基于RT-RAPID和CRISPR-Cas12a的諾如病毒GⅡ.6亞型核酸檢測方法的建立

冉紅志,樊 成,王雪飛,劉 靜,康 婕,錢衛東,王 婷*

(1.陜西省動物疫病預防控制中心,陜西西安 710016;2.陜西省產品質量監督檢驗研究院,陜西西安 710048;3.陜西科技大學生物與醫藥學院,陜西西安 710021)

諾如病毒(Norovirus,NoV)又名諾瓦克病毒,為杯狀病毒科諾如病毒屬成員,是一種正鏈RNA病毒,基因組全長約7 600 bp[1]。諾如病毒根據VP1氨基酸序列可被分成10多個基因組型(如GⅠ-GⅦ),40多個基因亞型[2-4],其中GⅠ、GⅡ和GⅣ可感染人類,GⅡ可進一步分為22個基因型[5-7]。諾如病毒是一種重要的食源性病毒,能通過水源及貝類感染人類,造成急性胃腸炎[8]。近年來,許多國家均出現過諾如病毒疫情[9-10],經濟貝類牡蠣是諾如病毒主要傳播媒介之一。高溫加熱可有效殺滅牡蠣中的諾如病毒,但會破壞牡蠣的鮮美風味,人們傾向于生食或輕微烹煮牡蠣。如果牡蠣中存在活的諾如病毒,就會增加感染諾如病毒的風險[11]。

食品中諾如病毒的檢測主要利用反轉錄實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-qPCR),該方法操作繁瑣,耗時長,工作量較大,且需要復雜的設備[12]。核酸恒溫擴增技術,如重組酶介導的恒溫擴增(RAA)、重組酶聚合酶恒溫擴增(RPA)、依賴核酸序列的擴增(NASBA)、反轉錄重組酶和聚合酶等溫檢測(RT-RAPID)等技術,無需高溫變性和梯度溫度改變,借助特有的引物和酶可實現百萬倍擴增靶標核酸。特別是CRISPR-Cas12a作為一種高精度生物識別工具[13],與RT-RPA組合使用,開發了RT-RPA-Cas12a檢測平臺[14],進一步提高了對病原體或突變位點的檢測靈敏度和特異性。本研究建立的RT-熒光法和RT-Cas12a熒光法具有敏感、特異、耗時短、操作簡便等優點,適用于現場快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和寡核苷酸 含有諾如病毒GⅡ.6保守序列的重組質粒的甘油大腸埃希氏菌菌株。RT-引物、用于合成crRNA的寡核苷酸和RT-RAPID熒光探針,生工生物工程(上海)股份有限公司產品。用于Cas12a檢測的ssDNA熒光報告分子,金唯智(蘇州)生物科技有限公司產品。

1.1.2 主要試劑 RT-等溫擴增試劑盒,樂尚(無錫)生物科技有限公司產品;體外轉錄試劑盒和RT-PCR試劑,寶日醫生物技術(北京)有限公司產品;Gene Green核酸染料、小質粒提取試劑盒、DL 2 000 Maker,天根生化科技(北京)有限公司產品;瓊脂糖,貝晶(上海)生物技術有限公司產品;SacⅠ內切酶,碧云天(上海)科技有限公司產品;核酸快速提取試劑盒,QIAGEN產品;CRISPR-Cas12a蛋白,NEB(北京)有限公司產品;DEPC水和TE緩沖液,飛凈生物科技有限公司產品;RNase抑制劑,賽默飛(上海)科技有限公司產品。

1.1.3 主要儀器 熒光PCR儀,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;全自動核酸提取儀,江蘇碩世生物科技有限公司;恒溫搖床,上海藍豹試驗設備有限公司;恒溫培養箱,上海博準電子科技有限公司;超凈工作臺,上海蘇凈實業有限公司;超微量紫外分光光度計,上海元析儀器有限公司;蒸汽滅菌鍋,上海申安醫療器械廠;恒溫擴增儀器,Axxin ISO-T8;電泳儀,美國Bio-Rad公司;超高速低溫離心機,德國Sigma 3K15;電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 諾如病毒GⅡ.6保守序列的確定和人工合成 從NCBI網站下載12株諾如病毒GⅡ.6亞型的全基因組序列,選用的諾如病毒GⅡ.6序列登錄號為KU870455.1、MG571778.1、KY424348.1、KY424345.1、KY424346.1、KY424344.1、KY424341.1、HQ169542.2、KJ407072.2、JX989075.1、KX268709.1和LN854568.1。用Mega7.0的ClustalW功能對12株諾如病毒GⅡ.6亞型基因組序列進行比對,確定諾如病毒GⅡ.6亞型基因組中RdRp基因中的一段長492 bp保守序列作為靶標。諾如病毒GⅡ.6保守序列由生工生物工程(上海)有限公司合成,并被克隆至質粒pBluescript Ⅱ SK+中,重組質粒命名為pBlu-NOV-GⅡ.6,接著將重組質粒轉化到大腸埃希氏菌TOP10感受態細胞中,構建重組菌株TOP10-GⅡ.6。將重組菌株TOP10-GⅡ.6培養至對數生長期,離心收集菌體細胞,并利用質粒小提取試劑盒提取質粒pBlu-NOV-GⅡ.6,接著利用超微量分光光度計測定質粒濃度,置于-20℃備用。

1.2.2 諾如病毒GⅡ.6亞型RT-RAPID反應引物和熒光探針的設計 與傳統PCR反應相比,RT-RAPID無變性和退火過程,通過重組酶和單鏈結合蛋白作用實現模板解鏈及引物與模板的配對。RT-RAPID引物長度通常在30 nt-35 nt,GC含量為40%～60%。RT-RAPID熒光探針長度為46 nt-52 nt,GC含量為40%～60%,且經四氫呋喃(tetrahydrofuran,THF)修飾。當RT-RAPID反應延伸至熒光探針結合位點時,核酸內切酶誤以為復制出現錯誤而啟功修復功能,使熒光基團游離出來而產生熒光信號,以指示擴增產物的合成?；谶@一基本原則,根據諾如病毒GⅡ.6亞型的保守序列設計6條RT-RAPID反應引物和1條熒光探針,相應的寡核苷酸序列信息如表1所示。

表1 RT-RAPID引物、探針序列、crRNA和ssDNA報告分子寡核酸序列Table 1 RT-RAPID primer,probe sequences,crRNA and ssDNA sequences

1.2.3 crRNA的設計和制備 從諾如病毒GⅡ.6亞型保守序列中找到原間隔序列鄰近基序(PAM)位點,基于PAM位點設計5條crRNA。具體如下:先從保守序列中定位找到PAM位點(TTTN),進而按照5′→3′方向將PAM位點后24個堿基序列確定為crRNA結合位點。接著在crRNA的5′端添加1個富含腺嘌呤與尿嘧啶序列,該序列用于形成莖環結構促使Cas12a發揮作用[15],5′端莖環結構序列參照相關文獻[16]。用于體外制備crRNA的單鏈寡核苷酸序列見表1,該序列由Songon Biotech公司合成。單鏈寡核苷酸序列包括:T7啟動子(TAATACGACTCACTATAGG)+ Cas12a的scaffold序列(AATTTCTACTAAGTGTAGAT)+靶向序列,將此作為轉錄模板的F鏈,反向互補鏈為R鏈。F鏈和R鏈寡核苷酸序列經退火后得到crRNA的轉錄模板dsDNA,再利用轉錄體系對模板dsDNA進行體外轉錄,制備crRNA,并利用超微量分光光度計測定質粒濃度和純度,置于-20℃備用。

1.2.4 諾如病毒GⅡ.6亞型保守序列標準RNA的制備 pBlu-NOV-GⅡ.6經SacⅠ酶切線化處理后,用通用型DNA純化回收試劑盒對酶切產物回收處理,得到的線化質粒作為轉錄模板。由于載體pBluescript Ⅱ SK+自身具有T7啟動子,可直接用體外轉錄試劑盒對純化的線化質粒進行體外轉錄,得到含NOV GⅡ.6-RdRp靶向序列的諾如病毒GⅡ.6亞型保守序列標準RNA,作為RT-RAPID的模板標準品。制備的標準RNA經超微量分光光度計測定濃度,并計算拷貝數,置于-20℃備用。

1.2.5 諾如病毒GⅡ.6亞型RT-RAPID反應引物的篩選 將設計的3對引物按照不同組合(NOV-GⅡ.6-F1/NOV-GⅡ.6-R1、NOV-GⅡ.6-F1/NOV-GⅡ.6-R2、NOV-GⅡ.6-F1/NOV-GⅡ.6-R3、NOV-GⅡ.6-F2/NOV-GⅡ.6-R3、NOV-GⅡ.6-F3/NOV-GⅡ.6-R3)進行反應,篩選出最佳反應引物。利用RT-RAPID擴增試劑盒進行篩選,反應體系如下:25 μL緩沖液、2 μL(10 μmol/L)引物F、2 μL(10 μmol/L)引物R、10.5 μL無RNase水、5 μL標準RNA、2 μL(1 μmol/L)NOV-GⅡ.6-探針、0.5 μL(40 U)RNase抑制劑、3 μL啟動劑,總反應體積為50 μL。將反應體系放入T8等溫擴增儀中進行反應,反應條件為:39℃ 40 min,每隔10 s收集1次熒光信號。擴增產物用20 g/L瓊脂糖凝膠進行觀察,分析RT-RAPID的擴增效果。

1.2.6 諾如病毒GⅡ.6亞型RT-RAPID反應溫度的優化 在最佳引物條件下,將反應溫度定為35、37、39、42、44℃進行RT-RAPID反應。反應體系放入恒溫擴增儀AxxinISO-T8中進行反應,確定RT-RAPID的最佳反應溫度。

1.2.7 諾如病毒GⅡ.6亞型RT-RAPID熒光法的靈敏度和特異性分析 基于優化的反應引物和反應溫度,分別用終濃度為1 000、100、10、1、0.1、0 copies/μL的諾如病毒GⅡ.6亞型保守序列標準品RNA作為模板進行RT-RAPID反應。擴增產物用熒光報告探針進行檢測,以判斷諾如病毒GⅡ.6亞型RT-RAPID熒光法的靈敏度。按照核酸提取試劑盒說明書,分別提取諾如病毒GⅡ.17、鼻病毒、博卡病毒、偏肺病毒等病毒核酸,并選取諾如病毒GⅡ.6亞型保守序列標準品RNA和ddH2O作為陽性和陰性對照,對提取的核酸用建立的諾如病毒GⅡ.6亞型RT-RAPID熒光法進行檢測,分析其特異性。

1.2.8 crRNA的篩選 crRNA序列對RT-RAPID-Cas12a檢測方法的靈敏度及特異性影響較大,篩選crRNA成為建立RT-RAPID-Cas12a熒光法的重要步驟。將5條crRNA分別加入到RT-RAPID-Cas12a反應體系中,反應體系為5 μL緩沖液、2 μL(1 μmol/L)crRNA、2 μL(1 μmol/L)ssDNA報告分子、0.5 μL(40 U)RNase抑制劑、33.5 μL無RNase/DNase水、2 μL(1 μmol/L)LbaCas12a蛋白和5 μL RT-RAPID擴增產物。將反應體系置于恒溫擴增儀AxxinISO-T8中,在37℃條件下反應40 min,每隔10 s收集1次熒光信號。檢測效果根據熒光曲線進行觀察,分析RT-RAPID-Cas12a熒光法的檢測效果,確定最佳的crRNA,用于后續研究。

1.2.9 RT-RAPID-Cas12a的靈敏度和特異性分析 將不同濃度的諾如病毒GⅡ.6亞型保守序列標準RNA(1000、100、10、1、0.5、0.1、0.05 copies/μL)作為模板進行RT-RAPID擴增,39℃反應30 min。然后將擴增產物轉移到Cas12a檢測體系中進行反應,37℃反應40 min。擴增產物用熒光信號進行檢測,以判斷諾如病毒GⅡ.6亞型RT-RAPID-Cas12a熒光法的靈敏度。將諾如病毒GⅡ.17亞型、鼻病毒、博卡病毒和偏肺病毒核酸,以及取諾如病毒GⅡ.6亞型保守序列標準RNA和ddH2O作為陽性和陰性對照模板,用建立的諾如病毒GⅡ.6亞型RT-RAPID-Cas12a熒光法進行檢測,分析其特異性。

1.2.10 模擬臨床樣本分析 稱取60 g牡蠣消化腺組織,用勻漿機處理得到均漿液。分別吸取1 mL均漿液加到25個無菌無RNase酶的epp管中,向其中20個epp管中分別加入諾如病毒GⅡ.6亞型RNA樣品使其充分混勻,使GⅡ.6亞型RNA樣品濃度為100 copies/μL。5個陰性對照組epp管不加RNA樣品。用RNA提取試劑盒提取模擬臨床樣本中的RNA,再用RT-RAPID和RT-RAPID-Cas12a熒光法對每份樣本核酸進行平行分析,熒光定量RT-PCR反應參照文獻進行。

2 結果

2.1 諾如病毒GⅡ.6亞型RT-RAPID的最佳反應引物

5對引物都能擴增出相應的片段,其中第3對引物(NOV-GⅡ.6-F1/NOV-GⅡ.6-R3)擴增強度高、特異性好,因此選擇第3對引物用于后續試驗(圖1)。

M.DNA標準DL 2 000;1.引物對NOV-GⅡ.6-F1/NOV-GⅡ.6-R1;2.引物對NOV-GⅡ.6-F1/NOV-GⅡ.6-R2;3.引物對NOV-GⅡ.6-F1/NOV-GⅡ.6-R3;4.引物對NOV-GⅡ.6-F2/NOV-GⅡ.6-R3;5.引物對NOV-GⅡ.6-F3/NOV-GⅡ.6-R3;NC.陰性對照擴增產物

2.2 諾如病毒GⅡ.6亞型RT-RAPID的最佳反應溫度

當反應溫度設定為35、37、39、42、44℃時,39℃時熒光曲線斜率最大,且熒光信號產生時間與其他溫度差異不大,因此其最佳反應溫度設定為39℃(圖2)。

圖2 諾如病毒GⅡ.6亞型RT-RAPID反應溫度的篩選

2.3 諾如病毒GⅡ.6亞型RT-RAPID熒光特異性

以不同病毒的核酸作為模板進行RT-RAPID反應(圖3),只有諾如病毒GⅡ.6亞型保守序列標準RNA擴增曲線為陽性,而其他病毒核酸樣本及陰性對照均無擴增信號,即為陰性,表明建立的RT-RAPID熒光法具有良好的特異性。

圖3 諾病毒GⅡ.6亞型RT-RAPID熒光法的特異性分析

2.4 諾如病毒GⅡ.6亞型RT-RAPID熒光靈敏度

以不同拷貝數的諾如病毒GⅡ.6亞型保守序列標準RNA分別作為模板,以諾如病毒GⅡ.6亞型RT-RAPID熒光法進行檢測(圖4)。擴增產生的熒光信號隨著諾如病毒GⅡ.6亞型保守序列標準RNA濃度下降逐漸減少,熒光曲線斜率也隨著模板濃度降低而降低,最低檢出限可達10 copies/μL,表明RT-RAPID熒光法的檢測靈敏性較高。

圖4 諾如病毒GⅡ.6亞型RT-RAPID熒光法的靈敏度分析

2.5 crRNA篩選

以不同crRNA作為引導序列,以建立的諾如病毒GⅡ.6亞型RT-RAPID-Cas12a熒光法進行反應分析(圖5)。在有靶向序列存在時,3條crRNA能與Cas12a形成crRNA-Cas12a-靶向序列復合物,并能有效激活Cas12a核酸酶活性,發生剪切ssDNA報告分子,產生明顯的熒光信號,而另外2條未能激活Cas12a核酸酶活性。cRNA1r介導產生的熒光信號最強,熒光曲線斜率最大。因此,crRNA1r設定為最佳的crRNA。

圖5 不同crRNA序列對諾如病毒GⅡ.6亞型RT-RAPID-Cas12a反應靈敏度的影響

2.6 RT-RAPID-CRISPR-Cas12a熒光法的特異性

以不同病毒核酸作為模板進行RT-RAPID-Cas12a反應(圖6),只有諾如病毒GⅡ.6亞型保守序列標準RNA作為模板的反應產生了陽性熒光信號,而其他病毒核酸樣本及陰性對照作為模板的反應均未產生熒光信號,即為反應結果為陰性,表明建立的RT-RAPID-Cas12a熒光法具有良好的特異性。

圖6 諾如病毒GⅡ.6亞型RT-RAPID-Cas12a熒光法的特異性分析

2.7 RT-RAPID-CRISPR-Cas12a熒光法的靈敏度

以不同拷貝數的諾如病毒GⅡ.6亞型保守序列標準RNA作為模板,利用建立的諾如病毒GⅡ.6亞型RT-RAPID-Cas12a熒光法進行分析(圖7)。反應產生的熒光信號隨著模板濃度升高逐漸增加,且熒光曲線斜率與模板濃度呈正相關,最低檢出限可達到0.5 copies/μL,表明RT-RAPID-Cas12a熒光法的檢測靈敏性高。

圖7 諾如病毒GⅡ.6亞型RT-RAPID-Cas12a熒光法的靈敏度分析

2.8 模擬樣本分析

模擬樣本總量為25個,RT-RAPID熒光法檢出陽性樣本18個陰性樣本5個;RT-RAPID-Cas12a熒光法檢出陽性樣本18個,陰性樣本5個;RT-qPCR方法檢出陽性樣本20個,陰性樣本5個。RT-RAPID熒光法和RT-RAPID-Cas12a熒光法與RT-qPCR方法的陽性樣本一致率均為90%,陰性樣本一致率均為100%,表明建立的RT-RAPID熒光法和RT-RAPID-Cas12a熒光法靈敏性好。

3 討論

諾如病毒可以通過食物和水作進行傳播引發急性腸胃炎[4],易在幼兒園、學校、醫院和養老院等人口流動較大或人員密集場所引起聚集性疫情[17-18]。目前仍沒有特效的抗病毒藥物和疫苗,“早發現、早診斷、早隔離”是有效控制諾如病毒的關鍵[19]。諾如病毒的檢測方法主要有電鏡法、免疫學方法和核酸分子檢測[20]。電鏡法對于操作人員的水平要求較高,且靈敏度較低[12,21],不適合現場快速檢測?；诳乖贵w特異性結合反應的免疫學檢測,需要制備高質量的抗體或抗原,生產成本較高,且諾如病毒的抗原蛋白質易出現變異影響其靈敏度和特異性?；趯崟r熒光定量PCR的核酸分子檢測是諾如病毒的金標準,但需要專業化的實驗室才能進行分析[22]。RT-RAPID和RT-RAPID-Cas12a熒光法具有快速、靈敏、操作簡單,且無需復雜設備等優勢[23]。

本研究建立了一種可用于諾如病毒GⅡ.6亞型檢測的RT-RAPID熒光方法,通過對諾如病毒GⅡ.6亞型基因組比對分析,確定基因組中RdRp基因片段為靶向檢測序列;進而對RT-RAPID的最佳反應條件進行優化,發現最佳反應溫度為39℃,該方法在39℃恒溫培養30 min內即可完成檢測,最低檢測值為10 copies/μL,且與常見的幾種病毒無交叉反應。為進一步提高檢測靈敏性,Cas12a檢測方法被組合使用,并對crRNA進行了優化,結果發現RT-RAPID-Cas12a熒光法的最低檢測值可達0.5 copies/μL,且特異性強。文獻報道諾如病毒常規的RT-PCR和熒光RT-qPCR最低檢出限分別為103copies/μL和102copies/μL[21],表明本研究建立的諾如病毒GⅡ.6亞型RT-RAPID熒光法和RT-RAPID-Cas12a熒光法靈敏性均高于RT-PCR。

本研究建立的諾如病毒GⅡ.6亞型RT-RAPID熒光法和RT-RAPID-Cas12a熒光法具有靈敏度和特異性高,且易于操作和無需復雜設備,這為諾如病毒GⅡ.6亞型的快速檢測提供了新方法。