枯草芽孢桿菌發酵紫菜制備一種α-葡萄糖苷酶抑制劑

許育銜,程慧敏,韓貴新,毛相朝,姜宏*

1(中國海洋大學 食品科學與工程學院,山東 青島,266003)2(晶葉(青島)生物科技有限公司,山東 青島,266109)

糖尿病是一種由飲食及生活習慣所引起的以高血糖為特征的疾病,在過去十年間,我國的糖尿病人口快速上升,宋瑩倩等[1]在2021年的調查中發現成年樣本中具有高血糖癥狀的比例高達22.09%,若發展為糖尿病及其并發癥,將對我國公共健康帶來極為重大的醫療負擔。

目前治療糖尿病藥物如噻唑烷二酮類、二甲雙胍類等藥物等雖然能有效干預血糖水平,但是長期服用容易增加肝腎負擔,并且會提高病人患心血管疾病的幾率[2-3]。因此,亟需一種副作用低且能夠有效控制血糖水平的方法。KOJIMA等[4]研究表明,在餐前服用α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase,GTase)等多糖降解酶的抑制劑是控制血糖水平的有效策略。這些抑制劑通過占據消化酶的催化位點,延緩大分子碳水化合物的降解速率,以減少糖分攝入,從而達到從源頭控制血糖水平的效果,與噻唑烷二酮等降糖藥物相比,這種代謝酶抑制劑的副作用相對較低[3]。

紫菜為紅藻門、原紅藻綱、紅毛菜目、紅毛菜科、紫菜屬(Porphyra)的海洋藻類,含有豐富的營養成分,如糖類、氨基酸、維生素及微量元素等,是一種高營養價值的食品原料[5]。許多研究表明,紫菜可作為多糖降解酶抑制劑的來源。ZENG等[6]通過化學法制備的紫菜多糖具有α-淀粉酶抑制活性;周鋒[7]以蛋白酶酶解法制備獲得了GTase抑制肽;董玉婷等[8]以植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)發酵紫菜提高了上清液對GTase的抑制活性。但是,由于生產成本、產物得率等因素,紫菜相關產業的加工利用仍處于初級階段,產品經濟效益較低且高度仰賴國外市場。因此,紫菜的精深加工是市場亟待解決的問題。

發酵被廣泛用于多種功能食品的工業化生產中[9]。與酶解法相比,發酵的成本相對較低,其簡單經濟的特性適合用來生產大量具有一定功效的食品[10]。如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)被廣泛應用于功能食品的工業化生產,其發酵代謝物中含有多種對人體有益的活性成分[11-12]。但目前使用枯草芽孢桿菌發酵紫菜制備GTase抑制劑仍未見相關報道。因此,本實驗以枯草芽孢桿菌作為發酵菌株,優化條斑紫菜的發酵工藝,探究紫菜發酵產物的有效成分及對GTase的作用機制,以期為工業化生產具有GTase 抑制性的紫菜功能食品提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

實驗使用菌株分離自威海市靖海灣的紫菜養殖網,經鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis),由中國海洋大學海洋食品生物技術實驗室保存。

1.1.2 材料與試劑

頭水紫菜(Porphyrayezoensis),威海市科藍海洋科技有限公司;GTase、葡聚糖凝膠G-15,北京索萊寶科技有限公司;對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside,pNPG,BR,99%)、阿卡波糖(BR,95%),上海源葉生物科技有限公司;其余試劑均為國產分析純。所有實驗用水均為超純水。

1.2 儀器與設備

5425R高速離心機,德國艾本德股份公司;BCM-1000超凈臺,蘇州凈化設備有限公司;WD-9405B水平搖床,北京市六一儀器廠;PHS-3C精密酸度計,上海儀電科學儀器股份有限公司;HH-3A水浴鍋,常州智博瑞儀器制造有限公司;MULTISKAN FC酶標儀,賽默飛世爾科技公司;HVE-50立式高壓蒸汽滅菌鍋,上海申安醫療器械廠;全自動紫外分析儀和自動收樣器,上海滬西儀器廠;Smart1002-DI超純水機,青島萊伯瑞科技有限公司;Kjeltec 2300凱氏定氮儀,福斯分析儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 紫菜發酵液的制備流程

將條斑紫菜粉碎至178 μm(80目)以下粉末烘干備用。稱取適量紫菜粉末于錐形瓶中,按一定比例添加純水,115 ℃滅菌30 min,冷卻后將一定量的枯草芽孢桿菌懸浮液接種到發酵基底中,攪拌均勻后置于37 ℃培養箱中發酵一定時間,經離心取上清液即得。

1.3.2 單因素試驗

分別考察發酵溫度、發酵時間、料液比(紫菜與發酵液質量比)、接種量對GTase抑制率的影響,實驗設計如下。

陰性對照:將種子液預先滅菌后進行接種,于30 ℃靜置48 h。

發酵溫度:分別設定為20、30、40、50 ℃,固定料液比為200 g/kg,接種量為5%(體積分數),發酵時間48 h。并在30 ℃組設置陰性對照,將種子液預先滅菌后進行接種。

發酵時間:分別設定為24、48、72、96、120、144、168 h,固定料液比為200 g/kg,接種量為5%(體積分數),發酵溫度為30 ℃。

料液比:分別設定為200、150、100、50 g/kg,固定發酵溫度為30 ℃,發酵時間為96 h,接種量為5%(體積分數)。

接種量:分別設定為0.1%(體積分數)、0.3%、0.5%、1%、3%、5%,固定料液比為150 g/kg,發酵時間為96 h,發酵溫度30 ℃。

1.3.3 正交試驗

根據單因素試驗結果,確定發酵溫度、發酵時間和料液比3個因素的水平,設置三因素四水平正交試驗,以GTase抑制率為指標,獲得最佳發酵條件。實驗因素及水平見表1。

1.3.4 IC50值的測定

將發酵液干粉(PFPOB)以PBS(pH 7.2)稀釋至終質量濃度分別為1、0.6、0.5、0.4、0.3、0.24、0.18、0.12、0.05 mg/mL。依據1.3.9方法對抑制率進行測量。分別以PFPOB質量濃度為橫坐標和GTase抑制率為縱坐標繪制標準曲線,測定IC50值。

1.3.5 PFPOB抑制動力學分析

參考董玉婷等[8]的方法略作修改,配制10 mmol/LpNPG,并分別稀釋為2、4、6、8 mmol/L等不同底物濃度,加入孵育好的GTase(262.5 U/mL)與PFPOB(0.25 mg/mL),測定反應初速度。Lineweaver-Burk做雙倒數曲線,對抑制類型進行分析。

1.3.6 PFPOB成分的分離純化

參考白露[13]的方法稍作修改,將PFPOB使用超純水復溶,使用離心過濾裝置Amicon?Ultra-15獲得分子質量<3 kDa的組分后迅速冷凍干燥,將凍干后樣品配制成質量濃度為75 mg/mL的溶液[14],經0.22 μm濾膜除去雜質后備用。將溶脹好的Sephadex G-15介質填充至750 mm×14 mm的層析柱,用去離子水進行平衡。樣品進樣量為3 mL,洗脫劑為超純水,洗脫流速0.45 mL/min,檢測波長220 nm。

1.3.7 肽鑒定

1.3.7.1 樣品處理

取抑制峰樣品,冷凍干燥后進行LC-MS/MS鑒定分析。

1.3.7.2 LC-MS/MS條件

參考ZHAO等[15]的方法稍作修改,使用納升流速Easy nLC 1200色譜系統(Thermo Scientific)從樣品中提取1～2 μg肽并分離。緩沖液:溶液A為0.1%(體積分數)甲酸水溶液,溶液B為0.1%甲酸、乙腈和水溶液(其中80%為乙腈)的混合物。用100%溶液A平衡色譜柱。將樣品注入Trap Colum(100 μm×20 mm,5 μm,C18,Dr.Maisch GmbH),然后通過色譜柱(75 μm×150 mm,3 μm,C18,Dr.Maisch GmbH),流速為300 nl/min;梯度洗脫:0～2 min:2%～5% B相;2～44 min:5%～28% B相;44～51 min,28%～40% B相;51～53 min,40%～100% B相;53～60 min,100% B相。

質譜條件:一級,分辨率 60 000,自動增益控制目標值 3e6,最大離子傳輸時間 50 ms,掃描范圍350～1 800m/z;二級,分辨率 15 000,自動增益控制目標值 1e5,最大離子傳輸時間 50 ms,最高信號離子數量 20,NCE/steppedNCE 28。

1.3.7.3 氨基酸序列分析

分析軟件為Max Quant 1.6.17.;蛋白質數據庫為uniprot-Neopyropia yezoensis (Susabi-nori) (Pyropiayezoensis) [2788]-764-20220530,網址https://www.uniprot.org/uniprot/?query=taxonomy:2788。

參數設定如下:酶:Unspecific;可變修飾:oxidation (M), Acetyl (Protein N-term);遺漏酶切位點:0;一級質譜誤差:20×10-6;二級質譜誤差:20×10-6;顯著性閾值:0.01。

1.3.8 虛擬篩選與分子對接

參考ZHAO等[15]的方法進行操作,首先使用Chemdraw 2019和Chem3D Pro 14.0繪制多肽三維結構,以PDBQT格式保存。GTase晶體結構從蛋白質數據(https://www.rcsb.org/structure/2QMJ)中獲得,用PyMOL去除2QMJ中的阿卡波糖配體,使用Autodock進行脫水和氫化,計算gasteiger電荷并將所有原子分類為AD4類型,以PDBQT格式存儲以備將來使用。

對接過程使用PyRx軟件中的Vina分數,參考阿卡波糖在2QMJ中的位置設置對接盒,其他參數為默認值,將活性肽與GTase進行分子對接,并使用PyMOL軟件演示配體和受體之間的相互作用。

1.3.9 紫菜發酵液對GTase活性抑制率的測定

參考董玉婷等[8]的方法略作修改,采用pNPG法進行測定。首先用超純水將待測定樣品稀釋10倍,8 000 r/min離心10 min后取40 μL上清液加入120 μL PBS(0.1 mol/L,pH 7.3)與40 μL GTase溶液(262.5 U/mL)混合均勻,于酶標儀中40 ℃孵育10 min,隨后加入40 μLpNPG(10 mmol/L)溶液,40 ℃反應15 min,立即加入40 μL Na2CO3(1 mol/L)溶液終止反應,于405 nm波長下檢測溶液吸光度。每個試驗重復3次。抑制率按公式(1)計算:

(1)

式中:Ac,對照組吸光度;Ab,空白組吸光度;As,樣品組吸光度;An,樣品空白組吸光度。

1.3.10 水解度的測定

參考余筱潔等[16]的方法以甲醛滴定法進行測定游離氨基態氮,以凱氏定氮法測定總氮含量。水解度按公式(2)計算:

DH/%=游離氨基態氮/樣品總氮含量×100

(2)

1.4 數據處理

數據處理采用SPSS ver.28軟件進行分析;采用Origin 18軟件作圖。所有數據進行3次平行實驗,均以平均值±標準差表示。采用Duncan’s multiple range檢驗進行統計學意義分析,以P<0.05有統計學差異,不同字母表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 發酵菌種的選擇

從紫菜養殖網中初步篩選了5株枯草芽孢桿菌,分別命名為3、12、14、15和16號菌株,以GTase活性抑制率為主要指標,水解度為輔助指標,探究不同枯草芽孢桿菌菌株對紫菜的發酵情況。從圖1可以看出,紫菜在不同枯草芽孢桿菌作用下,出現了不同程度的水解現象,其中3號與15號菌株的水解作用最大。同時,3號菌株產生了更高的GTase抑制率(13.64±4.32)%。因此選取3號枯草芽孢桿菌為發酵菌種。

2.2 發酵工藝的單因素試驗

由圖2-a可知,隨著溫度升高,抑制率呈現先上升后下降趨勢,表明合適的生長溫度有助于促進GTase抑制劑的生成[12]。當發酵溫度30 ℃時GTase抑制率達到最高(12.01±0.80)%,但當溫度繼續升高,雖然有助于酶解反應促進肽的生成,但不利于菌種生長代謝,抑制率下降。因此30 ℃為最佳發酵溫度。

a-發酵溫度;b-發酵時間;c-料液比;d-接種量圖2 不同發酵條件對GTase抑制率的影響Fig.2 Effect of different fermentation conditions on inhibition rate of GTase注:不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)。

如圖2-b所示,隨著發酵時間的延長,GTase抑制率逐漸增加,并在發酵72 h時大幅度上升,到96 h后趨于平穩,抑制率為(53.15±2.36)%。在發酵96～144 h期間,抑制率差異不顯著(P>0.05),這可能如同KIERS等[17]的研究中所述,在發酵72 h后,幾乎所有蛋白質都已轉化為肽類,更長的發酵時間并不導致更多的抑制劑產生。因此從時間成本角度考慮,選取96 h為最佳的發酵時間。

由圖2-c可知,高料液比組的抑制率較高,隨著料液比的下降,抑制率也隨之下降,這是由于水分含量過多,營養濃度下降的同時也影響了發酵氣體的交換,導致低料液比組的發酵速率較慢。由于200 g/kg組與150 g/kg組無顯著性差異(P>0.05),考慮到生產成本,最終選擇150 g/kg組為最佳料液比。

如圖2-d所示,隨著枯草芽孢桿菌接種量的升高,GTase抑制率呈現上升的趨勢,在接種量為1%時發酵液的GTase抑制率最高(59.26±3.81)%,當接種量繼續增大時,抑制率反而降低,這可能是因為枯草芽孢桿菌在接種量4%時生長最佳[18],而發酵培養基營養物質有限,過多生物量會導致紫菜蛋白快速消耗,無法生成足夠的功能肽,因此選擇1%為最佳接種量。

綜上所述,單因素優化的結果得到最佳發酵條件為30 ℃、料液比150 g/L、1%接種量、發酵96 h,在此條件下制作的紫菜發酵液的GTase抑制率為(59.26±3.81)%。

2.3 正交試驗優化發酵條件

考慮到各個因素之間交互影響,為了進一步確認最佳發酵條件,固定接種量為1%,以發酵溫度、發酵時間、料液比進行三因素四水平的正交試驗,以提高發酵液的GTase抑制率,結果如表2所示。根據GTase抑制率均值判斷最優化組合為A2B4C2,即發酵溫度30 ℃、發酵時間144 h、料液比150 g/kg。根據極差判斷影響GTase抑制率主次因素順序依次為A>C>B,即發酵溫度>料液比>發酵時間。

表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal test

方差分析結果如表3所示,發酵溫度對于GTase抑制率有顯著性影響(P<0.05),這與表2得到的結果相同,即發酵溫度是該工藝的關鍵控制點。最終確定枯草芽孢桿菌發酵紫菜產GTase抑制劑的條件為:150 g紫菜加入850 mL超純水,接種量為1%(體積分數),在30 ℃發酵144 h,離心后上清液對GTase抑制率為(70.91±1.96)%,將本工藝生產的發酵液進行噴霧干燥后命名為PFPOB并用于后續實驗。

表3 方差分析結果Table 3 Result of analysis of variance

2.4 PFPOB對GTase的抑制類型分析

過高的濃度會使抑制率達到飽和,使劑量-反應曲線趨緩,不呈現線性關系,因此選擇合適的線性部份作為標曲計算IC50值。如圖3-a所示,在質量濃度0.3 mg/mL以下,PFPOB濃度與抑制率呈現顯著正相關,IC50值約為0.21 mg/mL,其對GTase活性抑制優于陽性對照阿卡波糖(IC50=0.88 mg/mL)。

a-劑量-反應曲線;b-V-S圖;c-Lineweaver-Buck雙倒數圖圖3 PFPOB的IC50測定與抑制類型分析Fig.3 IC50 determination and inhibition type analysis of PFPOB

GTase的動力學反應結果如圖3-b所示,加入PFPOB后Km增加,Vmax降低,根據圖3-c中直線的斜率與截距計算可知沒有PFPOB時Km為3.17 mmol/L,Vmax為0.335 μg/(mL·min),加入PFPOB后Km增加到了7.21 mmol/L,Vmax降至0.276 μg/(mL·min)。此外,如圖3-c所示,在加入PFPOB后,直線斜率增加且兩線交點靠近原點(-0.038,2.62),表明PFPOB主要是采用競爭性抑制方式來抑制GTase活性[19]。因為競爭性抑制劑在開放系統中僅表現出短暫的影響,不影響人體正常機能[20],所以PFPOB是一種有一定潛力的降血糖食品原料。

2.5 PFPOB抑制成分分析

2.5.1 凝膠過濾層析分離

為了進一步探究PFPOB的功能成分,將PFPOB使用Amicon?Ultra-15進行超濾分級,迅速冷凍干燥備用,其中<3 kDa的成分(3 mg/mL)對GTase的抑制率為(90.11±2.05)%,為主要抑制成分。使用Sephadex G-15分級為5個吸收峰(圖4-a),其中GTase抑制活性最佳的是P3,抑制率為(50.07±3.42)%(圖4-b)。

a-凝膠色譜圖;b-各個峰的GTase抑制活性圖4 Sephadex G-15凝膠層析結果Fig.4 Sephadex G-15 gel chromatography results

Sephadex G-15分級范圍于100～1 500 Da,適合分離小分子肽、寡糖等成分。將PFPOB組分使用葡聚糖凝膠進行分離后,測量各層析管的GTase抑制率及肽含量的相關性,并使用SPSS進行相關性分析,計算肽含量與GTase抑制率的皮爾森相關系數。經多次重復實驗,發現分離產物中肽含量與GTase抑制率呈顯著或極緊密正相關。表明PFBOB中肽對GTase抑制率的影響起至關重要作用。

2.5.2 具有GTase抑制活性的肽片段篩選

為了表征具有GTase抑制活性的肽,通過LC-MS/MS(圖5-a)鑒定了PFPOB中的肽序列(<1 kDa)。用Uniprot數據庫與紫菜全蛋白進行數據比對,共檢測到29條肽,將這些肽進一步的軟件模擬,以篩選具有最高抑制活性的肽片段。

a-總離子譜圖;b-GPGDFL的MS/MS譜圖;c-SPPPPPA的MS/MS譜圖圖5 肽譜鑒定結果Fig.5 Peptide spectrum identification results

阿卡波糖與人源GTase(PDB:2QMJ)對接結果表明Asp203、Arg526、Thr205、Asp542、His600和Asp327活性位點中的氨基酸殘基在形成活性口袋和穩定原始配體中起重要作用[21]。使用對接工具將篩選肽取代阿卡波糖進行分子對接,將低于-8.0 kcal/mol的結合能設置為篩選條件。篩選得出2種有潛力的肽,其MS/MS譜圖如圖5-b和圖5-c所示。GPGDFL和SPPPPPA結合能皆為-8.2 kcal/mol,與GTase有一定結合力,具有抑制其活性的潛力。

2.5.3 GTase抑制肽的分子對接與抑制機理解析

從分子對接示意圖(圖6)中可以看到2條肽均可嵌入GTase活性口袋,阻止底物的進入。GPGDFL與GTase對接結果如圖6-a所示,其Phe與Leu殘基與GTase活性口袋中的Asp542、Arg526、His600共形成5個傳統氫鍵相互作用,平均距離為2.34 ?。SPPPPPA對接結果如圖6-b所示,其Ser、Pro、Ala 殘基分別與GTase活性口袋中的Asp443、Ser448、Arg526、Trp539、Asp542、Asp571共形成8個傳統氫鍵相互作用,平均距離為2.58 ?。兩者氫鍵相互作用平均距離皆短于傳統的3.5 ?,有助于活性肽與GTase活性位點形成緊密且穩定的結合[21],其中Trp539、Asp542、His600、Asp443和Arg526是反應底物與GTase活性口袋結合的關鍵活性位點[22],通過與關鍵位點的競爭性結合,可以阻止GTase對底物的作用。

a-GPGDFL;b-SPPPPPA圖6 肽與GTase的對接結果Fig.6 Docking results of peptides with GTase注:左至右分別為整體3D圖,對接位點3D圖(不同顏色表示不同氨基酸),與對接位點2D圖。

此外,一些文獻報道認為,降血糖肽中的Pro和Leu這2種疏水性氨基酸是對GTase分別或協同具有抑制作用的重要氨基酸[23],這2種氨基酸在紫菜蛋白中含量豐富[7],本研究從肽譜鑒定得到的29條肽均存在這2種氨基酸,表明了紫菜是一種優質的降血糖肽來源。這與GPGDFL和SPPPPPA的對接結果相符,如圖6所示,SPPPPPA上的Pro環狀結構與Trp406、Phe575形成π-烷基作用,而GPGDFL的Pro與Ala576,Leu與Tyr299、Ile328、Ile364與Trp406共形成7個π-烷基作用,同時Tyr299上的苯環與Phe殘基上的苯環會形成π-π堆積作用,這些疏水性胺基酸的疏水相互作用可能改變GTase活性口袋構象[24],使活性位點與肽結合的更緊密,并阻止了底物的進入。

分子對接結果表示GPGDFL與SPPPPPA能夠與GTase活性位點中的關鍵氨基酸殘基形成傳統氫鍵、疏水相互作用、范德華力和靜電相互作用力。其中分別是Leu、Phe與Pro、Ala殘基起到了重要的作用,并通過競爭酶與底物的結合位點及改變酶的構型來抑制GTase活性,與PFPOB對GTase活性抑制類型實驗結論一致。此外,有大量鑒定肽段的N端第一個或第二個氨基酸為Pro或Ala,與報道的二肽激肽酶抑制肽一致[25],這些肽有可能對血糖的調控起到協同作用,這方面的研究將在進一步的功效研究中闡明。

3 結論

本研究以紫菜為基質使用枯草芽孢桿菌進行固態發酵,制備了具有GTase抑制活性的紫菜發酵液。經過正交試驗優化后的發酵條件為發酵溫度30 ℃、料液比150 g/kg、接種量1%(體積分數)、發酵時間144 h,制備的PFPOB的IC50為0.21 mg/mL,優于陽性對照藥物阿卡波糖。PFPOB抑制方式為競爭性抑制,其中的肽含量與GTase抑制率呈極顯著正相關,將PFPOB進行肽譜鑒定后得到了肽GPGDFL與SPPPPPA。與人來源的GTase的分子對接結果表明其通過競爭GTase與底物的結合位點來抑制GTase活性,是一種有效的潛在降血糖成分。PFPOB具有生產成本低,設備要求低,不使用化學藥劑等優勢?？傊狙芯繛樽喜嗽碐Tase抑制劑的工業化生產提供一定的理論指導,并為紫菜的高值化開發利用奠定理論基礎。