超高效液相色譜-串聯質譜法測定水產養殖用非規范藥品及水中撲草凈、阿維菌素和伊維菌素的殘留量

陳永平 ,包 艷 ,許文龍 ,成振華 ,王 輝 ,韓現芹 ,時文博,王愿寧

(1.天津市農業生態環境監測與農產品質量檢測中心,天津 300193;2.中國科學院 青島生物能源與過程研究所,青島 266101)

在養殖用地不斷收縮、因地下水開采限制需養殖用水循環使用的形勢下,為了滿足人們日益增長的水產品的需求,水產品高密度養殖成為增加產品供應量的主要途徑之一。其中,閉環養殖是高密度養殖的常見模式,但閉環養殖易導致水質惡化和水生物疾病頻發,從而加劇藥物控制的依賴。促生長劑、殺蟲劑、除雜劑和環境改良劑等非規范藥品因具有抗病、殺蟲、除草、促生長等功能,備受養殖者的青睞。有些養殖者專門用撲草凈清除養殖水體中的絲狀藻類、大型草類及有毒藻類[1-2],用阿維菌素、伊維菌素殺滅單養和混養池塘水體中、增殖水體中,以及與魚體體表寄生的錨頭鳋、中華鳋、魚鲺、線蟲、指環蟲、三代蟲等寄生蟲及松藻蟲、水蜈蚣等水生昆蟲等[3-5],致使漁業養殖水環境受到撲草凈、阿維菌素、伊維菌素等殘留污染。非規范藥品殘留會對水生生物及浮游生物產生嚴重影響,也會通過食物鏈富集。當人類食用含有撲草凈的水產品后,會引起人體免疫系統、生殖系統、內分泌系統和神經系統異常[6-7];食用少量阿維菌素、伊維菌素會產生運動失調、呼吸緩慢、DNA 損傷等,過量會導致重度昏迷甚至死亡[8-11]。農業農村部制定《2020年水產養殖用獸藥及其他投入品安全隱患排查計劃》,加大了對水產養殖用非規范藥品中藥物的監督及排查力度。由于非規范藥品為新型投入品,相關學者對其中藥物檢測技術研究較少,尚無檢測標準或方法依據可參考,這給非規范藥品中藥物的監督、監測造成較大困難,因此開發非規范藥品中藥物檢測技術十分必要。

目前阿維菌素的主要檢測方法有酶聯免疫吸附測定法[12-14]、液相色譜法[15-22]和液相色譜-串聯質譜法[23-30],液相色譜法靈敏度低,干擾影響因素多,而采用熒光檢測器時涉及衍生化處理,操作復雜,而高效液相色譜-串聯質譜法具有高選擇性和高靈敏度,應用較為廣泛。撲草凈的測定方法主要有高效液相色譜法[31-32]、液相色譜-串聯質譜法[33]、氣相色譜法[34]、氣相色譜-質譜法[35-36]和酶聯免疫吸附測定法[1]等,但水產養殖用非規范藥品及水中上述藥物的同時測定方法還未見報道。鑒于此,本工作采用超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定水產養殖用非規范藥品及水中撲草凈、阿維菌素和伊維菌素的殘留量。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

AB 5500 Qtrap 型三重四極桿質譜儀;SHIMAD LC-30AD 型超高效液相色譜儀;SIMGA 3-18KS型高速冷凍離心機;IKA-T25型高速組織勻漿機;MS1 Mini-shaker型渦輪振蕩器;Milli-Q 型純水器;NPO HLB固相萃取柱(6 mL/500 mg)。

單標準儲備溶液:100 mg·L－1,準確稱取撲草凈、阿維菌素、伊維菌素標準品各10 mg,分別用甲醇溶解并定容至100 mL,配制成質量濃度為100 mg·L－1的單標準儲備溶液,于－18 ℃避光保存。同法配制內標(撲草凈-d6)儲備溶液。

混合標準溶液:取撲草凈標準儲備溶液0.1 mL,阿維菌素、伊維菌素標準儲備溶液各1.0 mL,用含0.1%(體積分數,下同)甲酸的2 mmol·L－1乙酸銨溶液溶解并定容至100 mL,配制成撲草凈質量濃度為0.1 mg·L－1,阿維菌素、伊維菌素的質量濃度均為1.0 mg·L－1的混合標準溶液。

內標溶液:1.0 mg·L－1,移取內標儲備溶液1.0 mL,用含0.1%甲酸的2 mmol·L－1乙酸銨溶液稀釋并定容至100 mL,配制成質量濃度為1.0 mg·L－1的內標溶液。

混合標準溶液系列:移取適量的混合標準溶液以及內標溶液,用含0.1%甲酸的2 mmol·L－1乙酸銨溶液稀釋,配制成撲草凈的質量濃度為0.2,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0,15.0μg·L－1,阿維菌素、伊維菌素的質量濃度為2.0,5.0,10.0,20.0,50.0,100.0,150.0μg·L－1,內標質量濃度均為10μg·L－1的混合標準溶液系列。

撲草凈、阿維菌素、伊維菌素、撲草凈-d6標準品的純度不小于98%;甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨均為色譜純;試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Waters ACQUITY UPLC C18色譜柱(100.0 mm×2.1 mm,1.7μm);流量0.2 mL·min－1;柱溫40℃;進樣體積5.0μL;流動相A 為含0.1%甲酸的2 mmol·L－1乙酸銨溶液,B 為甲醇。梯度洗脫程序:0～6.0 min時,B 由30%降至0,保持4.0 min;10.0～10.1 min時,B由0跳轉至30%,保持2.9 min。

1.2.2 質譜條件

電噴霧離子(ESI)源,正離子(ESI＋)掃描模式;離子源溫度550 ℃;氣簾氣壓力138 k Pa;碰撞誘導解離(CAD)設置Medium;噴霧電壓4 500 V;輔助氣1壓力344 k Pa;輔助氣2壓力344 k Pa;多反應監測(MRM)模式。其他質譜參數見表1,其中“*”代表定量離子。

表1 質譜參數Tab.1 MS parameters

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的前處理

水產養殖用非規范藥品固態樣品處理:準確稱取水產養殖用非規范藥品固態樣品1.00 g,加入1.0 mg·L－1撲草凈-d6溶液10μL 和水20 mL,經均質、超聲處理后離心5 min,取上清液用水定容至100 mL。

水產養殖用非規范藥品液態樣品處理:準確稱取水產養殖用非規范藥品液態樣品1.00 g,加入1.0 mg·L－1撲草凈-d6溶液10μL 和水20 mL,經渦旋振蕩混勻后離心5 min,取上清液用水定容至100 mL。

養殖水樣品處理:養殖水樣品經0.45μm 濾膜過濾,取濾液200 mL,然后加入1.0 mg·L－1撲草凈-d6溶液10μL,振蕩混勻。

1.3.2 樣品的凈化

用5 mL甲醇、5 mL水活化NPO HLB固相萃取柱,充分浸潤填料,以清洗固相萃取柱上的干擾雜質以及溶劑殘留。將100 mL待凈化的樣品溶液以1滴/s的流量過已活化的NPO HLB 固相萃取柱,用5 mL水淋洗。用洗耳球將固相萃取柱內的淋洗液吹干,然后用6 mL甲醇洗脫于15 mL離心管中,再用洗耳球吹干。將洗脫液于40℃氮吹至近干,加入體積比3∶7 的甲醇-含0.1%甲酸的2 mmol·L－1乙酸銨溶液(定容溶劑)1.0 mL,渦旋1 min,超聲振蕩1 min,轉入1.5 mL 離心管中,以轉速20 000 r·min－1離心5 min,所得溶液過0.2μm 濾膜,按照儀器工作條件測定。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 流動相

為同時使撲草凈、阿維菌素、伊維菌素獲得理想的靈敏度與分離效果,試驗選取了乙腈-含0.1%甲酸的2 mmol·L－1乙酸銨溶液、甲醇-含0.1%甲酸的2 mmol·L－1乙酸銨溶液、甲醇-水、乙腈-水等4種不同的流動相體系進行對比。結果表明,與甲醇-水、乙腈-水流動相體系相比,乙腈-含0.1%甲酸的2 mmol·L－1乙酸銨溶液、甲醇-含0.1%甲酸的2 mmol·L－1乙酸銨溶液流動相體系可明顯提高離子化程度,在同等條件下,甲醇-含0.1%甲酸的2 mmol·L－1乙酸銨溶液作為流動相體系時目標物的信號更強,因此試驗選擇甲醇-含0.1%甲酸的2 mmol·L－1乙酸銨溶液作為流動相體系。

2.1.2 色譜柱

保持其他條件不變,試驗考察了Shim-pack XR-ODS C8柱(75.0 mm×2.1 mm,2.2μm)、Thermo C18柱(100.0 mm×2.1 mm,5.0μm)和Waters ACQUITY UPLC C18柱(100.0 mm×2.1 mm,1.7μm)等不同色譜柱對目標物分離效果的影響,結果見圖1。

圖1 不同色譜柱下目標物的分離效果Fig.1 Separation effect of targets on different chromatographic columns

由圖1可知:以Shim-pack XR-ODS C8柱作為分離柱,阿維菌素、伊維菌素峰形較差,響應強度較低;以Thermo C18柱作為分離柱,阿維菌素、伊維菌素半峰寬較寬,響應強度較低;以Waters ACQUITY UPLC C18柱作為分離柱,目標物峰形好,響應強度高。因此,試驗選擇Waters ACQUITY UPLC C18柱(100.0 mm×2.1 mm,1.7μm)作為色譜分離柱。

2.2 掃描模式的選擇

為獲得撲草凈、阿維菌素、伊維菌素較理想的信號強度,比較了ESI＋與電噴霧離子源負離子(ESI－)掃描模式下目標物的響應強度。結果表明:在ESI－掃描模式下,阿維菌素、伊維菌素響應強度較低,按不小于3倍信噪比(S/N)計算,撲草凈的檢出限為5μg·kg－1,阿維菌素、伊維菌素的檢出限為100μg·kg－1;在ESI＋掃描模式下,以體積比3∶7的甲醇-含0.1%甲酸的2 mmol·L－1乙酸銨溶液作為定容溶劑,各目標物母離子[M＋NH4]＋響應強度增大,按不小于3倍信噪比計算,撲草凈的檢出限可達到0.2μg·kg－1,阿維菌素、伊維菌素的檢出限可達到2.0μg·kg－1。因此,試驗選擇ESI＋模式掃描。

2.3 固相萃取柱的選擇

試驗分別以NPO HLB 柱、Waters OASIS HLB柱和CNW HLB 柱等3個品牌HLB 固相萃取柱(500 mg/6 mL)作為目標物凈化提取柱,考察了不同HLB固相萃取柱對非規范藥品中3種目標物的提取效果,結果見圖2。

圖2 不同固相萃取柱下非規范藥品中3種目標物的回收率Fig.2 Recovery of 3 targets in non-standard drugs by different solid phase extraction columns

結果表明:在相同條件下,Waters OASIS HLB柱凈化效果較好,但過柱時間長;NPO HLB柱過柱速率最快,回收效果好,但柱凈化效果稍差;CNW HLB柱過柱速率較快,凈化效果較好,但回收效果不理想。綜合考慮,大批量樣品處理采用NPO HLB柱作為固相萃取柱,同時滿足高效、準確度高的要求。

2.4 標準曲線、檢出限和測定下限

按儀器工作條件測定混合標準溶液系列,撲草凈、阿維菌素、伊維菌素均以撲草凈-d6為內標,用儀器自帶工作站按內標法進行自動計算,以目標物質量濃度與內標質量濃度的比值為橫坐標,以目標物峰面積與內標峰面積的比值為縱坐標繪制標準曲線。所得目標物的線性范圍、線性回歸方程和相關系數見表2。按不小于3倍信噪比分別計算非規范藥品和水樣中各目標物的檢出限,按不小于10倍信噪比分別計算非規范藥品和水樣中各目標物的測定下限,結果見表2。

表2 線性參數、檢出限和測定下限Tab.2 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

2.5 精密度和回收試驗

選取空白非規范藥品固態樣品和液態樣品、水樣為基質,分別進行3個濃度水平的加標回收試驗,每個濃度水平制備6個平行樣品,計算回收率及測定值的相對標準偏差(RSD),結果見表3和表4。

表3 在非規范藥品樣品基質中的精密度和回收試驗結果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery in non-standard drug sample matrices(n＝6)

表4 在水樣基質中的精密度和回收試驗結果(n＝6)Tab.4 Results of tests for precision and recovery in water sample matrix(n＝6)

結果表明:目標物的回收率為84.8%～105%,測定值的RSD 為2.9%～8.4%。說明方法適合水產養殖非規范藥品及水中撲草凈、阿維菌素、伊維菌素的殘留測定。

2.6 樣品分析

按照試驗方法分析天津市場的80個非規范藥品與水樣(包括殺蟲劑、促生長劑、水質改良劑、底質改良劑、微生態制劑、水產養殖用飼料等)。結果顯示,1個非規范藥品樣品中檢出阿維菌素,其殘留量為718 mg·kg－1,1個水樣中檢出撲草凈,其殘留量為3.2 ng·L－1,其他樣品均未檢出。

本工作提出了超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定水產養殖用非規范藥品及水中撲草凈、阿維菌素、伊維菌素殘留量的方法。本方法具有快速、靈敏、準確且簡單的優點,可滿足實驗室質量控制規范的技術要求。