超高效液相色譜-三重四極桿質譜法同時測定化妝品中13種α-羥基酸的含量

高天陽,蔣亞奇,林鈺鎵,劉春霖,冉金鳳,李啟艷

(山東省食品藥品檢驗研究院,國家藥品監督管理局化妝品原料質量控制重點實驗室,濟南 250101)

α-羥基酸是一類羥基位于α位的羧酸[1],包括葡糖醛酸、羥基乙酸、扁桃酸等,它們可使皮膚光滑、細嫩、柔軟,具有除皺、保濕、抗衰老等作用[2-3],因而被廣泛應用于化妝品中。但過量使用α-羥基酸會對皮膚產生較強的刺激性[4],還會減弱皮膚對紫外線的抵抗力,甚至造成皮膚灼傷,因此α-羥基酸的安全性逐漸受到重視。

為有效控制α-羥基酸的使用量,《化妝品安全技術規范》(2015年版)明確規定化妝品中α-羥基酸總量不得超過6%(質量分數)[5]。隨后,國家食品藥品監督管理局于2019年在第12號通告中發布了《化妝品中10 種α-羥基酸的高效液相色譜測定法》[6],并以此作為標準方法控制α-羥基酸的總量。除標準方法外,文獻報道中關于α-羥基酸的檢測方法有液相色譜法[7-8]、氣相色譜法[9]、離子色譜法[10]、毛細管電泳法[11]、液相色譜-質譜法[12]等。然而,現有的液相色譜-質譜法中僅測定了酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、乙醇酸5 種α-羥基酸的含量[13]。葡萄糖酸、乳糖酸和α-羥基癸酸作為新一代果酸,因具有刺激性小、保濕效果強等優點而被越來越多的添加到化妝品中,增加對這些α-羥基酸的測定有利于得到更準確的α-羥基酸總量測定結果。目前,尚未見葡萄糖酸、乳糖酸和α-羥基癸酸的含量測定方法的相關報道。鑒于此,本工作提出了超高效液相色譜-三重四極桿質譜法同時測定化妝品中葡萄糖酸、乳糖酸、α-羥基癸酸等13種α-羥基酸含量的方法,以期為化妝品中α-羥基酸的質量控制提供參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

島津Nexera X2 型超高效液相色譜儀和LCMS-8050 型三重四極桿質譜儀聯用系統;MS105DU 型電子天平;A10型超純水儀;Universal 320R 型高速冷凍離心機;XK 96-B 型渦旋混勻器;KQ-500DE型超聲波清洗器。

單標準儲備溶液:分別精密稱取葡糖醛酸、葡萄糖酸、乳糖酸、酒石酸、羥基乙酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、2-羥基丁酸(由DL-2-羥基丁酸鈉折算)、扁桃酸、羥基辛酸、二苯乙醇酸、α-羥基癸酸標準品各10 mg,用水溶解,分別轉移至10 mL 容量瓶中,用水定容,配制成質量濃度均為1 g·L－1的單標準儲備溶液。

混合標準溶液:分別精密移取單標準儲備溶液適量,混勻,用水稀釋,配制成羥基辛酸、二苯乙醇酸、α-羥基癸酸的質量濃度為0.1 mg·L－1,羥基乙酸、乳酸的質量濃度為10 mg·L－1,其余8種α-羥基酸的質量濃度為1 mg·L－1的混合標準溶液。

混合標準溶液系列:取混合標準溶液適量,用水逐級稀釋,配制成羥基辛酸、二苯乙醇酸、α-羥基癸酸的質量濃度分別為2,5,10,20,50,100μg·L－1,羥基乙酸、乳酸的質量濃度分別為0.2,0.5,1,2,5,10 mg·L－1,其余8種α-羥基酸的質量濃度分別為20,50,100,200,500,1 000μg·L－1為混合標準溶液系列。

葡糖醛酸、葡萄糖酸、乳糖酸、酒石酸、羥基乙酸、蘋果酸、檸檬酸、DL-2-羥基丁酸鈉、扁桃酸、羥基辛酸、二苯乙醇酸、α-羥基癸酸標準品的純度均大于97%;乳酸標準品的純度大于90%;甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨均為色譜純;異丙醇為分析純;試驗用水為自制超純水。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

Agilent Zorbax RRHD SB-Aq C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8μm);柱溫40 ℃;進樣量5μL;流量0.3 mL·min－1;流動相A 為0.1%(體積分數,下同)甲酸溶液,B為乙腈。梯度洗脫程序:0～4.0 min時,B 為0;4.0～10.0 min時,B 由0升至95%,保持2.0 min;12.0～12.1 min,B由95%跳轉至0,保持2.9 min。

1.2.2 質譜條件

電噴霧離子(ESI)源,負離子掃描模式,多反應監測(MRM)模式;霧化氣流量3.0 L·min－1,加熱氣流量10.0 L·min－1,干燥氣流量10.0 L·min－1;接口溫度300 ℃,加熱模塊溫度500 ℃,脫溶劑溫度250 ℃;碰撞氣為高純氬氣。13種α-羥基酸的其他質譜參數見表1,其中“*”表示定量離子。

表1 質譜參數Tab.1 MS parameters

1.3 試驗方法

精密稱取樣品0.2 g,置于10 mL 具塞比色管中,加水至10 mL(若樣品不易在水中分散,先加1 mL異丙醇渦旋使分散均勻,再加水至10 mL),渦旋混合30 s,于60 ℃超聲提取30 min,放冷至室溫后,以轉速8 000 r·min－1離心5 min,上清液經0.22μm 濾膜過濾,按照儀器工作條件測定。

2 結果與討論

2.1 流動相的選擇

試驗分別以乙腈、甲醇為有機相,在水相中分別添加0.1%甲酸溶液、0.01 mol·L－1乙酸銨溶液,考察了不同流動相對13種α-羥基酸的分離效果和質譜響應的影響。結果顯示:以乙腈為有機相時,13種α-羥基酸的分離效果較好;水相中添加乙酸銨可改善大部分化合物的峰形和質譜響應,但乳糖酸、羥基乙酸和乳酸的質譜響應低,乳酸的峰形較差;水相中添加甲酸時,13種α-羥基酸的分離效果和質譜響應均較佳。因此,試驗最終選用乙腈-0.1%甲酸溶液為流動相。

在優化的儀器工作條件下,13種α-羥基酸的提取離子色譜圖見圖1。

圖1 13種α-羥基酸的提取離子色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of the 13 α-hydroxy acids

2.2 質譜條件的選擇

試驗采用ESI源分別在正、負離子掃描模式下對13種α-羥基酸進行一級質譜全掃描,確定母離子。對母離子進行二級質譜掃描,選擇至少2個特征碎片離子(除扁桃酸外,扁桃酸只有一個響應較高的離子碎片),響應最高的碎片離子作為定量離子,響應次高的碎片離子作為定性離子。結果表明,正離子掃描模式下,大部分化合物的分子離子峰響應較低,部分化合物無法找到二級特征碎片離子;負離子掃描模式下,13種化合物均可優選出豐度較高的離子。因此,試驗選擇負離子掃描模式。

選用質量濃度為1.0 mg·L－1的單標準溶液,結合LCMS-8050 軟件的MRM 電壓自動優化功能,優化目標化合物的母離子、子離子、碰撞能量及采集時間等。同時分析的目標化合物較多時,質譜采集點數和離子對駐留時間均影響其響應和定量準確度[14],試驗依據各化合物的保留時間±1.5 min進行分段,減少冗余采集通道的浪費,在兼顧質譜采集點數的同時,保證各化合物的駐留時間,提高其響應靈敏度和定量準確度。具體的質譜條件見1.2.2節。

2.3 樣品前處理條件的選擇

因為α-羥基酸易溶于水、難溶于非極性有機溶劑,樣品以水為溶劑進行超聲提取,而對于油包水型等在水中不易分散的樣品,先加異丙醇分散樣品,再加水超聲提取,此步驟與標準方法[6]一致,但在標準方法中,樣品先置于“90 ℃水浴中30 min以去除揮發性有機溶劑”,經考察發現,省去此步驟也不影響質譜定量的準確度和精密度,故簡化此步驟,可縮短樣品前處理時間。具體的樣品前處理條件見1.3節。

2.4 基質效應

基質效應(ME)是指色譜分離時共洗脫的物質改變了待測成分的離子化效率,進而引起信號的抑制或增強[15]。在液質聯用分析時,基質效應是普遍存在的問題,往往會降低方法的靈敏度和影響方法的準確度[16-17]。

試驗采用空白基質溶液工作曲線斜率與空白溶劑標準曲線斜率的百分比來考察基質效應[18-19]。市售宣稱美白祛斑、保濕滋潤功效的化妝品的基質類型以水劑、乳液和膏霜居多,因此選取上述3種基質的陰性化妝品,按試驗方法處理,制得空白基質溶液。再分別以空白溶劑和空白基質溶液為稀釋溶劑,配制混合標準溶液系列,進樣分析,繪制標準曲線和工作曲線,得到線性回歸方程,參照ME＝k1/k2(其中k1為空白基質溶液工作曲線的斜率,k2為空白溶劑標準曲線的斜率)計算基質效應,結果見圖2。

圖2 13種α-羥基酸的基質效應Fig.2 Matrix effects of the 13α-hydroxy acids

由圖2 可知,3 種基質化妝品的基質效應為85.0%～120%,說明這3種基質對目標化合物的測定干擾較小,因此試驗方法中以空白溶劑稀釋制備混合標準溶液系列。

2.5 標準曲線、檢出限和測定下限

按照儀器工作條件測定混合標準溶液系列,以α-羥基酸的質量濃度為橫坐標,以對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。13種α-羥基酸的線性范圍、線性回歸方程和相關系數見表2。

表2 線性參數、檢出限和測定下限Tab.2 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

取樣品0.2 g,加水10 mL進行提取,離心過濾后測定,分別以3倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N),以10倍信噪比計算測定下限(10S/N),結果見表2。

結果表明:13種α-羥基酸的質量濃度在一定范圍內與對應的峰面積呈線性關系,相關系數均不小于0.999 0;羥基辛酸、二苯乙醇酸、α-羥基癸酸的檢出限為0.030μg·g－1,羥基乙酸、乳酸的檢出限為3.0μg·g－1,其余8 種α-羥基酸的檢出限均為0.30μg·g－1,該方法中α-羥基酸的檢出限均低于現行標準方法(葡糖醛酸150μg·g－1、酒石酸60μg·g－1、羥基乙酸40μg·g－1、蘋果酸40μg·g－1、乳酸100μg·g－1、檸檬酸40μg·g－1、2-羥基丁酸80μg·g－1、扁桃酸2μg·g－1、羥基辛酸40μg·g－1、二苯乙醇酸1μg·g－1)[6]和文獻[20]報道(酒石酸20μg·g－1、蘋果酸60μg·g－1、乳酸90μg·g－1、檸檬酸40 μg·g－1、2-羥基丁酸400μg·g－1、扁桃酸2μg·g－1、羥基辛酸200μg·g－1、二苯乙醇酸1μg·g－1)的檢出限。

2.6 精密度和回收試驗

分別以水劑、乳液、膏霜等3種基質的陰性化妝品為研究對象,按各化合物的測定下限(低)、5倍測定下限(中)和10倍測定下限(高)等3個濃度水平進行加標回收試驗,每個濃度水平測定6個平行樣品,按試驗方法進樣測定,計算每種基質中各化合物的回收率和相對標準偏差(RSD),結果見表3。

表3 精密度和回收試驗結果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

結果顯示,13種α-羥基酸的回收率為85.1%～114%,測定值的RSD 為0.80%～9.7%,表明方法準確度和精密度能滿足檢測要求。

2.7 樣品分析

隨機選取20批市售化妝品,按照試驗方法測定樣品中13種α-羥基酸的含量,結果見表4。

表4 樣品分析結果Tab.4 Analytical results of the samples

結果顯示:20批樣品均未檢出2-羥基丁酸、羥基辛酸、二苯乙醇酸和α-羥基癸酸;9批樣品中檢出乳酸,檢出率最高;檢出α-羥基酸的總量為20～6 800 mg/100 g,有1批樣品檢出α-羥基酸總量占比大于6%,超出《化妝品安全技術規范》(2015 年版)限值規定,該批樣品檢出了標準方法中未涉及的葡萄糖酸和乳糖酸,若按標準方法中列出的10 種α-羥基酸計算總量,該樣品符合標準規定,該結果驗證了標準方法以10 種α-羥基酸計算總量并不完善。

本工作提出了超高效液相色譜-三重四極桿質譜法測定化妝品中13種α-羥基酸含量的方法。該方法克服了液相色譜法干擾多、靈敏度低的缺點,完善了標準方法中α-羥基酸的測定種類,操作簡便、快速,精密度和準確度良好,可用于化妝品中13種α-羥基酸的含量測定。