基于理性設計提高1,3-丙二醇氧化還原酶的穩定性和活性

付凱璇,王雪穎,黃彥喆,薛海曌,胡英菡,趙宗保

1(中國科學院大連化學物理研究所,遼寧 大連,116000)2(中國科學院大學,北京,100000)

1,3-丙二醇(1,3-propanediol,1,3-PD)是重要化工原料,廣泛應用于食品、化妝品和醫藥等領域[1]。根據GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》,丙二醇的功能為穩定劑和凝固劑、抗結劑、消泡劑、乳化劑、水分保持劑、增稠劑。目前1,3-PD生產方法主要分為化學法和生物法,與化學合成法相比,生物合成法有著設備成本低、條件溫和、環境友好的優點[2]。因此,生物轉化,尤其是以廉價原料甘油轉化生產1,3-PD,引起廣泛關注。目前已在克雷伯氏菌屬(Klebsiella)[3]、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)[4]、乳桿菌屬(Lactobacillus)[5]中發現了將甘油轉化為1,3-PD的天然途徑。該天然途徑涉及兩種關鍵酶,一是甘油脫水酶(glycerol dehydratase, GDHt, EC 4.2.1.30),可將甘油轉化為3-羥基丙醛(3-hydroxypropionaldehyde, 3-HPA);二是1,3-丙二醇氧化還原酶(1,3-propanediol oxidoreductase, PDOR, EC 1.1.1.202),在NADH的參與下,將3-HPA還原為1,3-PD(圖1-a、圖1-b)[6]。來源于肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)的PDOR(KpPDOR)由于其較高的催化活性和穩定性被廣泛研究(圖1-c)。KpPDOR適宜pH范圍窄,其最適pH值為7.4,而在pH 5.0和pH 10.0時還原活性僅剩40%和20%。溫度也是影響KpPDOR活性的因素,在37 ℃還原活性最佳,在20 ℃和55 ℃活性均降低10%[7]。PDOR作為生物合成1,3-PD的限速酶之一,其催化活性,耐溫、耐酸堿及穩定性是制約1,3-PD生物制造的重要因素。

a-甘油轉化為1,3-丙二醇;b-微生物甘油轉化合成1,3-丙二醇途徑;c-K.pneumoniae來源PDOR晶體結構

蛋白質定向進化已被廣泛應用于提高工業酶在高溫、酸堿環境和有機溶劑中的活性和穩定性[8],主要方法包括隨機突變、半理性設計和理性設計。隨機突變方法需構建大量突變體文庫和篩選,JIANG等[9]通過構建K.pneumoniae來源的PDOR的隨機突變文庫,篩選到氧化活性比野生型PDOR提高4.9倍的A199S突變體。然而,上述方法過程復雜且工作量大。半理性設計方法基于蛋白質結構和序列信息,結合計算機輔助,篩選熱點殘基,有效提高文庫構建效率。PARVEZ等[10]利用序列比對和蛋白結構信息,改造來源于丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum) PDOR的二聚體界面氨基酸,經定點飽和突變和篩選,獲得突變體P299E,在pH 4.0比野生型PDOR還原活性提高5倍,以及N298C,在pH 8.0下寬溫度范圍內還原活性提高,但該研究屬半理性方法,仍需構建單位點飽和突變文庫并篩選上千突變體。理性設計方法通過計算機技術分析蛋白結構和序列信息,指導小而精的定點突變文庫設計,提高定向進化效率。目前,生物信息學工具PoPMuSiC 2.1,通過計算蛋白突變的去折疊自由能ΔΔG,預測蛋白質突變后穩定性,其計算相關系數高達0.8[11],已成功輔助改良阿魏酸酯酶[12]、甘油脫水酶[13]和角蛋白酶[14]等蛋白的活性和穩定性。HotSpot Wizard 3.0被廣泛應用于識別蛋白的熱點氨基酸,以提高蛋白質的穩定性、催化活性、底物特異性等[15],其內置的CAVE、JSD和Fpocket組件可識別位于活性中心且突變后可提高催化功能的可變殘基。

本工作通過計算機輔助的方法,結合序列保守性分析,確立KpPDOR定點突變,最終獲得催化性能、熱穩定性、pH耐受性提高的突變體N262E和V155N。此外,進一步通過蛋白結構模擬探究了KpPDOR性能改良的結構基礎。靜息細胞轉化甘油合成1,3-PD,發現突變體N262E和V155N工程菌株1,3-PD產能高于野生型KpPDOR工程菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和培養基

本研究使用大腸桿菌(Escherichiacoli) BL21(DE3)作為蛋白質表達的宿主,Synbio Technologies股份有限公司合成肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)來源的PDOR的編碼基因dhaT,克隆在質粒pTrc99K-dhaT。通用生物股份有限公司合成丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)來源的GDHt的編碼基因dhaB12,克隆在質粒pET15b-dhaB12。2.6節中的工程菌株含有以上2個質粒。

LB培養基:胰蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,氯化鈉10 g/L。

TB培養基:胰蛋白胨12 g/L,酵母提取物24 g/L,磷酸氫二鉀0.072 mol/L,磷酸二氫鉀0.017 mol/L,甘油4 mL/L。

1.1.2 引物

引物由上海生工生物股份有限公司合成,如表1所示。

表1 本研究所用引物

1.1.3 主要試劑和儀器

NADH、3-HPA、甘油,北京鼎國昌盛生物技術公司。

Power Wave XS全波長酶標掃描儀,Bio-Tek Instruments Inc;Molecular Operating Environment(CCG),Montreal;AVANCE Ⅲ核磁共振譜儀(400 MHz),Bruker。

1.2 實驗方法

1.2.1K.pneumoniae來源PDOR的理性設計

PoPMuSiC 2.1(http://babylone.ulb.ac.be/popmusic)上傳KpPDOR(PDB ID:3BFJ)晶體結構,計算各位點突變后的去折疊自由能(ΔΔG),選取ΔΔG負值顯著的作為定點突變。用HotSpot Wizard 3.0 (https://loschmidt.chemi.muni.cz/)內置的CAVE、JSD和Fpocket組件預測功能熱點氨基酸,選取可變性分數(mutability score)≥6的氨基酸,并結合BLAST組件分析這些氨基酸的保守性,最終確定突變位點。

1.2.2 突變體的構建和酶活性測定

以質粒pTrc99K-dhaT為模板,通過不依賴限制性內切酶的克隆(RF克隆)方法[16]引入定點突變,PCR產物使用DpnI消化,電轉化至E.coliBL21(DE3)感受態細胞中,復蘇后,涂布于含卡那霉素的LB平板,37 ℃培養16 h,轉化子送上海生物工程有限公司測序。

將構建成功的突變體進行活性鑒定,24孔板培養野生型KpPDOR及其突變體的菌株,每孔2.5 mL LB,50 μg/mL卡那霉素,0.1 mmol/L IPTG,25 ℃誘導48 h,設置野生型KpPDOR為正對照,含pTrc99K空載體的E.coliBL21(DE3)為負對照,設置3個平行;培養結束收集菌體,每孔加入細胞裂解液250 μL[Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)10 mmol/L,MgCl21 mmol/L,溶菌酶1 mg/mL,DNaseI 0.1 mg/mL],37 ℃裂解2 h,離心留上清液。酶活性檢測體系:37 ℃,N-2-羥乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid, HEPES](pH 7.5)50 mmol/L,3-HPA 30 mmol/L,(NH4)2SO430 mmol/L,NADH 0.8 mmol/L,粗酶液10 μL。根據反應液在340 nm光吸收變化測定突變體的活性。

1.2.3KpPDOR和N262E、V155 N的純化

純化活性高于野生型KpPDOR的突變體蛋白,將野生型KpPDOR其突變體的菌體使用TB培養,50 μg/mL卡那霉素,0.1 mmol/L IPTG,25 ℃誘導48 h。菌液離心,收集菌體,洗滌后。置于冰浴中超聲破碎,離心收集裂解液上清,上清液倒入Ni-NTA層析柱,先后以洗滌緩沖液NWB(50 mmol/L NaH2PO4,0.5 mol/L NaCl,40 mmol/L咪唑,pH 8.0)洗滌雜蛋白,以洗脫緩沖液NEB(50 mmol/L NaH2PO4,0.5 mol/L NaCl,250 mmol/L咪唑,pH 8.0)洗脫,收集蛋白溶液,于超濾離心管中超濾濃縮。用Bradford方法以BSA為標準品測定蛋白質濃度。在12%變性SDS-PAGE凝膠中分析純化的N262E和V155N蛋白,以BeyoColorTM彩色預染蛋白分子質量標準(10～170 kDa)確定目的蛋白分子質量。

1.2.4 酶活力的測定

還原反應酶活性檢測體系37 ℃,HEPES(pH 7.5) 50 mmol/L,3-HPA 30 mmol/L,(NH4)2SO430 mmol/L,NADH 0.8 mmol/L,野生型和突變體純酶0.56 μg/mL。每個樣品設置3個平行。氧化反應測定體系為37 ℃,HEPES(pH 7.5) 50 mmol/L,(NH4)2SO430 mmol/L、NAD 2 mmol/L,酶0.52 μg/mL,1,3-PD 100 mmol/L。根據反應液在340 nm光吸收變化測定突變體的活性。酶活力單位的定義:每分鐘催化產生1 μmol NADH所需的酶量。NADH的摩爾消光系數為6.22 L/(mmol·cm)。

1.2.5 酶學性質研究

測定突變體在pH 2.0～12.0的酶活力,所用緩沖液為甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH 2.4) 100 mmol/L、乙酸-乙酸鈉緩沖液(pH 4.0) 100 mmol/L、HEPES緩沖液(pH 7.5) 50 mmol/L、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH 10.0) 50 mmol/L和氯化鉀-氫氧化鈉緩沖液(pH 12.0)200 mmol/L。檢測體系3-HPA 30 mmol/L、(NH4)2SO430 mmol/L、NADH 0.8 mmol/L、酶0.56 μg/mL,酶在37 ℃分別與pH 2.0～12.0的緩沖液孵育2 min后,加入3-HPA和NADH啟動反應。根據反應液在340 nm光吸收變化測定突變體的活性。每個樣品設置3個平行。研究酶的pH穩定性。酶在37 ℃分別與pH 2.0～12.0的緩沖液孵育1 h后,測定酶活力,以孵育2 min酶活力為100%,每個樣品設置3個平行。

測定突變體在溫度25～55 ℃的酶活力,檢測體系HEPES(pH 7.5) 50 mmol/L,3-HPA 30 mmol/L、(NH4)2SO430 mmol/L、NADH 0.8 mmol/L和酶0.56 μg/mL。酶在pH 7.5,25～55 ℃孵育2 min后,加入3-HPA和NADH啟動反應。根據反應液在340 nm光吸收變化測定突變體的活性。每個樣品設置3個平行。研究酶的溫度穩定性,酶分別在pH 7.5,25～55 ℃孵育1 h后,測定酶的殘余活力,以孵育2 min 酶活力為100%。每個樣品設置3個平行。

將純化后的KpPDOR及N262E,V155N在pH 7.5,37 ℃孵育,于0、30、60、120、180、240、300、330 min取樣并測定殘余酶活力。以孵育2 min酶活力為100%。將殘余酶活力的 ln值為對時間t作圖,計算酶失活速率常數k,由公式t1/2=ln2/k,計算酶的半衰期。

1.2.6 酶動力學

還原反應測定體系為HEPES(pH 7.5) 50 mmol/L,(NH4)2SO430 mmol/L、NADH 0.8 mmol/L,酶0.52 μg/mL,3-HPA梯度濃度,加超純水至100 μL,每個樣品設置3個平行。將酶在37 ℃,pH 7.5孵育2 min后。加入3-HPA和NADH啟動反應。根據反應液在340 nm光吸收變化測定突變體的活性。氧化反應測定體系為HEPES (pH 7.5) 50 mmol/L,(NH4)2SO430 mmol/L、NAD 2 mmol/L,酶0.52 μg/mL,1,3-PD梯度濃度,方法同上,每個樣品設置3個平行。使用Lineweaver-Burk雙倒數作圖法進行數據處理,計算動力學常數。

1.2.7 酶結構分析

使用分子操作環境(molecular operating environment,MOE)分別進行KpPDOR野生型和突變體的結構分析。選擇KpPDOR的晶體結構的A鏈作為模板,在A鏈的基礎上進行定點突變,并能量最小化。

1.2.8 靜息細胞催化

1.2.8.1 樣品準備

將1.1.1節中的質粒pET15b-dhaB12通過電轉化的方法分別轉入含有KpPDOR野生型和突變體質粒的E.coliBL21(DE3)中,構建工程菌株。將KpPDOR野生型和突變體的工程菌接入LB培養基(50 μg/mL卡那霉素和100 μg/mL羧芐青霉素)接菌,37 ℃培養12 h,以初始OD600值為0.05轉接于50 mL LB培養基(50 μg/mL卡那霉素,50 μg/mL羧芐青霉素 0.2 mmol/L IPTG),25 ℃誘導48 h。取7.5×109個細胞,用50 mmol/L HEPES緩沖液(pH 7.5)洗1次,然后用0.5 mL靜息細胞反應液(50 mmol/L HEPES,40 mmol/L 甘油)重懸,37 ℃、200 r/min反應2 h。加入等體積0.1 mol/L HCl終止,離心,取上清液。將樣品冷凍干燥,后溶于0.5 mL氘水中,加入順丁烯二酸使其終濃度為60 mmol/L。

1.2.8.2 定量核磁檢測產物

采用定量核磁氫譜方法(quantitative nuclear magnetic hydrogen spectroscopy,1H-qNMR)檢測1,3-PD含量,為了精準定量,選取合適的內標順丁烯二酸,其在氘水溶劑中化學位移6.3且不與樣品峰重合。設置D1為30 s以保證目的氫核馳豫充分;掃描次數NS為32以保證信噪比。

1.2.8.3 數據處理

將圖譜先進行基線和峰形的校正。根據文獻[17],1.7～1.8的五重峰歸屬與1,3-PD C2的2個氫原子,因此使用1.7～1.8處峰定量1,3-PD,利用核磁氫譜不同化學位移的氫峰面積與氫核數目成正比,用已知含量的順丁烯二酸作為定量標準,對1,3-PD進行定量。

2 結果與分析

2.1 理性設計定向突變

PoPMuSiC 2.1預測的結果(圖2)顯示了每個殘基的最優突變及其對應的去折疊自由能(ΔΔG),從中選擇ΔΔG負值顯著的L38E、V99H、G144T、V155N作為定點突變位點(圖2-c)。HotSpot Wizard 3.0內置的CAVE、JSD和Fpocket組件預測功能熱點氨基酸,選取可變性分數≥6的氨基酸作為候選位點(圖2-a),結合內置的BLAST組件分析候選位點序列保守性(圖2-b),其第276、272、283和262位氨基酸出現頻率最高的分別是Phe、Pro、Leu、Gly和Glu。綜上,構建L38E、V99H、G144T、V155N、N262E、N262G、L276F,Q272P,V283L共9個突變體(表2)。

表2 KpPDOR定點突變位點

a-HotSpot Wizard 3.0功能熱點氨基酸分析;b-HotSpot Wizard 3.0序列保守性分析;c-PoPMuSiC 2.1去折疊自由能分析;d-最終選定的突變位點

2.2 突變體的構建和活性鑒定

由RF克隆成功構建點突變后的質粒(圖3-a),轉入E.coliBL21(DE3)中。測定KpPDOR及突變體在37 ℃,pH 7.5的對3-HPA的還原活性,結果如圖3-b所示,N262E的還原活性是KpPDOR的1.1倍,V155N是KpPDOR的1.7倍。其余突變體活性均低于KpPDOR。將野生型KpPDOR、N262E、V155N通過Ni-NTA蛋白純化系統純化,并進行SDS-PAGE鑒定,KpPDOR、N262E、V155N純化后蛋白無雜帶,分子質量約為42 kDa(圖3-c)。

M-蛋白分子量標準;泳道1-WT;泳道2-N262E;泳道3-V155N

2.3 酶學性質探究

2.3.1 酶在不同pH的活性和穩定性

分別檢測了KpPDOR及其突變體在pH 2.0～12.0條件下的還原活性(圖4-a),KpPDOR最適pH 7.5,N262E、V155N的最適pH與KpPDOR一致。酸性條件(pH 4.0)下,V155N和N262E的酶活性分別為KpPDOR的2.5倍和1.9倍。堿性條件(pH 10.0)下,V155N酶活性為KpPDOR的1.6倍。因此,V155N在pH 4.0～10.0,N262E在pH 4.0～7.5活性高于KpPDOR,這表明V155N和N262E能適應更寬泛的pH條件。

a-KpPDOR和突變體在25～55 ℃的活性;b-KpPDOR和突變體在25～55 ℃的熱穩定性;c-KpPDOR和突變體在pH 2.0～12.0時的活性;d-KpPDOR和突變體在pH 2.0～12.0時的穩定性;e-KpPDOR和突變體在37 ℃時的半衰期;f-KpPDOR和突變體的Michaelis-Menten方程

pH穩定性的結果顯示(圖4-b),在pH 2.0～12.0孵育1 h后,KpPDOR分別保留57%、72%、76%、73%、64%、59%的殘余酶活力,V155N和N262E在相同條件下處理后,V155N和N262E殘余酶活力略高于KpPDOR,pH穩定性優于KpPDOR。

2.3.2 酶在不同溫度的活性和穩定性

分別檢測了KpPDOR及其突變體在25～55 ℃條件下的活性(圖4-c),KpPDOR最適溫度為37 ℃,N262E、V155N與KpPDOR一致。V155N在25、37、45、55 ℃酶活性分別是是KpPDOR的1.3、1.8、1.2、1.4倍。這表明V155N在不同溫度下保持更高的催化活性。

酶熱穩定性結果顯示(圖4-d),在25～55 ℃孵育1 h后,N262E分別保留87%、90%、84%、74%的殘余酶活力,高于KpPDOR,V155N在25～55 ℃殘余酶活力略高于KpPDOR。因此,N262E和V155N熱穩定性優于KpPDOR。

2.3.3 酶半衰期測定

測定KpPDOR和V155N、N262E在37 ℃,pH 7.5孵育0～300 min的殘余酶活力(圖4-d)。結果表明,在孵育120 min后,KpPDOR保留71%的酶活力,V155N和N262E分別保留78%和84%的殘余酶活力;在孵育240 min后,野生型KpPDOR保留56%的殘余酶活力,而V155N和N262E分別保留酶活力的64%和71%。N262E在37 ℃的半衰期為462 min,為KpPDOR的1.4倍,V155N的半衰期為365 min,為KpPDOR的1.1倍(圖4-e)。

2.4 酶動力學

測定KpPDOR和V155N、N262E的對還原反應的底物3-HPA和氧化反應底物1,3-PD的動力學數據(表3)。KpPDOR比酶活51.16 U/mg,V155N和N262E比酶活分別為72.08 U/mg和60.22 U/mg,分別比KpPDOR提高41%和18%。從還原反應來看,V155N和N262E的Km分別為KpPDOR的0.59倍和0.85倍,表明其對3-HPA結合親和力提高,催化效率kcat/Km分別為KpPDOR的2.7倍和1.49倍。氧化反應與還原反應的數據結果相互印證。

表3 野生型和突變體動力學

2.5 酶的結構分析

MOE分析野生型KpPDOR和V155N、N262E蛋白結構,如圖5所示。N取代155位上的V后,蛋白結構引入兩個氫鍵,V155N側鏈氮原子與D106側鏈羧基的氧原子形成距離2.01 ?的氫鍵;側鏈氧原子與K164側鏈氮原子形成距離2.72 ?的氫鍵(圖5-b)。氫鍵作為一種強非共價相互作用力,可穩定155位氨基酸所在的β-折疊,從而提高酶穩定性[18]。E取代262位N,N262E的羧基與R152上胍基的兩個氮原子形成距離分別為3.72 ?和3.97 ?的氫鍵(圖5-d),增強了催化中心的剛性[19]。

a-野生型V155位點與周圍氨基酸相互作用;b-突變體V155N位點與周圍氨基酸相互作用;c-野生型N262位點與周圍氨基酸相互作用;d-突變體N262E位點與周圍氨基酸相互作用

2.6 靜息細胞轉化結果

通過靜息細胞轉化,以甘油為底物轉化合成1,3-PD,以1H-qNMR方法對野生型KpPDOR和突變體V155N、N262E的工程菌1,3-PD產量進行定量,該方法具有快速便捷的優點[20]。圖6為不同菌株反應后產物的核磁共振氫譜,用已知含量的順丁烯二酸作為定量標準,以1.7～1.8的五重峰[17]對1,3-PD進行定量。

a-野生型KpPDOR反應后的譜圖;b-N262E反應后的譜圖;c-V155N反應后的譜圖;d-BL21(DE3)負對照反應后的譜圖

經數據處理,各體系中1,3-PD含量如表4所示。將順丁烯二酸的峰面積歸一化為2。經2 h的靜息細胞轉化后,野生型KpPDOR轉化后1,3-PD含量為12.3 mmol/L,產能0.82 mmol/L/OD600。突變體N262E和V155N轉化后的1,3-PD產能分別提升至0.90 mmol/L/OD600和1.16 mmol/L/OD600。這說明突變體對甘油生物轉化為1,3-PD具有促進作用。

表4 1H-qNMR數據處理結果

3 結論與討論

1,3-PD在食品領域常作為加工助劑、吸濕劑和溶劑。在備受關注的甘油生物轉化合成1,3-PD中,KpPDOR是其中的關鍵限速酶之一,因此,其催化活性、熱穩定性和pH耐受性的改良有重要價值。本研究改造KpPDOR的策略,一方面借助PoPMuSiC 2.1計算蛋白質熱穩定性的重要指標去折疊自由能ΔΔG,一方面借助Hotspot wizard 3.0功能熱點分析和保守序列分析,理性選取定點突變位點。最終成功獲得性能改良的N262E和V155N突變體,其可促進甘油轉化為1,3-PD。這說明其具有應用于1,3-PD生物制造的潛力。

本工作獲得25～55 ℃酶活力高于KpPDOR的V155N,以及熱穩定性高于KpPDOR的N262E,這拓寬了該酶在工業生產中寬溫度范圍的活性和穩定性。此外,寬pH范圍的活性和穩定性對1,3-PD合成也是至關重要的。有研究表明,由于微生物發酵產1,3-PD 積累有機酸,導致胞內pH值的下降會抑制KpPDOR活性,降低1,3-PD產量[21]。此外,有研究報道,pH 6.5時體外合成1,3-PD的產率是中性條件下的2.2倍[22]。這表明弱酸性環境有利于體外合成1,3-PD合成,因此提高KpPDOR耐酸性具有必要性。V155N pH 4.0的酸性條件下催化活性為KpPDOR的2.5倍,且同時在更寬溫度范圍活性高于KpPDOR。綜上分析表明,V155N具有應用于微生物內和體外環境生產1,3-PD的潛力。

本工作通過蛋白結構分析,加深了對蛋白結構和功能的認識。氫鍵作為蛋白最重要的非共價相互作用力,對維持蛋白質的二級、三級結構起到關鍵作用[23]。V155位于KpPDOR的β-折疊,N取代155位上的V,引入兩個氫鍵,與其形成氫鍵的D106和K164分別位于KpPDOR的α-螺旋和β-折疊(圖4-b),氫鍵穩定了該區域的二級結構,從而使V155N在較寬的pH和溫度范圍內的維持較穩定的構象,以發揮其活性。有研究表明,改造酶活性中心結構靈活的殘基可提高酶穩定性和活性,如引入氫鍵可提高催化中心剛性,使蛋白更穩定[19]。KpPDOR催化中心的262位點引入兩個氫鍵(圖4-d),提高其剛性,利于其在極端條件下保持催化中心的正確構象[24]。體外實驗結果與以上結構分析表現出一致性。如需進一步闡明KpPDOR構效關系,可結合X射線衍射、核磁共振和遠、近紫外光譜等手段來研究蛋白結構。

綜上所述,基于理性設計的方法指導KpPDOR改造,成功改良其催化活性、熱穩定性和耐酸性,有望提升1,3-PD的生物制造的產能,從而降低其在食品工業中的成本。獲得性能優化的突變體后,進一步通過結構分析闡釋了性能優化的結構基礎,加深了對生物酶構效關系的認識。本研究使用的理性設計的思路,也為改良其他工業酶的性能提供了指導。