子有限公司；STRIKE 385旋轉蒸發儀購自優萊博技術（北京）有限公司；Smart2Pure 超純水儀購自上海宏宇儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

貯備液：分別稱取農藥對照品10.000 mg（精確至0.001 mg）于1 000 mL 容量瓶中，使用乙酸乙酯定容至刻度，即得質量濃度為0.01 g/L的標準貯備液。

曲線工作液：分別吸取5、10、20、50、100 μL標準貯備液于1.0 mL 容量瓶中，使用陰性樣品提取液定容至刻度，即得0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg/L的標準工作液。

1.3.2 單因素試驗

以檢測農藥的平均回收率為指標，分別設置提取方法（超聲波萃取、QuEChERS 前處理、加速溶劑萃?。?、提取溶劑（丙酮、乙酸乙酯、乙腈）和凈化劑［A 組為25 mg 乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）+35 mg十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）+20 mg 石墨化炭黑（GCB）+200 mg 無水MgSO4、B 組為50 mg PSA+75 mg C18+40 mg GCB+200 mg 無水MgSO4、C 組為80 mg PSA+110 mg C18+80 mg GCB+200 mg無水MgSO4）］為考察因素進行單因素試驗。

1.3.3 正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選取提取方法（A）、提取溶劑（B）、凈化劑種類（C）進行3因素3水平的正交試驗[10]，正交試驗的因素水平設計見表1。超聲波萃取條件為稱取5.0 g樣品于100 mL具塞試管中，加入10 mL乙腈后于超聲提取儀中提取，提取溫度為35 ℃、功率150 W、提取時間為10 min；加速溶劑萃取條件為稱取5.0 g 樣品與2.0 g硅藻土混勻后于加速溶劑萃儀中提取，萃取壓力為10.34 MPa、溫度為80 ℃，使用10 mL 乙腈靜態萃取10 min。

表1 正交試驗因素水平設計

1.3.4 樣品的QuEChERS前處理

準確稱取5.0 g 粉碎后的樣品，加入10 mL 乙腈溶劑旋渦振蕩提取30 min，加入4 g 氯化鈉，劇烈振蕩15 min，以5 000 r/min 的速度離心10 min。移取上清液2.0 mL 加入盛有50 mg PSA、75 mg C18、40 mg GCB、200 mg 無水硫酸鎂的離心管中，旋渦振蕩10 min，以8 000 r/min 離心5 min，取上清液過0.22 μm 微孔濾膜，供GC-MS/MS測定。

1.3.5 儀器條件

1.3.5.1 氣相色譜條件

毛細管柱為DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm），溶劑延遲時間3 min，進樣口溫度250 ℃，進樣方式為不分流進樣。柱溫程序為初始溫度為70 ℃，保持2 min，以10 ℃/min 升溫至160 ℃，以8 ℃/min 升溫至280 ℃，保留6 min。載氣為高純氦氣，純度≥99.999%。載氣控制方式恒線速度，線速度為47.6 cm/s。高壓進樣壓力250 kPa，柱流量1.05 mL/min，進樣量：1 μL。

1.3.5.2 質譜條件

電離方式為電子轟擊源（electron impact, EI)，離子源溫度200 ℃。碰撞誘導解離氣為高純氬氣，純度≥99.999%。色譜質譜接口溫度250 ℃，電離能量70 eV，檢測器電壓1.5 kV，采集方式多反應監測。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

選取一種青貯玉米飼料樣品為基質，準確稱取5.0 g粉碎后的樣品于50 mL 離心管中，加入10 mg/L 的20 種農藥混標溶液10 μL，按照1.3.3 節方法對樣品前處理及上機分析。在質荷比為40～500 amu 范圍內進行全掃描，得到20 種農藥的總離子流色譜圖，見圖1。根據全掃描數據確定各目標化合物的母離子和保留時間，采用子離子掃描方式得到產物離子，優化碰撞能量獲得響應最高的子離子。

利用質譜多反應監測（MRM）模式掃描，選擇質荷比較大、豐度較強的兩對特征離子作為定量和定性離子。為獲得最佳的質譜條件確保各目標化合物定性和定量的準確性，對目標化合物的母離子、產物離子、碰撞能量等質譜條件進行優化，獲得較理想的質譜條件及分離效果。20 種農藥標準物質經優化后得到的質譜條件參數見表2。

表2 20種農藥標準物質經優化后得到的質譜條件參數

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 提取方法對檢測農藥平均回收率的影響（見圖2）

圖2 提取方法對回收率的影響

由圖2可知，超聲波萃取、QuEChERS萃取、加速溶劑萃取的平均回收率分別為85.34%、89.87%、84.43%。超聲波萃取與加速溶劑萃取能耗較高、溶劑用量較大，且對樣品萃取后農藥平均回收率低于QuEChERS 萃取。因此，本試驗選擇QuEChERS萃取作為樣品的提取方法。

2.2.2 提取溶劑對檢測農藥平均回收率的影響（見圖3）

圖3 提取溶劑對回收率的影響

由圖3 可知，丙酮、乙酸乙酯、乙腈作為樣品的萃取溶劑時，農藥平均回收率分別為85.67%、83.12%、89.87%。因此，選擇乙腈作為樣品的萃取溶劑。

2.2.3 凈化劑對檢測農藥平均回收率的影響（見圖4）

圖4 凈化劑對回收率的影響

由圖4 可知，選擇3 組凈化劑對樣品提取液進行凈化，A 組、B 組、C 組農藥平均回收率分別為84.56%、89.54%、85.26%。因此，選擇農藥平均回收率較高的B組作為凈化劑。

2.3 正交試驗結果及方差分析結果（見表3、表4）

表3 正交試驗結果

表4 方差分析結果

由表3、表4及F檢驗結果分析可知，提取溶劑（B）與凈化劑（C）對農藥加標平均回收率具有顯著影響（P＜0.05），而提取方法（A）對農藥加標平均回收率的作用不顯著（P＞0.05）。各因素對農藥平均回收率的影響順序為C＞B＞A，即凈化劑＞提取溶劑＞提取方法。通過k值比較得到本試驗最佳因素組合為A2B3C2。驗證試驗測得20種農藥的平均回收率為89.45%，高于表3中20種農藥平均回收率的最大值85.71%。因此，該正交試驗的最佳條件確定為A2B3C2，即選擇QuEChERS 作為樣品提取方法、提取溶劑為乙腈、凈化劑為50 mg PSA+75 mg C18+40 mg GCB+200 mg無水MgSO4進行后續試驗。

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性回歸方程、檢出限及定量限

將標準曲線最低點工作液經適當稀釋后加入5.0 g陰性飼料樣品中，按照1.3節步驟操作得到樣品提取液進行上機分析，以其產生的3倍信噪比（S/N=3）計算方法檢出限[11-13]，10倍信噪比（S/N=10）計算方法定量限[14-17]。各農藥的線性方程、相關系數（R2）、方法檢出限以及方法定量限見表5。

表5 各農藥的回歸方程及相關信息

由表5可知，在質量濃度為0.05～1.00 mg/L范圍內方法線性良好，相關系數（R2）為0.996 4～0.999 9，方法檢出限為0.124～5.324 μg/kg，方法定量限為0.413～14.11 μg/kg，符合痕量分析要求。

2.4.2 精密度和加標回收率試驗

選取其中一種飼料樣品（編號：S1）為基質，加入20 種農藥標準溶液，其加標水平為20、60、100 μg/kg，測定加標回收率與精密度，各水平重復測定6 次，計算加標平均回收率與相對標準偏差（RSD），以相對標準偏差考察方法的精密度，20 種農藥的精密度和加標回收率試驗結果見表6。

表6 20種農藥的精密度和加標回收率試驗（n=6）

由表6 可知，各農藥的加標平均回收率為76.35%～104.56%，回收率試驗結果RSD為0.89%～11.45%（n=6），符合痕量分析要求。

2.5 實際樣品檢測

利用上述所建立的方法對市售10批次青貯玉米飼料進行農藥殘留檢測分析，檢測結果見表7。

表7 飼料樣品的檢測結果 單位：mg/kg

由表7 可知，所測樣品均有不同程度農藥檢出呈陽性，主要包括敵敵畏、久效磷、甲拌磷、馬拉硫磷、毒死蜱、對硫磷。所測樣品中敵敵畏、毒死蜱的檢出率最高均為50%，含量分別為0.019～0.044、0.037～0.078 mg/kg；久效磷與馬拉硫磷的檢出率均為40%，其含量值分別為0.018～0.051、0.012～0.037 mg/kg；甲拌磷與對硫磷的檢出率均為30%，其含量分別為0.045～0.125、0.019 9～0.095 0 mg/kg。

根據《國際食品飼料中農藥殘留限量法規》的相關規定，擬定敵敵畏、久效磷、甲拌磷、馬拉硫磷、毒死蜱、對硫磷的最大殘留限量值（MRLs）分別為0.2、0.2、1.0、0.1、0.5、0.6 mg/kg，所檢測樣品中呈陽性的農藥均未超過相應規定限量值。

3 討論

農產品樣品組織復雜，基質成分與目標物相差較大，并且存在農藥的同系物、異構體、降解產物、代謝產物和軛合物的影響，從而增加了農藥殘留分析的難度。農藥殘留分析中需要盡可能地將目標物溶入提取液中，通過凈化劑去除提取液中雜質的干擾，減少雜質色譜峰的影響，避免對色譜柱和檢測器的污染。因此，在農藥殘留分析中，根據不同樣品的性質選擇不同提取溶劑及凈化劑種類對分析結果的準確性至關重要。當提取溶劑及凈化劑種類確定后，選擇不同提取方法均能滿足《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）及《農藥殘留檢測方法國家標準編制指南》（農業農村部公告2386 號）中相應參數要求。李志等[18]選擇正己烷作為提取溶劑、PSA-C18(1∶1）作為凈化劑，探討超聲波萃取、QuEChERS 前處理、加速溶劑萃取等不同提取方法對刺梨中15 種有機氯農藥的殘留分析。結果顯示，3 種提取方法的回收均滿足農產品中農藥痕量分析要求。高效的提取試劑和凈化材料可以適應現代化檢測需求的新方法，在農藥殘留分析領域具有廣泛的應用前景。

4 結論

本研究采用市售10 批次青貯玉米飼料為研究對象，采用QuEChERS前處理技術結合氣相色譜-三重四級桿串聯質譜法對10批次青貯玉米飼料中的20種農藥殘留進行定性、定量分析。該方法前處理操作簡單、重復性好、靈敏度高，各農藥在質量濃度為0.05～1.00 mg/L范圍內線性關系良好，R2≥0.996 4，方法檢出限為0.124～5.324 μg/kg，方法定量限為0.413～14.110 μg/kg。20 種農藥在20、60、100 μg/kg 的加標濃度下，各農藥的平均加標回收率為76.35%～104.56%，回收率試驗結果RSD為0.89%～11.45%(n=6)。相比傳統農藥殘留檢測方法，該方法具有消除基質干擾、減少假陽性檢出率、提高分析檢測效率、降低分析成本的優點，能夠為飼料質量安全提供有效的檢測。