超濾結合電滲析技術純化鐵皮石斛多糖的研究

千佩玉,李遠樂樂,馮思敏,2*,陳碧蓮,邵平,2*

1(浙江工業大學 食品科學與工程學院,浙江 杭州,310000) 2(中國輕工業食品大分子資源加工技術研究重點實驗室(浙江工業大學), 浙江 杭州,310000) 3(浙江省食品藥品檢驗研究院,浙江 杭州,310051)

鐵皮石斛富含多糖、氨基酸、生物堿等多種活性成分[1],作為藥食兩用物質,在中國已有2 000多年的應用歷史。鐵皮石斛多糖是一種中性多糖,主要由β-D-吡喃葡萄糖和β-D-甘露吡喃糖組成,這2種單糖有清除羥基自由基的作用,使得鐵皮石斛多糖具有一定的抗氧化活性[2]。同時,許多研究表明,鐵皮石斛多糖在增強免疫系統、抗癌、抗腫瘤等方面有顯著功效。但是,鐵皮石斛多糖的應用卻并不廣泛。一方面,是因為多糖提取液中含有的無機鹽類、單糖類、寡糖類、木質素、蛋白質等多種雜質會影響多糖的應用;另一方面,乙醇和氯仿沉淀等傳統的多糖純化方法存在許多缺點,例如大量使用化學試劑、提取時間長、以及提取過程中可能導致多糖結構發生變化等。此外,土壤和水源的污染會使得重金屬在植物中富集,重金屬通過食物鏈進入人體后很難排出體外[3],而多糖作為重金屬的主要結合底物,提取得到的鐵皮石斛多糖可能存在重金屬超標的風險。多糖中高重金屬含量不僅會影響多糖的質量,也會對人體健康產生不利影響。如何在綠色環保的前提下,開發一種提高鐵皮石斛多糖提取回收率及純度的工業化提取方法,仍是鐵皮石斛多糖提取領域研究的重點。

本研究選擇膜分離技術對鐵皮石斛粗多糖進行純化,膜分離技術作為一種高效、低成本物理純化方法,不使用額外的化學試劑,操作條件溫和,不會改變多糖的化學結構,而且與離心、過濾相比,膜分離技術純化多糖的效率更高。同時,本研究采用電滲析技術去除多糖中的金屬離子,電滲析作為一種能夠有效去除金屬離子的技術,具有廢棄物排放率低、化學品消耗低和模塊化程度高的優點,已有研究將其應用于有機溶液的脫鹽處理[4]。曾有研究證明了應用電滲析和色譜技術去除青貯汁中鹽的可行性[5],并且LUIZ等[6]使用電滲析成功分離了生物精煉廢水中的鹽和有機物,鹽的去除率達到96%。

根據現有的文獻可知,雖然電滲析技術在海水淡化過程中已經得到了廣泛的應用[7],但尚未有關于電滲析應用于去除有機化合物中重金屬離子方面的研究[8]。本研究開發了一種純化鐵皮石斛多糖的新方法,通過兩步超濾結合電滲析技術,在能夠獲得較高得率和純度的鐵皮石斛多糖的同時,還能有效去除鐵皮石斛多糖中的金屬離子,尤其是重金屬離子,且提取過程更加綠色、高效、低能耗。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵皮石斛葉,購自浙江溫州樂清;福林酚試劑、考馬斯亮藍、NaOH、HCl、NaCl,均為試劑純,上海阿拉丁生化科技有限公司;截留分子質量(molecular weight cutoff,MWCO)為3、5、8、500 kDa的商用聚醚砜膜(polyether sulfone membrane, PES),北京中科銳揚科技有限公司。

1.2 儀器與設備

85-2型磁力攪拌器,杭州儀表電機有限公司;紫外分光光度計,北京高能科迪科技有限公司;Sartorius PB-10型pH計、DDSJ-308A型電導率測定儀,雷滋儀電科學儀器股份有限公司;切向流超濾系統、實驗室電滲析測試儀,浙江賽特膜技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 鐵皮石斛粗多糖提取

參考韓娟娟等[9]的方法提取制備鐵皮石斛多糖。將鐵皮石斛葉清洗后烘干粉碎脫脂,并在70 ℃去離子水中浸提3次,時間為2 h,料液比(g∶mL)為1∶25,合并水提液后利用旋轉蒸發儀進行濃縮,將濃縮液用95%(體積分數)無水乙醇沉淀過夜,最后離心收集下層沉積物,將其凍干后得到鐵皮石斛粗多糖粉末。根據凍干后的粗多糖質量與烘干后的鐵皮石斛葉粉末質量之比計算鐵皮石斛粗多糖的提取率。

1.3.2 第一步超濾過程

第一步超濾(first ultrafiltration,UF-1st)利用截留分子質量為500 kDa的PES去除部分大分子雜質,如部分木質素、蛋白質等。UF-1st通過食品級超濾納濾膜片測試系統進行,超濾膜池的有效過濾面積為67 cm2。在實驗開始前,將實驗所需PES膜在去離子水中浸泡24 h,預壓處理1 h,以確保膜分離過程中膜的穩定性。稱取提取得到的鐵皮石斛粗多糖粉末20 g加入500 mL去離子水中充分攪拌溶解后,加入HCl或NaOH調節溶液pH值,在室溫[(25±1) ℃]下探究NaCl含量(0、0.5、1、1.5、2 mol/L)以及循環次數(1、2、3、4、5、6、7次)對膜滲透效果的影響,確定最佳通量。并收集透過液和截留液分別測量多糖含量,將透過液濃縮凍干后用于后續實驗。

1.3.3 電滲析脫鹽過程

通過電滲析快速有效地脫除鹽及重金屬離子。電滲析裝置的膜池裝備有6個陰離子交換膜(AEM-Type Ⅱ)和6個陽離子交換膜(CEM-Type Ⅱ),離子交換膜的有效面積為189 cm2,采用3%(質量分數)的無水Na2SO4溶液作為極性溶液,通入各級電滲析的陽極室和陰極室。去離子水作為濃縮室溶液,鐵皮石斛多糖溶液作為淡化室溶液。實驗在室溫[(25±1) ℃]下進行,實驗過程中極液室、濃縮室以及淡化室的流量均為300 mL/min。為了探究在5、10、15 V電壓下不同電滲析操作對于多糖溶液鹽及重金屬離子脫除效果的影響,每5 min取淡化室溶液測量電導率(X),最終的脫鹽率(DR)根據淡化液的初始電導率和最終電導率按照公式(1)計算:

(1)

1.3.4 第二步超濾過程

在電滲析完成后,通過第二步超濾工藝(UF-2nd)將脫鹽后的鐵皮石斛多糖溶液進行濃縮和純化,并改變溫度(25、30、35、40、45、50 ℃)和pH(4、5、6、7、8、9)進行參數優化。在這一過程中,研究使用截流分子質量為3、5、8 kDa的商用PES膜去除單糖、寡糖等小分子雜質,進一步純化石斛多糖。收集透過液和截留液分別測量多糖含量,收集截流液并濃縮凍干用于后續實驗。

1.3.5 重金屬含量測定

重金屬含量測定參考國標方法GB 5009.12—2017(鉛)、GB 5009.13—2017(銅)、GB 5009.15—2014(鎘),采用電感耦合等離子體質譜法(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS)進行測定。取鐵皮石斛多糖粉末于60 ℃下干燥4 h。取樣品粉末各0.2 g分別加入5 mL硝酸、2 mL過氧化氫,搖勻后放置于微波消解罐中。待消解完成后,將溶液轉移至量瓶中,少量水洗滌消解罐3次后合并至量瓶中,得到待測樣溶液。同時作試劑空白和標準試劑參考物質溶液[10],將空白、標準試劑和待測樣液與內標溶液一同按照ICP-MS工作條件進行測定。

1.3.6 總糖含量測定

總糖含量根據苯酚-硫酸法測定,參考譚喜平等[11]的方法并進行一些修改。稱取10 mg鐵皮石斛葉樣品加入去離子水定容至25 mL。精確吸取2 mL定容后的樣品溶液于試管中,加入1 mL質量分數5%苯酚和5 mL 95%(體積分數)H2SO4后,振蕩搖勻后沸水浴15 min,在水流下冷卻至室溫。使用紫外-可見分光光度計測量樣品溶液在490 nm處吸光度,以蒸餾水為空白對照。

1.3.7 鐵皮石斛多糖含量測定

鐵皮石斛多糖含量由樣品溶液中的總糖含量減去還原糖含量計算得到。還原糖測定采用二硝基水楊酸法[12]并稍作修改。取1 mL樣品溶液加入試管中并與3 mL二硝基水楊酸試劑混合,振蕩混勻后沸水浴5 min,在水流下冷卻至室溫。使用紫外-可見分光光度計測量樣品溶液在540 nm的吸光度,以蒸餾水為空白對照。

1.3.8 鐵皮石斛多糖回收率及純度

根據鐵皮石斛多糖的回收率(R)和多糖純度(P)衡量多糖品質。多糖的純度是經過兩步超濾及電滲析實驗得到的鐵皮石斛多糖的質量與實驗得到的產品總糖質量的比值。多糖純度計算如公式(2)所示:

(2)

第一步超濾中的鐵皮石斛多糖回收率(R1)根據該超濾過程得到的產品中多糖的質量與鐵皮石斛粗多糖粉末質量的比值計算得到,如公式(3)所示:

(3)

第二步超濾中的鐵皮石斛多糖回收率(R2)根據該超濾過程得到的產品中多糖的質量與超濾前的樣品質量的比值計算得到,如公式(4)所示:

(4)

1.3.9 統計分析

本文所有數據均重復測定3次,實驗數據為平均值±標準偏差,采用Origin 9.1進行作圖,使用單因素方差分析(SPSS)進行數據處理和分析。

2 結果與分析

2.1 NaCl對UF-1st單元中多糖提取效果的影響

本研究通過在鐵皮石斛多糖提取過程中加入不同含量的NaCl來減少鹽溶性多糖的損失,提高了多糖的整體回收率,并探究最適宜的NaCl濃度。如圖1所示,多糖的提取率隨著NaCl濃度的增加而呈現先升高后降低的趨勢。植物多糖的粗提取一般采用熱水提取、生物酶提取、超聲波提取等方法,這些方法均采用純水作為溶劑[13]。然而有研究發現在魚腥草、中草藥、鐵皮石斛及部分果蔬中含有少量的鹽溶性多糖[14],與水溶性多糖相比,鹽溶性多糖由于含量低而常被傳統的以水為溶劑的多糖提取工藝忽視。加入0.5 mol/L的NaCl時鐵皮石斛多糖的提取率最高,達到了15.7%。這可能是由于NaCl的加入增強了鐵皮石斛多糖分子的表面電荷,進而使得多糖分子與水分子之間的相互作用增強,提高了多糖在水溶液中的溶解度[15]。在NaCl含量高于0.5 mol/L時鐵皮石斛多糖提取率下降可能是因為多糖是由多個單糖分子組成的,含有大量羥基和一些陰離子,當加入過多的游離鈉時會產生靜電屏蔽效應,同時破壞多糖的雙電層結構,造成了多糖的損失[16]。

圖1 NaCl含量對多糖提取率的影響

2.2 循環次數對UF-1st單元中鐵皮石斛多糖提取的影響

第一步超濾過程中多糖的損失主要是由于多糖溶液具有一定黏度,在超濾管道和進料罐等中會有殘留,因此在實驗中采用連續循環超濾的方式來提高UF-1st單元整個過程中多糖的回收率[17]。首先使用截留分子質量為500 kDa的超濾膜將多糖溶液從500 mL濃縮至300 mL,在截留的多糖溶液中加入去離子水至500 mL后繼續超濾循環,并在每次超濾循環后測量截留液中的多糖含量。圖2顯示了超濾提取次數對鐵皮石斛多糖含量的影響。循環次數僅為1次時,多糖的回收率只有30.8%,隨著循環次數的增加,多糖回收率顯著提高,但多糖的純度持續下降。多糖純度下降可能是因為大分子的多糖之間存在架橋作用,使得分子團聚在一起,但是一些小分子的雜質能夠從團聚分子的空隙中透過膜孔,隨著循環的次數增加,分子架橋增多,這樣的現象趨于明顯,影響最后的多糖純度。超濾循環5次后,隨著循環次數增加,多糖回收率基本保持不變。同時,實驗結果表明多糖的滲透通量隨著循環次數的增加而基本呈現降低的趨勢,這可能是由于隨著循環次數的增加,溶質不斷在膜表面積累,同時水不斷透過膜使得膜表面的溶質濃度增加。在濃度梯度作用下,溶質與水向相反方向擴散,在膜表面形成溶質濃度分布邊界層,阻礙了水的透過。在第二次循環中滲透通量略有增加,這可能是因為在多糖分子以疊加方式聚集并且在膜表面產生濾餅層前,會吸附在膜孔表面,并在膜孔內堵塞,使得原本粗糙的膜孔內表面變得光滑,這使得多糖分子與膜的摩擦力減小,從而一定程度上提升了膜的水通量[18]。隨著超濾時間的延長,膜表面的濃差極化現象趨于明顯,即在分離過程中,多糖溶液在壓力驅動下透過膜,部分溶質被截留,使得膜與本體溶液界面或臨近膜界面的區域溶液濃度逐漸升高,在濃度梯度作用下,溶質又會由膜面向本體溶液擴散,形成邊界層,使流體阻力與局部滲透壓增加,從而導致溶劑透過通量下降在更大程度上阻礙了水的透過,使得料液水通量下降并導致滲余物中多糖的滲透減少。另一方面,由于多糖組成復雜,分子質量分布廣,部分分子質量高于膜截留分子質量的多糖分子無法通過超濾膜,也造成了部分多糖損失。

圖2 連續循環超濾次數對超濾過程的影響

由于多糖的純度經過電滲析和第二步超濾后會得到更好的提升,因此主要依據多糖回收率和膜滲透通量確定第一步超濾的最佳循環次數為5次,此時的多糖回收率能達到81.44%,膜滲透通量也較高。

2.3 電滲析脫鹽效果評價

在第一步超濾過程中為了提高多糖得率而添加的NaCl可能會影響多糖的后續應用,因此要通過對比是否添加NaCl的多糖電滲析過程,來檢驗電滲析是否能夠有效去除NaCl。圖3描繪了電滲析過程中稀釋和濃縮容器中電導率的變化。在最初的15 min內,淡化室中鐵皮石斛多糖溶液的電導率急劇下降,在電滲析開始20 min后電導率下降趨勢變得非常緩慢。這是因為溶液的電導率是由離子遷移率和離子濃度決定的,當離子濃度較高時離子遷移速率更快,導致在電滲析過程前期溶液電導率下降明顯。在實驗中發現,在更高的電壓下電導率的下降趨勢更加明顯。電滲析利用直流電場作為驅動力實現離子與溶液的分離,在更高的電壓下,鹽離子移動速度更快,從一個隔室移動到另一個隔室所需的時間更少,在不同隔室的停留時間變短,因此溶液電導率下降的速度更快。另一方面,在含有0.5 mol/L NaCl的多糖溶液中離子的遷移速率更快,雖然在理論上電流密度和局部電場不隨離子濃度改變,但是離子濃度會改變膜表面的電荷密度,使得離子靜電排斥作用增強,導致電導率的下降速度加快[19]。

a-不含NaCl的料液電導率變化;b-含0.5 mol/L NaCl的料液電導率變化

由圖3可知,含NaCl的鐵皮石斛多糖溶液隨著電滲析時間延長,在15 min后淡化室中的電導率逐步下降至與不含NaCl的鐵皮石斛多糖溶液接近的水平,說明為了提高多糖提取率而添加的NaCl可以通過電滲析步驟有效地去除。

2.4 重金屬脫除效果評價

電滲析法脫除鐵皮石斛多糖溶液中的金屬離子后,采用等離子體質譜法測定鐵皮石斛多糖中殘余的重金屬含量。通過檢測鐵皮石斛粗提物中的重金屬離子含量,發現其主要含有鉛(Pd2+)、鎘(Cd2+)和銅(Cu2+)等重金屬,3種重金屬離子含量分別為2.60、0.71、1.16 mg/kg,其中鉛離子存在安全隱患,Cd2+和Cu2+含量也接近全球食品安全標準的警戒線[20]。由圖4可知,在電滲析前鐵皮石斛多糖中的鉛含量為2.43 mg/kg,低于鐵皮石斛粗提物中的鉛含量(2.60 mg/kg)。這可能是由于一部分鉛離子會與大分子多糖絡合,在超濾過程去除了這部分鉛離子。

a-不含NaCl的料液重金屬含量變化;b-含0.5 mol/L NaCl的料液重金屬含量變化

圖4-a顯示了不含NaCl的多糖提取液的重金屬離子含量隨電滲析時間的變化趨勢。Pd2+含量在電滲析開始后的10 min內迅速下降。15 min后,鐵皮石斛多糖提取液中的Pd2+含量降至0.11 mg/kg,鉛脫除率達到95.8%。而Cu2+和Cd2+的去除速度較慢,電滲析30 min后,Cu2+和Cd2+含量分別降至0.52、0.31 mg/kg,脫除率分別為26.8%和73.3%,兩者的去除率不如Pd2+顯著,這可能是由于金屬離子通過靜電力與多糖結合,而Cu2+和Cd2+與多糖的結合力相對Pd2+更強[21]。

圖4-b描繪了含NaCl(0.5 mol/L)的多糖提取液中重金屬離子濃度隨時間的變化曲線。在電滲析初期,料液中的重金屬含量的下降速度明顯低于不加入NaCl的多糖溶液,這可能是由于料液中的Na+與Cl-多為游離態且體積較小濃度較大,當NaCl與重金屬離子存在競爭性透過時,在相同電驅動力下,在電滲析初期優先轉移Na+與Cl-[22]。因此溶液中的NaCl含量對于電滲析過程具有一定影響,但是隨著電滲析時間的延長,圖4-b觀察到與圖4-a類似的下降趨勢,表明隨著電滲析時間的延長,NaCl對去除重金屬離子的影響可以忽略不計。這些結果均表明結合超濾和電滲析的方法可以有效去除鐵皮石斛多糖中的重金屬。

2.5 UF-2nd單元超濾參數優化

在超濾過程中,溫度、pH主要通過影響濃差極化,進而影響超濾膜的過濾性能,即這些因素影響多糖在膜表面的積累造成的膜污染程度。通常,這些因素的影響與進料溶液中的溶質類型無關。然而,鐵皮石斛多糖溶液是一個復雜的復合體系,不同分子之間的相互作用可能會隨著超濾過程中工藝參數的變化而變化[23]。在本實驗中,選擇在0.5%的料液濃度下探究溫度和pH對超濾效果的影響。

2.5.1 溫度對超濾效果的影響

如圖5-a所示,隨著溫度的升高,3種不同截留分子質量的PES超濾膜的通量變化規律大致相同,均首先增加,在40 ℃時達到最大值,其中8 kDa的超濾膜變化尤為明顯。原因可能是由于黏度的降低和布朗運動的加速。此外,隨著溫度從25 ℃升高到40 ℃,濃差極化層中溶質的擴散增加,進料黏度降低,從而產生更高的滲透通量,但是當溫度進一步超過40 ℃時,料液通量減少可能是由于多糖在高溫下變性并相互聚集[24]。

a-溫度對超濾性能的影響;b-pH值對超濾性能的影響

2.5.2 pH對超濾效果的影響

圖5-b總結了滲透通量和進料pH之間的關系,隨著pH值的增加,3種膜的滲透通量均呈現先減小后增加的趨勢。料液的膜水通量的增加可以從膜的親水性增加解釋,當溶液的pH值改變,多糖分子帶電性發生變化,由于官能團的作用,溶液在PES膜表面產生選擇性吸附從而改變其親水性,增加了料液的膜通量[25]。

綜上所述,溫度為40 ℃,pH為4時,3種膜孔徑的PES膜滲透通量均最高,超濾效果也最好。在實際應用時,可根據實驗條件和實驗要求選擇合適的溫度及pH。

2.6 鐵皮石斛多糖回收率及評價

截留分子質量不同的超濾膜超濾效果差異明顯,由圖6可知,截留分子質量越大,跨膜通量明顯提升。超濾膜的截留分子質量表征了在能自由通過超濾膜的分子中最大分子的分子質量。較小的孔徑和較快的流速導致膜污染速度較快,多糖在膜孔內發生堵塞并在超濾后期在超濾膜表面形成結垢層使得濾液通量下降從而降低了多糖的過濾效率。由于多糖組成復雜,分子質量分布廣,截留分子質量大就意味著可以有更多的多糖分子通過超濾膜。為了進一步比較不同截留分子質量下超濾得到的鐵皮石斛多糖的純度并濃縮多糖,采用小分子截留分子質量(3、5、8 kDa)的超濾膜對電滲析得到的溶液進行超濾純化。通過對多糖回收率及純度的比較,可以發現不同截留分子質量的超濾膜過濾得到截留液中多糖的回收率與多糖純度均呈現負相關。相較于3 kDa和8 kDa截留分子質量的超濾膜,截留分子質量為5 kDa的超濾膜得到的多糖回收率為78.2%,多糖純度為86.4%,較為適中和均衡,經濟優勢較為明顯。

圖6 不同超濾膜對于多糖回收率及純度的影響

3 結論

在本研究中,開發了一種超濾結合電滲析用于純化植物多糖的工藝。結果顯示通過添加NaCl能夠提高鐵皮石斛多糖的得率。本研究創新性地采用電滲析去除了多糖中的鹽離子和重金屬離子,并利用兩次超濾去除不同分子質量的雜質。實驗優化了超濾和電滲析的工藝操作參數,當進料溫度為35 ℃,料液pH值為6時,能夠達到最佳的多糖回收率和純度,分別為78.2%和86.4%。電滲析過程可使多糖中的鉛離子脫除率達到95.8%,銅和汞離子脫除率達到26.8%和73.3%,重金屬總體脫除率達到80%。本實驗使用的超濾結合電滲析技術是多糖提取的一次新的嘗試,該技術有望應用于不同原料多糖提取物的純化應用,值得進一步探索研究。