牛支原體TrxR胞內抑制EBL細胞凋亡的研究

張 立,何肖肖,馬海云,趙云海,王 青,蔡 偉,邢小勇,武小椿,權國梅,溫峰琴,包世俊

(甘肅農業大學動物醫學院,甘肅蘭州 730070)

牛支原體(Mycoplasmabovis,Mb)是造成牛呼吸道疾病的病原之一,可對養殖業造成嚴重經濟損失[1-2]。Mb感染是通過其自身表面的蛋白對宿主細胞的黏附,逐步侵襲感染細胞造成機體功能的損傷,目前已知的Mb表面黏附因子有α-烯醇酶、NADH氧化酶和亞甲基四氫葉酸tRNA-甲基轉移酶等[3-5],這些Mb膜表面蛋白通過其自身與宿主細胞的黏附完成了牛支原體侵染宿主細胞的第一步。Mb P48蛋白也是一種具有黏附作用的膜表面蛋白,通過黏附宿主細胞進而侵入誘導凋亡因子的表達致使細胞凋亡,Mb P48蛋白在Mb感染宿主細胞并表現出臨床癥狀過程中發揮了重要作用[6]。因此,探討牛支原體在感染宿主細胞的過程中其相關蛋白與宿主細胞的相互作用,對認識Mb發病機制及制備完善的防控方案具有重要意義。

硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase,TrxR)廣泛存在于原核生物及各種細胞中,在細胞各種生理功能的發揮中起著關鍵作用[7]。TrxR在參與細胞分化、生長和死亡、細胞抗氧化損傷、還原抗壞血酸自由基、細胞各種氧化還原信號傳導等過程中發揮關鍵作用[8-9]。TrxR與硫氧還蛋白(Trx)和輔酶NADPH共同構成的硫氧還蛋白系統維持著細胞氧化還原狀態的平衡[10]。研究Mb TrxR在胎牛肺細胞(EBL)中表達,了解其對EBL增殖與凋亡的影響及細胞中過氧化氫(H2O2)含量的變化,有助于解析其與宿主細胞的互作機制,進一步闡述Mb感染和逃避免疫的機制[11],為防控Mb感染引起的疾病積累理論基礎,也可更深地闡述Mb TrxR相關的生物學功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、細胞及載體 牛支原體武威分離株、EBL細胞及pVAX1和pEGFP-N1載體由甘肅農業大學動物醫學院傳染病實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 支原體基礎培養基(HB7025),青島海博生物技術有限公司產品;DNA Marker、T4 DNA Ligase(2011A)、限制性內切酶BamHⅠ(1010S)和XhoⅠ(1094S),寶日醫生物技術(大連)有限公司產品;過氧化氫(H2O2)含量檢測試劑盒(M1020),北京索萊寶科技有限公司產品; MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(C0009S)、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(C1062M),上海碧云天生物技術有限公司產品;2×Hieff Canace?PCR Master Mix高保真酶預混液(10149ES03)、Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix(Q311-02/03),翌圣生物科技(上海)股份有限公司產品;無內毒素質粒小提中量試劑盒(DP118-02),天根生化科技有限公司產品;PEI 40K Transfection Reagent(G1802-1ML),武漢賽維爾生物科技有限公司產品。

1.1.3 主要儀器 生物安全柜,青島海爾生物醫療股份有限公司產品;Minispin小型高速離心機,Hermle公司產品;高壓蒸汽滅菌鍋,上海申安醫療器械廠產品;梯度PCR儀,德國Eppendorf公司產品;電泳儀,北京六一生物科技有限公司產品;凝膠成像儀,君意東方電泳設備有限公司產品;超微量分光光度計,Pultton公司產品;細胞培養箱,上海博迅醫療生物儀器股份有限公司產品;酶標儀,美國Molecular Devices公司產品;倒置熒光顯微鏡,德國ZEISS公司產品;Guava easyCyte流式細胞檢測儀,Millipore公司產品;LightCycler96實時熒光定量PCR儀,瑞士Roche公司產品;細胞超聲破碎儀,浙江寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Mb基因組及pVAX1和pEGFP-N1質粒的提取 取2 mL培養至對數生長中后期的Mb菌液,12 000 r/min離心6 min收集菌體,用水浴法粗提Mb基因組。將含有質粒pVAX1和pEGFP-N1的甘油菌在具有卡那抗性的LB固體培養基劃線復蘇,待其培養至肉眼可見的單菌落時,挑取菌落繼續擴大培養,收集相應菌體用質粒小提試劑盒提取質粒。

1.2.2 引物設計 參照GenBank中Mb Hubei-1株TrxR基因序列(CP002513.1)設計引物對Mb-TrxR-FA、Mb-TrxR-RA和Mb-TrxR-Fa、Mb-TrxR-Ra,在上、下游引物5′端引入酶切位點XhoⅠ和BamHⅠ,其順序依載體而言,pVAX1載體上游引物5′端需引入一段Kozak翻譯起始序列和密碼子ATG,方能正確啟動翻譯(表1);實時熒光定量PCR引物參照文獻[6]進行(表2)。所有引物由北京擎科生物科技有限公司(西安)合成。

表1 Mb TrxR基因PCR擴增引物信息

表2 實時熒光定量PCR引物信息

1.2.3 MbTrxR基因的擴增 以Mb粗提基因組為模板,用引物對Mb-TrxR-FA、Mb-TrxR-RA和Mb-TrxR-Fa、Mb-TrxR-Ra分別擴增片段MbTrxRA和MbTrxRa,反應體系(50 μL):2×Hieff canace?PCR Master Mix高保真酶預混液25 μL,上、下游引物(10 μmol/mL)各2 μL,模板DNA 3 μL,ddH2O補足50 μL。擴增條件為:98℃ 3 min;98℃ 10 s,退火20 s(MbTrxRA和MbTrxRa片段退火溫度分別為57℃和56℃),72℃延伸20 s,32個循環;72℃終延伸 5 min,擴增產物經10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳分離,回收后置-20℃保存備用。

1.2.4 真核表達載體pVAX-TrxR和pEGFP-TrxR的構建及鑒定 分別取20 μL MbTrxRA和MbTrxRa基因片段,20 μL pVAX1質粒和20 μL pEGFP-N1質粒于4個1.5 mL離心管中,加入以下組分后用限制性內切酶XhoⅠ和BamHⅠ進行雙酶切(表3)。

表3 酶切體系

分別將以上組分混合后的離心管置于37℃水浴鍋酶切反應7 h,酶切產物用通用型DNA純化回收試劑盒回收,對酶切后的基因片段與線性載體進行連接、轉化。在轉化后的固體培養基挑取單菌落經PCR驗證和重組質粒酶切驗證后測序,正確的質粒分別命名為pVAX-TrxR和pEGFP-TrxR。

1.2.5 重組質粒轉染EBL細胞 擴大培養含有質粒pVAX1、pEGFP-N1、pVAX-TrxR、pEGFP-TrxR的大腸桿菌Trans 5α,各取15 mL菌液用無內毒素質粒小提中量試劑盒按說明書提取質粒,重組質粒用超微量分光光度計測取濃度(表4)。將培養至生長狀態良好的EBL細胞以每孔4×105個接種至6孔細胞培養板,待其生長至融合度達到85%左右時開始轉染。轉染前各孔棄原培養液,用0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS)緩慢清洗1次后換成1.8 mL不含胎牛血清(FBS)和抗生素的培養液。

轉染時先在潔凈無菌的離心管中分別加入100 μL不含FBS與抗生素的高糖DMEM培養基和3 μg的質粒DNA(pVAX1、pEGFP-N1和pVAX-TrxR、pEGFP-TrxR),輕輕吹吸混勻配制成A液,再取無菌離心管加入100 μL不含FBS及抗生素的高糖DMEM培養基和10 μL轉染試劑PEI 40 K Transfection Reagent,輕輕吹吸混勻配制成B液,將A液和B液輕微混合后室溫孵育15 min,最后將配置好的轉染復合物(DNA-PEI)加入到含1.8 mL細胞培養液的6孔細胞培養板中,將細胞放入細胞培養箱進行培養,6 h之后向培養液中加入終濃度3%的FBS,然后每隔24 h換完全培養基(FBS終濃度10%)一次。

1.2.6 MTT法檢測細胞增殖 將生長狀態良好的EBL細胞以每孔1.5×104個傳至96孔細胞培養板,待其融合度達到85%左右時用PBS洗滌細胞一次后換成無血清無抗生素培養基,按1.2.5方法轉染細胞,在96孔細胞培養板中依次加入含pVAX1、pVAX-TrxR、pEGFP-N1、pEGFP-TrxR質粒的DNA-PEI 10 μL(96孔細胞培養板DNA和PEI用量分別為0.1 μg/孔和0.35 μL/孔),同時設置加入0.35 μL的PEI和等體積PBS的細胞孔做陰性對照組和空白對照組,每組設3個重復孔,各組細胞依次培養24 h、48 h、72 h,每間隔12 h換一半培養液。各時間段結束后用MTT試劑盒檢測分析EBL細胞的增殖情況。

1.2.7 Annexin V-FITC試劑盒檢測細胞凋亡 取EBL細胞以每孔3×105個接種至6孔細胞板,待細胞融合度達85%左右時轉染,將含pVAX1、pVAX-TrxR、pEGFP-N1、pEGFP-TrxR質粒的細胞及PEI陰性對照組和PBS空白對照組細胞分別培養24 h、48 h、72 h,培養結束后胰酶消化并細胞計數,各組取5×104～1×105個細胞參照Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明書處理后用流式細胞儀檢測Mb TrxR表達對EBL細胞凋亡的影響。

1.2.8 實時熒光定量PCR法檢測凋亡因子表達 按1.2.7方法處理細胞,收集細胞后用Trizol法提取總RNA,將RNA逆轉錄為cDNA,以cDNA為模板,采用實時熒光定量PCR法(GAPDH為內參基因),用2-ΔΔCt方法分析EBL細胞中Bax、Beclin-1、caspase3、caspase4、P53凋亡因子在各時間段受細胞中TrxR蛋白影響的mRNA表達情況。

1.2.9 細胞內過氧化氫(H2O2)含量檢測 按1.2.7方法處理后的細胞,PBS洗滌計數后各取5×106個1 500 r/min室溫離心8 min,棄去PBS,每個離心管中加入1 mL丙酮后冰浴,用超聲破碎儀破碎細胞(功率為20%,工作3 s,間隔3 s,工作3 min),破碎后的細胞按H2O2含量檢測試劑盒說明書。檢測各時間段Mb TrxR在細胞內表達對細胞內H2O2含量的影響。使用以下公式計算EBL細胞內H2O2的含量。

EBL細胞內H2O2的含量(μmol/104cell)=ΔA測定÷(ΔA標準÷C標液)×V樣本÷(500×V樣本÷V提取)=0.004×ΔA測定÷ΔA標準。

其中,ΔA測定=A測定管-A空白管,ΔA標準=A標準管-A空白管。

2 結果

2.1 Mb TrxR基因的擴增

以Mb粗提基因組為模板,引物Mb-TrxR-FA、Mb-TrxR-RA和Mb-TrxR-Fa、Mb-TrxR-Ra經PCR分別擴增獲得片段MbTrxRA和MbTrxRa,10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳分離后在凝膠成像儀下可見約952 bp和942 bp大小的目的條帶,與預期大小相符(圖1)。

M.DNA標準DL 2 000;1.Mb TrxRA擴增結果;3.Mb TrxRa擴增結果;2,4.陰性對照 M.DNA Marker DL 2 000; 1.Mb TrxRA amplification result; 3.Mb TrxRa amplification result; 2,4.Negative control

2.2 真核表達載體pVAX-TrxR和pEGFP-TrxR的構建及鑒定

構建的真核表達載體pVAX-TrxR和pEGFP-TrxR轉化后挑取單菌落分別進行PCR鑒定,經PCR鑒定為陽性的菌擴大培養后提取質粒pVAX-TrxR和pEGFP-TrxR,對重組質粒用XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切,可切出大小約952 bp和942 bp的目的片段(圖2)。經雙酶切驗證后的質粒送生物公司進行測序,結果顯示成功獲得序列正確的重組質粒。

M.DNA標準DL 2 000;1.Mb TrxRA酶切結果;2.Mb TrxRa酶切結果 M.DNA Marker DL 2 000; 1.Results of Mb TrxRA enzyme digestion; 2.Results of Mb TrxRa enzyme digestion

2.3 pEGFP-TrxR在細胞內的表達情況

由于pEGFP-N1載體帶有綠色熒光蛋白(GFP)基因,表達后的GFP在熒光顯微鏡下有綠色熒光。為了驗證質粒的轉染效率及重組質粒在EBL細胞中的表達情況,分別將轉染質粒pEGFP-N1和pEGFP-TrxR后培養24 h和48 h的EBL細胞用40 mL/L多聚甲醛室溫固定30 min,依次用10 μmol/L DiI染色液和PBS 1∶50稀釋的 DAPI 染色液對細胞膜和細胞核染色10 min,PBS充分洗滌用抗熒光淬滅劑封片后置于熒光顯微鏡下觀察細胞形態和GFP的表達情況。結果顯示,轉染pEGFP-N1和pEGFP-TrxR質粒后的EBL細胞內均有GFP蛋白表達且細胞形態正常,GFP表達量隨培養時間的增加而增加;轉染pEGFP-N1質粒后的EBL細胞(A、C組)GFP表達量明顯高于轉染pEGFP-TrxR質粒后的細胞(B、D組),B、D組細胞內GFP的表達受到細胞內TrxR表達的影響而低于A、C組(圖3)。

A.pEGFP-N1轉染24 h;B.pEGFP-TrxR轉染24 h;C.pEGFP-N1轉染48 h;D.pEGFP-TrxR轉染48 h A.pEGFP-N1transfection 24 h; B.pEGFP-TrxR transfection 24 h; C.pEGFP-N1 transfection 48 h; D.pEGFP-TrxR transfection 48 h

2.4 TrxR胞內表達對EBL細胞增殖的影響

轉染pVAX1、pVAX-TrxR、pEGFP-N1、pEGFP-TrxR質粒的試驗組及PEI陰性對照組和PBS空白對照組中各組的EBL細胞增殖隨時間的增加而增加,由于轉染劑及載體本身對細胞的影響,24 h、48 h和72 h三個時間段的EBL活細胞數始終少于PBS空白組(圖4),說明PEI對EBL細胞的生長有一定的毒害作用,載體pEGFP-N1與pVAX1對EBL細胞的生長也有很大的影響,相比而言,載體pVAX1對細胞的影響較小,所以pVAX1更有利于外源基因的真核表達。在此試驗中,pVAX-TrxR、pEGFP-TrxR實驗組細胞增殖明顯高于pVAX1、pEGFP-N1對照組,兩者差異性極顯著,表明細胞內表達的Mb TrxR蛋白促進EBL細胞的增殖。

與對應空載體pVAX1、pEGFP-N1組相比,**P<0.01

2.5 TrxR胞內表達對EBL細胞凋亡的影響

將各組細胞培養48 h后用流式細胞術檢測。結果顯示,由于質粒本身屬性對細胞生長的影響,轉染pVAX1、pVAX-TrxR、pEGFP-N1、pEGFP-TrxR質粒后的細胞凋亡率高于空白對照組;轉染劑對細胞生長的影響,PEI陰性對照組細胞凋亡率略高于空白對照組;空載體pVAX1、pEGFP-N1組細胞凋亡率高于pVAX-TrxR、pEGFP-TrxR試驗組,兩組差異性顯著,載體pVAX1組細胞凋亡率低于pEGFP-N1組(圖5),表明胞內表達的Mb TrxR蛋白對EBL細胞的凋亡具有抑制作用,且載體pVAX1更有利于TrxR蛋白的表達和作用的發揮。

與對應空載體pVAX1、pEGFP-N1組相比,*P<0.05Compared with the corresponding empty carriers pVAX1 and pEGFP-N1,*P<0.05

2.6 實時熒光定量PCR檢測凋亡標志物mRNA的變化

分析結果表明(圖6),由于凋亡因子在細胞生長各期的表達量不同,所以其mRNA表達水平也不相同,在自然凋亡情況下,凋亡因子Beclin-1 mRNA表達量隨培養時間的增加呈先降后升的趨勢,其他凋亡因子在72 h內與培養時間成正比;僅有PEI的陰性對照組和PBS空白對照組的試驗中,凋亡因子Bax、caspase3、P53 mRNA表達水平隨培養時間的延長而增加,且PEI組在各時間段略高于PBS組,說明PEI造成細胞損傷加速了其自然凋亡;當載體中TrxR基因表達時EBL細胞的凋亡率低于對應空載體組,且隨著培養時間的延長兩組細胞中凋亡因子mRNA表達量差異性越顯著,載體pVAX1試驗組細胞中各凋亡因子在3個時間段均低于pEGFP-N1組,表明pVAX1載體在真核表達中更具優勢。此試驗中,TrxR蛋白抑制了各凋亡因子的表達,進一步證明了Mb TrxR蛋白具有抑制EBL細胞凋亡的作用。

2.7 EBL細胞中H2O2含量的變化

H2O2含量測定試驗結果顯示,在未處理細胞組中,H2O2含量在48 h之前隨細胞培養時間的延長而降低,由于48 h之后細胞密度增加,產生了過氧化氫酶(CAT)及細胞本身保護性機制的應激作用致使H2O2含量保持在一定的范圍;基于pVAX1載體試驗中(圖7A),重組質粒pVAX-TrxR試驗組H2O2含量低于pVAX1空載體組,兩組差異性極顯著,且pVAX-TrxR組48 h及之后的時間段H2O2的含量低于空白對照組;基于pEGFP-N1載體試驗中(圖7B),重組質粒pEGFP-TrxR試驗組H2O2含量低于pEGFP-N1空載體組,兩組在48 h之前具有顯著性差異,48 h及之后的時間段H2O2的含量接近空白對照組。載體pVAX1試驗組TrxR蛋白對EBL細胞H2O2降低效果較pEGFP-N1載體顯著,充分說明了載體pVAX1更適合外源基因在細胞內的表達。此試驗驗證了TrxR蛋白可以降低細胞內H2O2含量,對細胞有抗氧化損傷的作用。進一步證明了Mb TrxR蛋白有利于促進EBL細胞生長,間接抑制其凋亡。

與空載體組相比,*P<0.05,**P<0.01Compared with pVAX1 empty vector group,*P<0.05,**P<0.01圖7 Mb TrxR在細胞內基于載體pVAX1(A)和pEGFP-N1(B)表達后各時間段H2O2含量的變化

3 討論

硫氧還蛋白系統是體內非常重要的抗氧化系統,該系統包括硫氧還蛋白、TrxR、NADPH、內源性硫氧還蛋白抑制劑和硫氧還蛋白相關蛋白[12]。TrxR作為硫氧還蛋白系統的最主要的蛋白之一,對體內代謝產生的氧化物調節和氧化還原穩態具有重要的作用[13],TrxR也是細胞主要的氧化還原調節因子,能夠有效降低細胞產生的活性氧,從而降低對細胞的損傷[14]。研究發現,解脲支原體的硫氧還蛋白系統具有自我排毒的功能,它可以使宿主細胞免受自身代謝產生的氧化物的侵害[15]。抑制TrxR蛋白活性能夠促進三陰性乳腺癌(TNBC)細胞的凋亡[16];研究Mb TrxR蛋白對EBL細胞增殖和凋亡的影響,有助于了解該蛋白在Mb感染宿主中發揮的作用,進一步揭示Mb的致病性及逃避和調節宿主反應的策略,為研發有效疫苗奠定基礎。

為進一步確認Mb TrxR蛋白的效應,本研究采用真核表達載體pVAX1或pEGFP-N1在EBL細胞內表達Mb TrxR,通過MTT試驗和流式細胞技術檢測對細胞增殖和凋亡的影響,結果分析發現,Mb TrxR蛋白通過還原細胞內的活性氧包括降低細胞內H2O2的含量調節氧化還原的穩態,進而打造適合細胞生長的環境促進其生長;另一方面,它能夠與硫氧還蛋白系統協調,通過激活調節細胞生長的轉錄因子,增加細胞對其他細胞因子和生長因子的敏感性,從而維持細胞內氧化還原狀態的動態平衡[18]。細胞凋亡主要受細胞內死亡受體及線粒體通路的調控[16],而TrxR主要分布在細胞線粒體上,TrxR與細胞凋亡密切相關,研究發現TrxR蛋白通過抑制凋亡因子Bax、caspase3、P53 mRNA的表達量從而下調凋亡因子的表達抑制EBL細胞的凋亡,從細胞培養時間的梯度來看,Mb TrxR在細胞內營造了適合細胞生長的內環境,導致細胞自然凋亡速率減慢,在細胞培養48 h之后,出現過多積累的衰老細胞又可以激活凋亡因子caspase3的表達,使其進一步促進下游效應因子前列腺素E2的表達而刺激活細胞的生長[19]。整體來說,Mb TrxR蛋白作用EBL細胞后,一方面抑制了凋亡因子mRNA的表達,從而抑制EBL細胞的凋亡,另一方面還原Trx在細胞代謝中產生的過氧化物使其免受損傷而進一步保護宿主細胞。細胞線粒體TrxR蛋白抑制細胞凋亡的通路調控,需進一步研究探索。

本試驗中基于pVAX1或pEGFP-N1兩種載體表達Mb TrxR蛋白,結果顯示,pVAX1載體更有利于外源蛋白的表達以及蛋白作用的發揮,而pEGFP-N1載體可以通過本身GFP的表達量來檢測外源蛋白TrxR的表達。該試驗中Mb TrxR蛋白對EBL細胞作用的初步研究,為進一步了解牛支原體感染機制和制定有效的抗牛支原體策略提供更多可靠的數據。