甘肅河西走廊葡萄酒產區高產糖苷酶非釀酒酵母菌株篩選及其釀酒適應性分析

姚紅紅,任學梅,嚴幻汝,祝霞,2,楊學山,2*

1(甘肅農業大學 食品科學與工程學院,甘肅 蘭州,730070) 2(甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室,甘肅 蘭州,730070)

源自葡萄果實的萜烯、甲氧基吡嗪、C13-降異戊二烯和揮發性硫醇等品種香氣化合物,是呈現葡萄酒風格和特色的關鍵因素[1-2]。它們在漿果成熟期不斷合成和積累,主要以游離態或糖苷鍵合態形式存在[3]。含量遠大于游離態的非揮發性鍵合態香氣前體物,需要在發酵過程中通過酸解或糖苷酶催化,釋放出香氣糖苷配基才能被消費者感知[4]。酸解過程效率較低,且會造成部分配基重排[5];而酶解反應能高效釋放糖苷配基,最大程度避免香氣化合物重排。在已研究的葡萄香氣糖苷中,葡萄糖與阿拉伯糖、鼠李糖或木糖等進一步縮合而成的二糖苷占總糖苷的80%;其次為葡萄糖單糖苷(約10%),三糖苷含量最低[2]。因此,高效酶解釋放二糖苷鍵合態香氣前體物質,是提高葡萄酒品種香氣典型性的重要途徑。

二糖苷鍵合態化合物在酶解時,首先根據糖苷的差異,分別被α-L-阿拉伯糖苷酶(α-L-arabinofuranosidase,α-L-Ara,E.C 3.2.1.55)、α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase,α-L-Rha,E.C 3.2.1.40)或β-D-木糖苷酶(β-D-xylosidase,β-Xyl,E.C 3.2.1.37)等催化,釋放出相應的單萜基-β-D-葡萄糖苷;再在β-D-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,β-Glu,E.C 3.2.1.21)作用下即可釋放出揮發性香氣苷元[6]。有研究顯示,在葡萄酒釀造過程中外源性添加的糖苷酶,其活力易受發酵溫度、pH和SO2等因子的抑制,影響作用效果[7]。存在于釀酒葡萄果皮表面的非釀酒酵母(non-Saccharomycesyeasts)菌株,作為酒精發酵前期的主要驅動力,雖然發酵能力較弱,但可以合成活力更高、適應性更強的糖苷酶[8]。彭傳濤[9]從云南、河南和河北3個葡萄酒產區共分離485株酵母菌,通過篩選鑒定得到1株高產β-Glu的葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum),將其用于葡萄酒增香釀造試驗,發現葡萄酒感官質量和香氣成分明顯增強;徐建坤[10]從吐魯番盆地釀酒葡萄表皮篩選得到92株酵母菌,并進一步篩選高產β-Glu的菌株,發現5株產β-Glu較高的菌株,將其用于葡萄酒釀造,發現優選菌株對釋放源自葡萄的結合態香氣物質具有顯著作用;SPAGNA等[11]對300多株酵母菌進行篩選,發現1株異常畢赤酵母(Pichiaanomala)表現出較高的α-L-Ara活力;SABEL等[12]通過對異常維克漢遜酵母(Wickerhamomycesanomalus)產β-Glu的研究發現,該菌株也表現出了較高的α-L-Ara和β-Xyl活力,具有良好的葡萄酒增香釀造潛力?？傮w而言,目前關于非釀酒酵母菌株的β-Glu及其對葡萄酒香氣品質的研究相對較多,但對高產二糖苷酶優良菌株的篩選及相關酶學性質的研究還十分欠缺。

甘肅河西走廊產區葡萄種植歷史悠久,風土條件獨特,具備篩選本土非釀酒酵母菌株的自然資源優勢。本試驗分別從產區各子產地采集主栽釀酒葡萄進行自然發酵,通過七葉苷定性顯色法和對硝基苯酚(p-nitrophenol,p-NP)定量法篩選高產β-Glu、α-L-Ara、α-L-Rha、β-Xyl的優良本土非釀酒酵母菌株;并探討各糖苷酶對葡萄酒釀造因子的響應規律,評價發酵條件對菌株所產糖苷酶活力的影響。以期篩選、鑒定優良本土非釀酒酵母菌株,為產區葡萄酒增香釀造提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

在采收期分別從甘肅河西走廊葡萄酒廠采集主栽釀酒葡萄:嘉峪關紫軒(威代爾、美樂)、高臺祁連(貴人香、蛇龍珠)、張掖國風(美樂、赤霞珠)和武威莫高(貴人香、黑比諾)各10 kg,用無菌塑料袋封裝,冷藏條件下運回實驗室。樣品總糖198.85～279.00 g/L、pH 3.48～3.95、可滴定酸(酒石酸計)5.08～6.51 g/L,符合釀酒要求。

七葉苷、對硝基苯基β-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-β-D-glucopyranoside,p-NPG)、4-硝基苯基-α-L-吡喃鼠李糖苷(p-nitrophenyl-α-L-mannopyranoside,p-NP-αRha)、4-硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷(p-Nitrophenyl-α-L-arabinopyranoside,p-NP-αAra)、4-硝基苯基-β-D-吡喃木糖苷(p-nitrophenyl-β-D-xylopyranoside,p-NP-βXyl),上海源葉生物科技有限公司;酵母浸粉、蛋白胨,北京奧博星生物技術有限公司;無水葡萄糖、無水碳酸鈉、檸檬酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂等均為國產分析純,天津市光復精細化工研究所。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1FD型超凈工作臺、GZX-GF10-Ⅱ型恒溫干燥箱,上海躍進醫療器械有限公司;LDZX-50KBS型立式高壓蒸汽滅菌器,上海申安醫療器械廠;電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;生化培養箱,上海一恒科學儀器有限公司;pHS-3C型pH計,上海雷磁責任有限公司;TU-1810型可見分光光度計,上海元析儀器有限公司。

1.3 培養基

YPD培養基[13](g/L):葡萄糖20,酵母浸粉10,蛋白胨20,自然pH,固體培養基加入20 g/L的瓊脂,121 ℃滅菌20 min。

發酵培養基[14](g/L):蛋白胨20,葡萄糖20,NH4NO33,KH2PO44,MgSO4·7H2O 0.5,吐溫80 1%(體積分數)和酵母浸粉20。

WL培養基:購自北京奧博星生物技術有限責任公司。稱取80.25 g干粉加入1 000 mL蒸餾水中,加熱溶解分裝,121 ℃滅菌20 min,pH值為5.5±0.2。

初篩培養基[15](g/L):七葉苷3、檸檬酸鐵0.5、NaCl 2、MgSO4·7H2O 0.5、KH2PO41,121 ℃滅菌20 min。

1.4 實驗方法

1.4.1 菌株分離純化

葡萄分選、除梗破碎后,加入30 mg/L SO2,分批裝入5 L的玻璃發酵罐中,25 ℃自然發酵(樣液以子產區酒廠名稱+品種首字母命名)。每隔24 h測定發酵液的還原糖和酒精度變化。當發酵液殘糖≤4 g/L時,終止發酵。

待發酵啟動后,分別于2、4、6、8、10 d各取樣1 mL。樣液以十進制進行梯度稀釋,選取稀釋梯度為10-4、10-5、10-6的菌液,無菌吸取0.1 mL,均勻涂布于加有100 mg/L氯霉素(抑制細菌生長)的WL培養基上,并在28 ℃條件下培養3～5 d后,觀察菌落顏色形態及大小。

根據菌落顏色、形態及大小,挑取單菌落,在加有100 mg/L氯霉素的YPD固體培養基上劃線培養2～3代后,挑取菌落形態一致的菌株接種到YPD液體培養基活化48 h。配制40%的滅菌甘油,與菌液按照1∶1(體積比)的比例加入甘油管,-80 ℃保藏。

1.4.2 產β-Glu菌株初篩

七葉靈(6,7-2-羥基-香豆素-β-D-葡萄糖苷)在β-Glu的作用下能生成葡萄糖和七葉苷原(6,7-2-羥基-香豆素),七葉苷原和Fe3+作用呈棕黑色[16],可對菌株產酶情況進行初步定性分析。將再次YPD液體培養基活化后的菌株,分別按5%(體積分數)的接種量接入到含有七葉苷篩選培養基的96孔板中,28 ℃培養24 h后,根據顏色變化,將其分為高酶活力(深黑色“++++”)、較高酶活力(黑色“+++”)、中酶活力(深灰色“++”)、低酶活力(灰色“+”)和無酶活力(白色“-”)5個顯色等級。對顯色結果為深黑色的菌株,按照產區首字母大寫+品種名稱首字母大寫+菌株序號進行編號后,分別進行β-Glu、α-L-Ara、α-L-Rha、β-Xyl活力定量測定。

1.4.3 產糖苷酶菌株酶活力測定

(1)β-Glu:酶活力測定反應體系:200 μL反應底物(5 mmol/Lp-NPG),750 μL 0.2 mol/L檸檬酸-0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 5.0),250 μL培養液;反應條件:50 ℃恒溫水浴30 min。反應結束后加入1 mL 1 mol/L Na2CO3終止反應。在400 nm處測定吸光度。

酶活力單位(U)定義為pH 5.0,50 ℃反應條件下,1 min水解p-NPG生成1 μmolp-NP所需酶量。

(2)二糖苷酶:參考祝霞等[18]的方法。分別以p-NP-αRha、p-NP-αAra、p-NP-βXyl為底物。反應體系:250 μL培養液,130 μL底物,600 μL 0.2 mol/L檸檬酸-0.1 mol/L磷酸緩沖液;反應條件同β-Glu測定。加入1 mL 0.5 mol/L Na2CO3終止反應后,在400 nm 處測定吸光度。

酶活力單位(U)定義為pH 5.0、50 ℃條件下,每1 min水解p-NP-αRha、p-NP-αAra、p-NP-βXyl產生1 μmolp-NP所需酶量。

1.4.4 優選菌株鑒定

將優選菌株活化后涂布于WL培養基,28 ℃培養72 h,根據菌落形態特征進行初步分類。并對所選菌株進行重新命名,將M-H-1、Q-S-3、Z-W-2和Z-W-5分別命名為HX-1、HX-2、HX-3和HX-4。

基因組DNA提取。采用正向引物NL15′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′和NL4反向引物5′-GGTCCGTGGTTCAAGACGG-3′擴增26S rDNA。對PCR產物測序后,登錄NCBI數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進行BLAST分析。

1.4.5 糖苷酶的釀酒適應性分析

將保藏在-80 ℃的優選菌株接種到YPD液體培養基活化48 h,配制pH 3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、5.0、6.0、7.0的檸檬酸-磷酸緩沖液,按1.4.3節的方法(下同),測定菌株糖苷酶活力。

固定檸檬酸-磷酸緩沖液體系為pH 5.0,分別在水浴溫度為15、20、25、30、40、50、60、70 ℃、葡萄糖含量0、25、50、100、150、200、250、300 g/L、乙醇體積分數0%、5%、10%、12%、14%、15%、SO2添加量為0、10、20、30、40、50、60 mg/L(以Na2S2O5計)的參數條件下,測定糖苷酶活力。

2 結果與分析

2.1 自然發酵期間還原糖和酒精度的變化

發酵醪液還原糖和酒精度動力學曲線分別見圖1-A、圖1-B。整體而言,發酵初期(1～2 d),還原糖逐步下降,酒精度逐步上升;發酵中期(3～5 d),還原糖大幅下降,酒精度大幅上升;發酵后期(6～10 d),還原糖下降變緩,酒精度上升也變緩;當酒中還原糖含量≤4 g/L 時,發酵結束。取不同發酵階段(2、4、6、8、10 d)的發酵液進行菌株分離純化,得到912株酵母菌株。

A-還原糖含量;B-酒精度

2.2 產β-Glu菌株初篩

利用96孔板七葉苷培養基的顯色反應(圖2),按照顯色等級初步定性判定供試菌株β-Glu活力高低,快速從912株酵母菌中篩選出191株顯色等級不同的產β-Glu菌株。產酶菌株在不同發酵時期和不同產區分布不同,第2天高產β-Glu菌株共20株,其中分離自MGH有4株,MGG 1株,QLS 1株,ZXM 8株,ZXW 4株,GFM 2株。第4天高產β-Glu的菌株共有24株,其中MGH 1株,MGG 1株,ZXM 16株,ZXW 3株,GFM 3株。第6天高產β-Glu的菌株數量大幅下降,共有5株,其中QLS 2株,QLG 1株,GFM 2株。第8天和第10天未檢測到產酶菌株,可能與發酵后期酒精含量較高,抑制了非釀酒酵母菌株的生長繁殖有關。綜上,通過七葉苷定性初步篩選,共初選得到49株高產β-Glu菌株,其中分離自紫軒的高產β-Glu 菌株占比最高(ZXM 49.0%、ZXW 14.3%)。由此表明,非釀酒酵母菌株產糖苷酶的能力具有菌株差異性,且與生存的自然風土條件及發酵生境的動態變化存在一定相關性。

圖2 供試菌株在七葉苷培養基中的顯色篩選

2.3 菌株產糖苷酶活力定量測定

為了更準確表征初篩菌株的產酶能力,采用p-NP比色法分別對初篩得到的49株菌進行β-Glu、α-L-Ara、α-L-Rha、β-Xyl活力定量測定,結果如圖3所示。其中β-Glu活力較高的菌株有M-H-1(12.391 mU/mL)、Z-W-2(9.414 mU/mL)、Q-S-3(13.642 mU/mL)、Z-W-5(12.441 mU/mL)、Z-M-19(8.868 mU/mL)、Z-M-25(8.364 mU/mL)、G-M-5(10.593 mU/mL)。α-L-Ara活力較高的菌株有M-H-1(8.491 mU/mL)、Q-S-3(5.991 mU/mL)、Z-W-2(7.130 mU/mL)、Z-W-5(9.159 mU/mL)、Z-M-3(7.948 mU/mL)。α-L-Rha活力較高的菌株有M-H-1(8.305 mU/mL)、Z-W-2(6.959 mU/mL)、Q-S-3(5.334 mU/mL)、Z-W-5(6.721 mU/mL),β-Xyl活力較高的菌株有M-H-1(18.725 mU/mL)、Z-W-2(13.476 mU/mL)、Z-M-1(6.379 mU/mL)、Q-S-3(6.369 mU/mL),Z-W-5(6.291 mU/mL)。結合二糖苷香氣前體物酶解釋放的反應過程,綜合評價篩選結果,M-H-1、Z-W-2、Z-W-5和Q-S-3菌株不僅可以合成β-Glu,而且可以分泌高活力的二糖苷酶,具有在與釀酒酵母混菌發酵葡萄酒過程中增香的釀造應用潛力。為了便于后期應用,將上述4株菌依次分別命名為HX-1、HX-2、HX-3和HX-4。

圖3 本土菌株糖苷酶活性熱圖聚類分析

2.4 優選菌株系統發育樹構建

將優選菌株涂布于WL固體培養基,28 ℃培養72 h后的菌落形態見圖4。菌株HX-1、HX-3(圖4-A、圖4-B)菌落呈綠色,邊緣透明,扁平,表面光滑,有透明環,符合葡萄汁有孢漢遜酵母屬的菌落形態特征。菌株HX-2、HX-4(圖4-C、圖4-D)菌落呈突面,表面光滑,符合美極梅奇酵母屬(Metschnikowiapulcherrima)的菌落形態特征。

4株供試菌BLAST分析系統發育樹結果如圖5所示。相同的種被歸于一個主分枝內,表明它們具有較近的親緣性,而不同的種被歸于不同的亞分枝上,顯示它們在D1/D2區域序列上具有明顯區別。HX-1、HX-3與葡萄汁有孢漢遜酵母模式菌株X22-9、APY13的基因序列相似性達到98%以上,確定菌株HX-1與HX-3均為葡萄汁有孢漢遜酵母。HX-2、HX-4與美極梅奇酵母模式菌株NRRLY-7111的基因序列相似性>99%,確定菌株HX-3與HX-4為美極梅奇酵母。

圖5 基于26S rDNA序列的酵母菌株的系統發育樹

2.5 菌株糖苷酶對釀造因子的適應性分析

葡萄酒發酵過程中,大多數非釀酒酵母菌株在發酵初期占主導地位,其生長繁殖及所產糖苷酶活力受葡萄汁營養物質和發酵溫度、pH、酒精、糖含量和SO2添加量等的影響。通過測定各菌株糖苷酶在不同發酵條件下的活力并分析其變化規律,有助于在釀造過程中依據葡萄原料香氣糖苷特點,合理選擇發酵菌株并優化生產工藝參數。

2.5.1 菌株β-Glu活力變化

由圖6-A可知,4株菌所產β-Glu的最適pH均為5.0。pH 3.0～4.0時,菌株HX-4的酶活力保持在pH 5.0時的79.31%～96.99%,HX-2的酶活力保持在84.50%～91.09%。圖6-B表明,溫度對4株菌的酶活力的影響存在差異,除HX-4菌株外,其他3株菌的β-Glu最適溫度均為50 ℃;15～30 ℃時,HX-2的酶活力保持在最大酶活力的8.60%以上;HX-4保持在84.92%以上,而HX-3下降至最大酶活力的57.24%。由圖6-C可知,高質量濃度葡萄糖會抑制β-Glu活力,隨著葡萄糖含量的增大,4株菌酶活力均有不同程度的下降。其中HX-3菌株酶活力下降幅度最大,為初始酶活力(葡萄糖含量0 g/L)的61.59%,其他3株菌酶活力均保持在70%以上;當葡萄糖含量較低(<25 g/L)時,對HX-2和HX-4菌株的酶活力有小幅促進作用。乙醇體積分數<5%時,對酶活力幾乎沒有影響(圖6-D);隨著乙醇體積分數增大,酶活力開始小幅下降,當酶活力>12%時,除HX-2的酶活力保持在初始酶活力(乙醇體積分數0%)的95%以上,其他3株菌的酶活力下降幅度均增大;其中HX-3下降幅度最大(降幅32.07%),HX-1和HX-4菌株酶活力下降幅度≤14%,說明高乙醇含量對HX-1和HX-4菌株酶活力影響較小。隨著SO2含量增大,各菌株酶活力整體呈下降趨勢,但對HX-4菌株的酶活力影響較小(圖6-E)。

A-pH;B-溫度;C-葡萄糖含量;D-乙醇體積分數;E-SO2

葡萄酒釀造生境是一個低pH(3.0～4.0)、較低溫度(15～30 ℃)、高SO2(40～60 mg/L),且葡萄糖含量逐漸降低,酒精度逐漸上升的過程。綜合圖6結果可知,在葡萄酒釀造條件范圍內,HX-2和HX-4菌株可以保持較高的β-Glu活力。

2.5.2 菌株α-L-Rha活力變化

由圖7-A可知,4株菌所產α-L-Rha最適pH值為5.0。隨著pH降低,酶活力下降幅度(22.42%～34.36%)比pH上升時降幅(13.49%～27.89%)更大,說明α-L-Rha對低pH耐受性較弱。當pH值在3.0～4.0時,HX-1可保持pH 5.0時酶活力的69.58%～91.96%。圖7-B顯示,HX-1的最適溫度在40～50 ℃,其他3株菌的最適溫度為50 ℃。15～30 ℃時,HX-1菌株的酶活力在最適溫度時的85.88%以上,相較其他3株菌能夠保持較高的酶活力。隨著葡萄糖含量的增大,菌株酶活力受到抑制,其中HX-1,HX-3保持較高酶活力,分別為初始酶活力的81.60%和77.09%;除HX-4外,低葡萄糖含量(<50 g/L)對其他3株菌酶活力有不同程度的促進作用(圖7-C)。乙醇體積分數<12%時,對α-L-Rha活力抑制作用不明顯,隨著乙醇體積分數增大,酶活力下降幅度增大,其中HX-2降幅(18.54%)最大(圖7-D)。圖7-E表明,SO2含量對4株菌α-L-Rha活力均有抑制作用,當SO2含量>40 mg/L時,HX-3酶活力大幅(29.53%)下降,而其他3株菌酶活力下降幅度(10%左右)大致相同。綜合圖7結果可以看出,在葡萄酒釀造條件范圍內,來源于HX-1的α-L-Rha活力始終保持較高水平,具有較高耐受性。

A-pH;B-溫度;C-葡萄糖含量;D-乙醇體積分數;E-SO2

2.5.3 菌株α-L-Ara活力變化

由圖8-A可知,4株菌所產α-L-Ara最適pH值為5.0。pH 3.0～4.0時,菌株酶活力均保持在74%以上,其中HX-1和HX-4保持在82%以上。圖8-B,α-L-Ara最適溫度在50～60 ℃。15 ℃～30 ℃時,HX-1和HX-2酶活力保持了最適溫度時的83.60%以上,其他2株菌酶活力在75.72%以上。圖8-C表明,較低葡萄糖含量(<50 g/L)對部分菌株酶活力具有促進作用;而隨著葡萄糖含量的增大,α-L-Ara活力呈下降趨勢,其中HX-3下降幅度(降幅31.80%)最大,其他3株菌降幅在23%左右,說明該酶對高葡萄糖耐受性較低。如圖8-D所示,當乙醇體積分數達到10%時,對酶活力抑制作用增大,其中HX-2酶活力下降至初始酶活力的70.45%,HX-1,HX-4酶活力保持在84%以上。SO2含量對4株菌α-L-Ara活力均有抑制作用,且從圖8-E來看,不同菌株酶活力下降程度差異不明顯,4株菌酶活力均保持在初始酶活力(不添加SO2)87.74%以上。綜合圖8結果可知,在葡萄酒發酵條件下,HX-4菌株所產α-L-Ara可以保持較高酶活力。

A-pH;B-溫度;C-葡萄糖含量;D-乙醇體積分數;E-SO2

2.5.4 菌株β-Xyl活力變化

如圖9-A可知,不同菌株β-Xyl最適pH不同,其中HX-1的最適pH值為6.0,其他3株菌的最適pH值為5.0。pH值在3.0～4.0時,HX-3保持在91%以上,HX-1在80%以上。β-Xyl最適溫度在50～60 ℃,溫度對不同菌株β-Xyl的影響差異較明顯,其中對HX-1酶活力影響程度較大。15～30 ℃時,HX-3保持了86.98%～94.58%的酶活力,HX-2、HX-4酶活力保留了62.13%～82.31%(圖9-B)。圖9-C表明,葡萄糖含量對4株菌β-Xyl活力均有抑制作用。隨著葡萄糖含量增大,HX-2和HX-4菌株酶活力下降10%左右;當葡萄糖含量<100 g/L時,HX-1和HX-3酶活力迅速下降(降幅43.6%和32.7%)。圖9-D顯示,隨著乙醇體積分數的增大,HX-1酶活力下降趨勢(降幅58.22%)增大;而乙醇體積分數<12%時,其他3株菌下降趨勢平緩(降幅14%左右)。由圖9-E可以看出,SO2對4株菌的β-Xyl均有較低抑制作用,其中HX-2和HX-3酶活力保持在初始酶活力的94%以上。綜上,雖然HX-1的β-Xyl對溫度和乙醇含量耐受性較低,但其初始酶活力相較其他3株菌為最高,在釀造條件下仍可保持較高酶活力。

A-pH;B-溫度;C-葡萄糖含量;D-乙醇體積分數;E-SO2

3 討論

本研究通過p-NP比色法測定了河西走廊產區本土非釀酒酵母菌株的β-Glu、α-L-Ara、α-L-Rha、β-Xyl活力,最終優選出高產單糖苷和/或二糖苷酶的4株非釀酒酵母菌株。經26S rDNA D1/D2序列分析,確定HX-1和HX-3為葡萄汁有孢漢遜酵母,HX-2和HX-4為美極梅奇酵母。4株菌產酶結果表明,HX-1所產4種酶活力都較高,與MATEO等[19]篩選的2株葡萄汁有孢漢遜酵母的產酶情況一致;HX-3的β-Glu和β-Xyl表現出高活力,HX-4的β-Glu和α-L-Ara表現出高活力,HX-2僅對β-Glu表現出高活力,表明非釀酒酵母合成分泌糖苷酶具有種間和種內菌株差異[20]。

菌株糖苷酶釀造適應性研究發現,其酶活力易受溫度、pH和SO2等發酵條件的影響。本研究中,各糖苷酶最適pH值為5.0～6.0,且pH對不同菌株糖苷酶活力的影響有較大差異,其中β-Glu活力變化最大,這與KUO等[21]的研究結果一致。本研究中各糖苷酶最適溫度在30～60 ℃,與來源于真菌的糖苷酶最適溫度在30～60 ℃的結論一致[22],且大部分菌株糖苷酶對高溫耐受性更高,與馬得草[7]的結果一致。HU等[23]指出,高葡萄糖含量對膠紅酵母β-Glu具有抑制作用,且隨著葡萄糖含量的增大抑制作用越明顯。本研究中各糖苷酶活力均被抑制,表明糖苷酶對葡萄糖耐受性較低。除來源于HX-1的β-Xyl外,其他菌株各糖苷酶活力受乙醇影響的結果相似,當乙醇體積分數<10%或12%時,酶活力下降幅度較小,部分菌株酶活力保持穩定,與BAFFI等[24]對出芽短梗霉β-Glu在乙醇體積分數為10%和15%時分別保持了94%和71%的初始活性一致,且在β-Xyl中也得到同樣的結果[17]。有研究表明,低濃度的SO2(<20 mg/L)對非釀酒酵母的生長繁殖并不會起到抑制作用,質量濃度過高(>50 mg/L)才會表現出抑制作用,且一些非釀酒酵母對SO2具有較高的耐受性[25],本研究中除HX-3 α-L-Rha在SO2含量>40 mg/L時下降幅度(29.53%)較大外,SO2含量對其他菌株各糖苷酶活力影響差異不明顯,說明菌株各糖苷酶對SO2具有較高的耐受性。

已有研究表明,不同葡萄品種香氣糖苷含量及種類不同,甚至有些品種具有其獨特的糖苷種類[26]。例如,在小粒麝香葡萄中,含量最豐富的香氣糖苷是葡萄糖苷和芹菜糖苷,分別為37%和35%[27];在Ecolly、蛇龍珠和玫瑰香中分別檢測到7、9和13種萜烯糖苷,其中4種為這3種葡萄所共有,而芳樟醇-3-O-α-L-阿拉伯呋喃-β-D-吡喃葡萄糖苷為Ecoll所特有,吡喃氧化芳樟醇-α-L-阿拉伯呋喃-β-D-吡喃葡萄糖苷為蛇龍珠所特有[28]。劉吉彬[29]通過研究4個不同芳香型葡萄品種(小白玫瑰、玫瑰香、愛格麗和蛇龍珠)中萜烯類香氣糖苷,共檢測到16種萜烯類糖苷:玫瑰香(13種)、蛇龍珠(9種)、小白玫瑰(9種)、愛格麗(7種),其中8-羥基里哪醇-芹菜糖呋喃基-葡萄糖苷與香茅醇-芹菜糖呋喃基-葡萄糖苷僅存在于玫瑰香葡萄果實中,吡喃-氧化里哪醇-呋喃阿拉伯糖基-葡萄糖苷僅存在于愛格麗葡萄果實中。因此,針對不同葡萄品種中糖苷含量和種類的不同,選擇產對應糖苷酶較高的非釀酒酵母應用于葡萄酒釀造,對葡萄酒香氣提升及特色葡萄酒生產具有重要意義。

4 結論

本試驗以甘肅河西走廊各子產區主栽釀酒葡萄自然發酵的酒樣為試材,選取不同發酵時期的發酵液分離純化得到912株酵母菌。利用96孔板七葉苷培養基進行糖苷酶活性初篩,并采用p-NP法對供試菌株的β-Glu、α-L-Ara、α-L-Rha、β-Xyl粗酶液進行定量測定。酶活力熱圖聚類分析結果顯示,菌株HX-1、HX-2、HX-3、HX-4的4種酶活力均表現出較高水平。菌株26S rDNA D1/D2 PCR擴增測序結果表明,HX-1和HX-3為葡萄汁有孢漢遜酵母,HX-2和HX-4為美極梅奇酵母。

葡萄酒釀造因子對不同菌株酶活力耐受性的影響具有菌株依賴性,高乙醇、高葡萄糖和SO2含量對各糖苷酶均有抑制作用。在正常葡萄酒釀造條件范圍內,HX-2和HX-4菌株的β-Glu保持了較高活力;HX-1菌株的α-L-Rha、HX-4菌株的α-L-Ara、HX-1和HX-3的β-Xyl活力較高。因此,在實際釀酒生產中,可根據不同葡萄品種中香氣糖苷含量及種類,選擇對應糖苷酶活力較高的菌株應用于葡萄酒釀造。