兔出血癥2型研究進展

董 浩,張樂穎,左 琴,董青花,朱婉月,劉佐民,梁春南

(中國食品藥品檢定研究院 國家嚙齒類實驗動物資源庫,北京 102629)

兔出血癥(Rabbit hemorrhagic disease,RHD)又稱兔瘟、兔出血性肺炎,是由杯狀病毒科(Caliciviridae)兔出血癥病毒屬(Lagovirus)兔出血癥病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)引起兔的一種急性、敗血性、高度致死性傳染病,該病于1984年首次在我國江蘇無錫等地暴發[1]。兔出血癥2型(Rabbit hemorrhagic disease type 2,RHD2)又稱兔瘟2型,是由兔出血癥病毒2型(Rabbit hemorrhagic disease virus type 2,RHDV2)引起的危害家兔和野兔的一種新型高度傳染性、急性致死性疫病,該病是世界動物衛生組織(WOAH)法定通報疫病。2022年6月農業農村部修訂發布的最新版本的《一、二、三類動物疫病病種名錄》中,將兔出血癥列為二類動物疫病。

RHDV2與RHDV的主要不同之處在于,RHDV主要引起成年家兔感染,而RHDV2感染的宿主范圍更廣,不僅可以感染成年家兔和幼年家兔,而且對多個品種的野兔造成感染。此外,RHDV的病死率可高達80%～90%,而RHDV2的病死亡稍低,但其跨度較大。

1 國內外流行情況

RHD2于2010年4月在法國首次發現,隨后RHD2呈現出向外蔓延趨勢,意大利、西班牙、德國、葡萄牙、英國、挪威等多數西歐國家和亞速爾群島,以及北非和南非一些國家陸續報道了該病的發生[2-3]。自從2016年傳入加拿大的魁北克以來,在北美洲地區發生了多起RHD2疫情。2018-2021年,美國的華盛頓、俄亥俄州、加利福尼亞州、以及紐約等地區發生了多起疫情。該病在美國已經呈現出擴散勢態[4]。2019年5月,日本愛媛縣暴發了首起RHD2疫情,10只1～2歲的兔在2周內陸續死亡[5]。2020年9月,新加坡從發病的歐洲兔群中首次分離到RHDV2病毒[6]。

2020年4月,我國四川省首次出現疑似病例,經多種檢測方法最終確定病原為RHDV2[7-8]。2020年5月21日,我國農業農村部畜牧獸醫局發布消息稱,四川成都金堂縣2個養兔場發生兔出血癥疫情,經四川省動物疫病預防控制中心確診為兔出血癥2型。根據四川省動物疫病預防控制中心2020-2021年對兔場中RHDV2的流行病學調查顯示,2020年監測的432個規模場,場點陽性率為8.56%,而2021年監測了273個規模場,場點陽性率已經到達了39.93%,這說明RHDV2已經在四川省流行[9]。2021年初,河南省某地區一兔場出現患病家兔急性死亡病例,經鑒定也是發生了RHDV2感染,基于VP60基因的核苷酸序列測序和遺傳進化分析表明該流行株與國內首株分離株SC2020/04的相似性高達98.2%[10],由此可見RHDV2已在我國的多個省份發生了流行。

2 病原學

對兔出血癥病毒毒株的系統發育分析表明,存在3個不同的類群,從1984年起分離出基因類群G1-G5的“經典RHDV”,1996年鑒定出的抗原變體RHDVa /G6,以及2010年鑒定出的RHDV2。其中,RHDV和RHDVa是系統發育相關的,二者的致病性無差別,但是呈現出不同的抗原性和遺傳差異,目前市售的疫苗對RHDV和RHDVa具有優良的保護力[11]。然而RHDV2與RHDV/RHDVa衣売蛋白VP60的核苷酸多樣性差異超過15%,我國的RHDV疫苗無法對RHDV2提供足夠有效的保護力。

RHDV2無囊膜,病毒結構呈20面體對稱結構,病毒顆粒直徑為32～44 nm。RHDV2為單股正鏈RNA病毒,基因組全長為7 442 bp,長于經典RHDV。RHDV2與RHDV基因組結構完全相同,核苷酸一致性達82.4%,RHDV2基因組包含2個開放閱讀框,即ORF1和ORF2,其中ORF1編碼1個多聚蛋白,該多聚蛋白由病毒編碼的蛋白酶酶解成多個非結構蛋白p16、p23、p29、2C樣蛋白、3C樣蛋白、VPg、RNA依賴RNA聚合酶(RdRp)和結構蛋白VP60,ORF2編碼衣殼蛋白VP10[12]。其中RHDV2的VP60蛋白是建立該病原分子診斷方法和血清學診斷方法的主要靶標,目前已經有較多相關的研究報告[13-15]。

我國首次發生RHD2疫情的2個兔場中分離的RHDV2毒株的VP60基因核苷酸序列與荷蘭RHDV2分離株RHDV2-NL2016同源性最高,分別為98.01%和97.95%。與經典型RHDV毒株的同源性為79.0%～80.0%,親緣關系較遠[16]。

2020-2021年,李麗等[9]對四川省收集的12份陽性樣品的RHDV2 VP60基因序列進行了測序分析,發現12份陽性樣品的VP60基因序列與我國首起RHD2疫情的分離株RHDV2 SC2020-04株單獨成簇,與國內外參照毒株的VP60基因核苷酸序列同源性為93.7%～100%。通過系統發生進化樹發現,國內RHDV2分離株流行時期不同,所處的分支也不同,提示RHDV2毒株在我國很可能隨著時間和地區的改變出現新的變異現象。

3 理化特性

對于RHDV2的理化特性的研究比較有限。根據世界動物衛生組織(WOAH)公布數據顯示,RHDV/RHDVa可以在50℃下存活1 h,對反復凍融具有抗性;pH4.5～10.5時穩定,pH3.0的環境下可存活,而pH>12時病毒會失活;10 mg/mL的氫氧化鈉、10～20 mL/L的福爾馬林、酚類消毒劑(One-stroke Environ?)、5 mg/mL的次氯酸鈉都可以滅活病毒,乙醚、氯仿和胰蛋白酶處理不會影響病毒的傳染性?！蛾懮鷦游镄l生法典》中推薦使用30 mL/L的福爾馬林進行皮毛的消毒。在4℃用10～14 mg/mL甲醛或2～5 mL/L丙內酯處理可使病毒失去活性,而保留免疫原性,適用于疫苗生產。

RHDV/RHDVa病毒可能在冷藏或冷凍兔肉、動物尸體中存活數月。在4℃的組織懸浮液中可以存活7個月以上。室溫下,干燥布匹上可以存活至少3個月。22℃時,在動物尸體中可以存活20 d。60℃的組織懸浮液或者干燥狀態下的病毒,可以存活至少2 d。由于WOAH尚未公布RHDV2的理化特性數據,且RHDV2的相關研究比較有限,RHDV/RHDVa的相關數據具有一定的參考價值。

陳婉婷等[17]用PMA-RT-qPCR技術研究了不同pH、不同溫度、常用獸用消毒劑、不同濃度甲醛與RHDV2共同作用后,對病毒活性的影響(表1)。RHDV2的活性隨pH降低或升高而降低;83℃處理5 min后,病毒殺滅率可達95.10%;聚維酮碘對RHDV2殺滅作用最好,作用30 min后,病毒殺滅率達88.78%;3 mg/mL甲醛作用30 min后殺滅率可達82.22%。

表1 RHDV2在不同理化條件下的存活能力

4 流行病學

4.1 傳染源

感染了RHDV2的家兔和野兔為RHD2的主要傳染源。

4.2 易感動物

對于6～8周齡以下的動物,典型的RHDV/RHDVa通常呈亞臨床的感染,而RHDV2可以感染15日齡以上的家兔和野兔。在易感動物種類方面,除家兔外,撒丁海角兔(L.capensisvarmediterraneus)、意大利野兔(L.corsicanus)、歐洲褐兔(L.europaeus)和山地野兔(L.timidus)等品種的野兔均對RHDV2易感。

4.3 傳播途徑

通過口腔、鼻腔或結膜途徑直接接觸受感染動物,感染動物的尸體以及被污染的飼料、墊料和水等均可造成感染。野生動物和蒼蠅等昆蟲也是病毒的機械傳播媒介。在動物感染試驗中,可以通過口腔、鼻腔、皮下、肌肉或靜脈注射等途徑進行攻毒。值得注意的是,因為兔血液中的病毒在低溫保存的兔肉中可以長時間保持感染性,進口受感染的兔肉是該病跨境傳播的重要途徑。

Qi R等[18]首次報道了人工感染RHDV2的兔精液中可檢測到高濃度的病毒核酸。進一步對暴發RHD2疫情養殖場附近市場中售賣的兔凍精產品進行檢測,從10份凍精樣品中7份檢出RHDV2病毒核酸,由此推斷兔精液也是RHDV2傳播的重要途徑。

5 臨床癥狀

根據病程的不同,可以分為最急性型、急性型、亞急性型和慢性型。最急性型發病時通常沒有臨床癥狀,主要的臨床表現出現在急性感染的動物,亞急性型的特征類似于急性型但癥狀相對較溫和。根據病原體的類型,潛伏期在1～5 d之間。在出現發熱(>40℃)癥狀后12～36 h發生死亡。在此階段,可以觀察到各種臨床癥狀,例如厭食、呆滯、反應遲鈍、虛脫、神經癥狀(抽搐、共濟失調、癱瘓、角弓反張、劃水狀)、尖叫、呼吸癥狀(呼吸困難、鼻孔流出帶血的泡沫)和黏膜發紺。

在疫情暴發期間,若病原為RHDV/RHDVa則有5%～10%比例被感染動物可能表現為慢性或亞臨床癥狀,其特征為嚴重的全身性黃疸、體重減輕和嗜睡,這些動物通常會在1～2周后死亡,部分存活下來的動物會出現抗體陽轉。如果病原為RHDV2,發生慢性或亞臨床癥狀的比例要顯著增加。

與經典RHDV/RHDVa相比,RHDV2有與之相似的病變特征,即呼吸道出血和實質臟器水腫、出血、淤血。兩者的不同之處在于,RHDV/RHDVa主要引起成年家兔感染,而RHDV2的感染宿主范圍更廣,不但感染成年家兔,還會感染15～20日齡幼年家兔。此外,經典RHDV/RHDVa的死亡率可高達80%～90%,而RHDV2型的死亡率稍低,但其跨度較大(5%～70%)。表2中展示了使用我國RHDV2分離株SC20-01人工感染SPF級新西蘭白兔后,不同組織和體液中病毒的載量[18]。

表2 RHDV2感染新西蘭白兔后不同組織的病毒載量

6 剖檢病變

RHDV2感染引起的兔出血癥以實質器官出血、淤血為主要特征。肝臟呈黃棕色,質脆和變性。氣管黏膜充血,含有大量泡沫液體,肺部水腫和充血。脾臟腫大,邊緣變鈍。彌漫性血管內凝血通常是患病動物出現多種器官出血和猝死的原因。在亞急性和慢性病例中,耳朵、結膜和皮下組織明顯出現黃疸變色。

7 診斷方法

目前尚無合適的細胞系用于RHDV2的分離培養,只能采用接種試驗兔的方式進行病毒的分離、傳代和確定傳染能力。用RHDV2發病死亡兔的100 mg/mL的肝勻漿液,通過頸部皮下注射成功感染25日齡仔兔和4月齡成年兔。感染的試驗兔72 h內全部死亡,剖檢和實驗室檢測均證明上述試驗兔死于RHDV2感染[19]。用RHDV2發病死亡兔的100 mg/mL肝勻漿液,通過肌肉注射感染了5只1月齡的SPF級試驗兔,18～24 h內試驗兔也全部死亡[20]。死亡試驗兔的臨床癥狀和剖檢變化與發病兔場中的死亡病例類似,對人工感染動物進行實驗室檢測,也均為RHDV2陽性。

病原學檢測技術方面,《陸生動物診斷試驗和疫苗手冊》中推薦了RHDV的通檢方法和專門針對RHDV2的RT-PCR方法。用RT-PCR可以在多種器官、尿液、糞便或血清中檢測到病毒的RNA。其中,肝臟是病毒載量最高的器官,其次是脾臟。在慢性或亞急性感染的兔中,可能在脾臟中比肝臟中更容易檢測到病毒。針對RHDV2的VP60序列建立了多種RT-PCR檢測方法和雙重RT-PCR方法[21-23],用于對RHDV和RHDV2進行鑒別檢測。除此PCR類檢測方法外,血凝試驗、免疫電鏡、病毒捕獲ELISA、免疫染色以及Western blot也是WOAH推薦的病原檢測方法。

血清學檢測技術方法,《陸生動物診斷試驗和疫苗手冊》推薦血凝抑制試驗、間接ELISA和競爭ELISA方法應用于RHDV、RHDVa和RHDV2自然感染或者免疫抗體的測定。

中國畜牧業協會團體標準《兔病毒性出血癥2型診斷技術規程》(T/CAAA 028-2019)中規定了應用于RHDV2檢測的紅細胞凝集試驗、RT-PCR、免疫印跡等病原學診斷方法,以及紅細胞凝集抑制試驗和競爭ELISA等血清學診斷方法[24]。目前在實驗動物領域的限行標準中,只有《實驗動物 兔出血癥病毒檢測方法》GB/T 14926.21-2008中規定了RHDV/RHDVa的抗原和抗體檢測方法,尚缺乏RHDV2檢測的相關標準。

8 防控措施

我國用RHDV/RHDVa疫苗已經對RHDV感染實現了有效的控制。但是,RHDV/RHDVa疫苗對于RHDV2沒有交叉保護力[25]。目前在世界范圍內,法國和西班牙已經注冊了預防RHDV2感染的疫苗,而我國國內尚無針對RHDV2的商業化疫苗。嚴格控制動物引種,應從無RHDV2病原感染的養殖場購買活兔,加強活兔調運檢驗檢疫,嚴防病原引入。針對兔肉制品和兔凍精具有攜帶RHDV2病原進行遠距離傳播的風險,相關部門也應該加強對于這類商品的檢驗檢疫工作。加強針對RHDV2防控知識的宣傳培訓,提升廣大從業者對該病的知曉率和重視程度。還應加強養殖場生物安全防控工作,對養殖場周圍環境的蚊蟲進行殺滅,人流、物流及車流同樣需要嚴格控制,防止病毒的機械攜帶傳播[26]。根據《中華人民共和國動物防疫法》的要求,發現動物感染RHDV2或疑似感染時,應當立即向所在地農業農村主管部門或者動物疫病預防控制機構報告,并迅速采取隔離等控制措施,防止動物疫情擴散[27]。動物疫病預防控制機構也應加強對家兔RHDV2的監測力度,及時掌握我國不同區域的RHDV2的流行情況和抗原變異情況,為疫病的防控、診斷試劑和疫苗的研發提供數據支撐。RHDV2病毒在環境中的存活能力較強,一旦出現感染病例,應該用病毒敏感的消毒劑對死亡兔的尸體、污染的籠架、飼料、墊料等進行嚴格消毒和無害化處理,嚴防病毒擴散。

9 小結

RHD2作為一種高度傳染性、急性致死性疫病,嚴重危害著家兔養殖業的發展。自2020年4月RHDV2傳入我國四川省后,在僅2年的時間已經傳播至我國的多個省份,病原的傳播速度十分驚人。同時,RHDV2的宿主范圍比RHDV和RHDVa更廣,傳播途徑多,在自然環境下抵抗力強,使得該病毒難以被消滅。而當前缺乏沒有商品化的疫苗和診斷試劑對于該病的防控極為不利。因此,相關部門應提高RHDV2防控的重視程度,加大宣傳培訓力度,加強科技力量投入,破解RHD2防控的關鍵技術瓶頸,有效降低RHDV2對養兔業的危害。