馬屬動物富血小板血漿制備方法

彭 聰,李 靖,湯小朋,朱怡平

(中國農業大學動物醫學院,北京 100193)

富血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)于20世紀70年代人類醫學領域提出,常用于整形外科、小兒外科、心臟外科、婦科、眼科等[1]。在獸醫學上PRP最初應用于馬運動醫學領域,用于治療馬運動疾病如韌帶、肌腱損傷等,后來也逐漸外用于治療馬關節炎、促進創傷愈合等,近年來還有關于宮內灌注PRP治療馬屬動物子宮內膜炎的報道[2]。

PRP促進損傷愈合的機制比較復雜,在體外研究中PRP能促進生物活性因子的合成和代謝,如促進生長因子(growth factor,GF)、轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、抗炎因子、白介素-1(interleukin-1,IL-1)受體拮抗劑的釋放[3],控制炎性反應。在體內研究中,PRP可提高損傷部位修復效率和修復質量,如在肌腱損傷修復中,PRP治療后可使組織生物化學特性改善,膠原蛋白、糖胺聚糖等含量增加,加速損傷修復[4]。在骨關節疾病和骨折愈合相關研究中,PRP治療組馬匹表現出良好臨床恢復效果[5-6],這說明PRP可能是一種有效的骨或關節損傷治療手段。

馬PRP最佳治療濃度尚無定論,人醫中PRP推薦血小板濃度為全血的2～6倍[7]。在馬損傷修復應用中,PRP最佳治療濃度、細胞組成和體積取決于患馬生理狀況、疾病類型和損傷部位等因素,這為PRP制備提出了更高要求。當用于治療馬肌腱損傷或關節疾病時,大約需要向損傷部位或關節內注射2～5 mL的PRP;當采用子宮灌洗PRP治療子宮內膜炎時,需要10～60 mL才能覆蓋整個子宮內膜表面[8]。盡管目前已有大量馬屬動物PRP的相關研究,但對治療不同損傷組織的最佳PRP治療濃度和細胞組成尚未達成共識。

在歐美等發達國家和地區,PRP已成為馬屬動物運動損傷治療的一種常用手段。美國72.5%的受訪馬獸醫曾使用過PRP治療馬關節疾病[9]。我國由于對PRP原理及其制備方法缺乏報道,該療法尚未得到廣泛應用。本文根據現有文獻回顧了馬屬動物PRP的幾種制備方法及影響因素,旨在為探索馬屬動物PRP最佳制備方案提供一定參考。

1 PRP制備方法

1.1 商品化制備方法

商品化制備方法是指使用全自動細胞分離器或商品化試劑盒制備PRP,均是基于離心技術輔以傳感器、光吸收等配件實現PRP的自動分離,最初是根據人類血液特性設計的參數和程序,現也用于馬屬動物PRP的制備。但馬屬動物和人類血液學特性不盡相同,其制備效率及對PRP活性影響還需進一步探究。近十年內,大量研究使用試劑盒制備馬PRP并進行疾病治療效果評估,但尚無研究采用全自動分離系統制備馬PRP[2]。

相較于全自動分離系統,商品化試劑盒更為經濟和實用。PRP制備試劑盒根據血小板富集指數(PRP血小板濃度與全血中血小板濃度比值)可分為高富集試劑盒(5～9倍)和低富集試劑盒(2.5～3倍)。高富集試劑盒包括Biomet GPS Ⅱ、Biomet GPS Ⅲ、Harvest smartPRep 2 APC+、Arterio cyte-medtronic magellan等,低富集試劑盒包括Arthrex ACP、Cascade PPR therapy、PRGF by boitech institute vitoria等[1]。還有一種馬專用且無需離心的試劑盒——E-PETTM依靠重力富集血小板。E-PET在富集血小板、PDGF、TGF-β1方面效果更好[10]。商品化PRP制備方法具有污染小、自動化等優勢,但昂貴的儀器或試劑盒使其在臨床應用中受到限制。

1.2 實驗室制備方法

實驗室制備方法具有成本低、PRP組成和濃度可控等特點,是商品化制備法的有效替代。其基本原理是利用離心技術將血液中的不同成分進行分離。在離心操作之前,需要采集馬屬動物全血。一般通過頸靜脈穿刺并采用預置有抗凝劑的標準試管或血袋收集全血,采血量根據用途不同而有所差異。制備方法根據離心方案不同,可分為單次分離法、雙次離心法、白膜法、懸浮法、凍干法等。

1.2.1 單次分離法 實施單次離心法時,采血后需在室溫下盡快進行離心。得到上層血漿的頂部為貧血小板血漿(platelet-poor plasma,PPP),上層血漿其余部分為PRP。單次離心法具有耗時短、操作簡單、細菌污染少等優勢,但由于僅離心一次,可能存在富集指數低、血細胞污染嚴重等缺點[8]。目前尚無公認的最佳單次離心方案,一般在制定離心方案時,轉速和持續時間成負相關。不同研究結果表明,以120 r/min 10 min和1 200 r/min 3 min處理全血得到的PRP中血小板濃度接近[8-11]。

1.2.2 雙次離心法 采血后第1次離心用較小離心力處理全血,將含有血小板的上清血漿轉移到無菌離心管中,再以更大離心力得到血小板濃縮物。血小板濃縮物下1/3為PRP,用移液槍除去上2/3的PPP即可得到PRP[12]。該方法具有血小板回收率高、受白細胞(white blood cell,WBC)和紅細胞(red blood cell,RBC)污染較少等優勢,但需人工轉移血漿,會增加潛在細菌污染風險,因此需注意無菌操作。此外,第2次離心時離心參數設置也是獲得高質量PRP的關鍵所在。有研究比較了雙次離心法和單次離心法,認為兩種方法均可富集血小板(1.8～5.6倍)并減少WBC和RBC殘留,但前者血小板濃度是后者2.2倍[8]。

1.2.3 白膜法 全血在離心前可儲存于20℃～24℃。離心時采用高轉速(通常>1 000 r/min)將全血分為3層:底層是RBC,中間層(即白膜)是WBC和血小板,頂層是PPP,移除頂層上清液,將白膜轉移到無菌離心管中,使用低速離心或過濾器分離WBC后即可得到PRP[13]。白膜法和雙次離心法在離心順序和離心力方面存在差異。在保護血小板活性方面,白膜法離心時RBC可為血小板提供生理緩沖,減少血小板的早期激活,得到的PRP可能活性更佳[14]。有證據表明,白膜法制備的PRP中血細胞污染風險更高,采用白膜法從犬血中制備的PRP與使用雙次離心法相比含有更多的WBC和RBC[15],但目前尚無這兩種方法制備馬屬動物PRP的對比研究。

1.2.4 懸浮法 首先用預置有抗凝劑的注射器采集并保存全血,將注射器包裹在鋁箔中直立放置4 h,隨后將導管連接在注射器上,把注射器直立放置并以穩定的力推動注射器活塞,得到PPP和PRP[12]。在本方法中,PPP和PRP無肉眼可見的分界線,因此需要人為判斷富血小板血漿分界位置,一般認為上1/6為PPP[8]。懸浮法僅依靠重力來分離PRP,其主要優勢是操作方便、設備簡單,但耗時長、極易受WBC和RBC污染。WBC和RBC在儲存過程中會產生代謝產物,降低血小板活性,因此懸浮法制備的PRP不適合長時間保存[8]。

1.2.5 凍干法 凍干法是在已制備得到的PRP基礎上,將其放入-80℃冷凍,再放入凍干機干燥升華,具體參數視儀器而定,最終得到固體粉末狀PRP。凍干PRP目前常用于促進傷口愈合和治療關節疾病[16]。液態PRP需要現場制備,否則全血中血小板活性會降低。液態PRP難以長時間保存,而凍干PRP具有易于保存和便于使用的優勢,為預先制備、長期儲存、隨時使用提供了有利條件。同時,制備異體PRP也依賴于凍干技術。有證據表明,冷凍干燥不僅不會降低PRP中生長因子活性[17],還能破壞血小板膜表面免疫球蛋白和抗原結構,減少免疫排異反應[18]。另外,異體PRP可為血小板功能異?；蛉狈Φ幕疾●R匹提供可行的PRP治療方案。

2 PRP制備的影響因素

在制備或儲備PRP過程中,若操作不當會造成血小板不可逆性激活,從而失去活性。WBC、RBC、活化凝血因子、細胞碎片和蛋白水解酶污染以及不當離心都可能導致PRP活性及濃度下降,因此如何選擇合適制備方案和參數顯得尤為重要。在PRP制備過程中,影響血小板活性和濃度的因素眾多,包括離心參數、抗凝劑選擇、供血馬匹生理狀況、無菌操作技術等。

2.1 離心方案

合理的離心方案是在實驗室制備中能否獲得合格血小板濃度的關鍵,大多數PRP制備過程涉及兩次離心用于分離和濃縮血小板,其主要影響因素是轉速和離心時間。一般來說,轉速無論大小,都能獲得理想的血小板濃度,當轉速較大時,離心時間應相應縮短;當轉速較小時,離心時間需要適當延長。但轉速過大會導致血小板破裂、活性下降[19]。離心次數也會影響血小板、WBC和RBC含量。第2次離心可以達到再次富集血小板的目的,提高血小板含量[8],還能減少PRP中WBC、RBC殘留[20],但再次離心的過程會增加來自操作人員、環境的污染風險。最常用制備方案仍為雙次離心法,根據目前已有制備方案,第1次低速離心的轉速通常為120～400 r/min,第2次離心的轉速通常為300～1 000 r/min,一般來說第2次轉速更高,離心時間可適當延長[8-11]。截至目前,在馬屬動物PRP相關研究中對最佳離心方案未達成一致,盡管有較多研究涉及PRP制備,但未有研究系統性比較不同離心方案的優劣,仍需更多研究進一步探索。

2.2 抗凝劑

為得到液態PRP,采集血液時需在全血中加入抗凝劑。不建議使用乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid,EDTA)制備PRP,因其可能會損傷血小板細胞膜并抑制血小板脫顆粒,導致活力下降。目前已報道可用于馬屬動物PRP制備的抗凝劑有檸檬酸鈉(sodium citrate,SC)、枸櫞酸、腺嘌呤、枸櫞酸鈉、磷酸二氫鈉和葡萄糖溶液(CPD-A)、檸檬酸葡萄糖溶液A溶液和B溶液(ACD-A、ACD-B)[2]。ACD-A能將血小板pH保持在最佳值7.2左右,且檸檬酸鹽能與鈣結合,防止凝血級聯反應[22],ACD-A與全血比例為1∶7～1∶9。與ACD作用效果相似,CPD-A與全血的比例為1∶7,但其維持代謝的成分較少,在維持血小板活力方面較弱[22]。ACD-A是商品化試劑盒中最常用抗凝劑,含有檸檬酸鹽的抗凝劑會降低PRP的血管再生作用且對局部組織有毒性作用[23],說明SC、ACD-A、ACD-B不適合用于PRP制備,CPD-A可能是用于制備PRP的較優選擇。

2.3 無菌操作技術

細菌污染不僅會產生大量細菌代謝物質導致血小板活性下降,還可能會引起治療部位感染,因此在制備過程中尤其在使用非商品化制備方法時,需嚴格遵守無菌操作原則。PRP制備過程中細菌污染主要來自馬屬動物靜脈穿刺部位皮膚表面、采血人員手部、上呼吸道以及環境。為了防止PRP產品被細菌污染,建議操作人員進行適當手部消毒并佩戴無菌外科手套,對靜脈穿刺部位可采用聚維酮碘或碘酊與酒精的組合進行消毒。若條件允許,最好在清潔無氣流環境下或超凈工作臺內進行制備[2]。

2.4 供血馬生理狀況

供血馬品種、性別、年齡均會影響PRP中血小板濃度。雌性5歲以下馬匹血液制得的PRP中血小板含量更高,不同品種馬采用相同制備方案得到的PRP中血小板濃度也不同,這可能與不同品種馬血小板及WBC大小和重量不同有關[24]。

3 展望

盡管國外諸多文獻闡述了馬屬動物PRP制備方案,但國內依然缺乏關于馬屬動物PRP組成、激活、活性測定和應用方法等信息的介紹,極大限制了馬屬動物PRP制備體系建立和標準化研究。除此之外,特定濃度或組成的馬屬動物PRP在不同疾病或組織損傷中治療效果也亟待研究,以便建立不同疾病的PRP最佳制備方法及治療方案。同時,馬屬動物PRP研究存在較大異質性,如全血中血小板濃度、全血體積、疾病嚴重情況等難以統一,影響對PRP質量及治療效果的評估。馬屬動物PRP制備方案仍有諸多因素有待統一,制備方案的標準化不僅有利于促進PRP在馬屬動物臨床疾病治療中的應用,也有利于提高PRP相關研究結論的可靠性與一致性。