新疆外來入侵雜草豚草屬LAMP快速檢測技術的建立

于海鑫, 付開赟, 丁新華, 賈尊尊, 吐爾遜·阿合買提, 王 蘭*, 郭文超*

1塔里木大學農學院,新疆 阿拉爾 843300; 2新疆農業科學院植物保護研究所/農業農村部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室,新疆 烏魯木齊 830091

豚草屬AmbrosiaL.系菊科向日葵族,起源于美國西南部和墨西哥北部的索諾蘭沙漠地區(曾珂等,2010),共有41個種,其中入侵至中國的菊科豚草屬植物為三裂葉豚草AmbrosiatrifidaL.和豚草AmbrosiaartemisiifoliaL.,這2種雜草是入侵性惡性雜草,也是世界上公認的有害植物,素有“植物殺手”之稱(萬方浩等,2005)。20世紀50年代傳入我國(李素德等,1990),隨后沿交通線四處蔓延,目前在黑龍江、遼寧、北京等多地均有發現(梁巧玲和路平,2014)。2010年,在新疆伊犁河谷首次發現豚草和三裂葉豚草,至2013年,兩者其在當地的分布面積分別達到10和15 hm2(董合干和宋占麗,2017)。

三裂葉豚草和豚草因繁殖力強、擴散速度快、競爭力強,在生長過程中極易排斥其他植物,形成優勢群落,給新疆農牧業的健康發展造成嚴重危害。它們入侵草原,引起草原退化,造成草地服務能力下降(梁巧玲和路平,2014);花粉對人類健康也有危害(王蕊等,2012; 謝俊芳等,2011),嚴重者可致人過敏甚至死亡(馬麗娟等,2020)。三裂葉豚草形態多變,除正常的3～5掌狀深裂葉類型外,還有葉不裂型、深齒型和全裂葉型3種變型,從而造成識別困難(關廣清,1990)。豚草在開花前常與大籽蒿ArtemisiasieversianaEhrhart ex Willd. 、野艾蒿ArtemisialavandulifoliaDC.、小花鬼針草BidensparvifloraWilld.等相混淆(關廣清,1985)。三裂葉豚草和豚草在種子期、幼苗期形態特征極為相似,難以辨識,故建立快速檢測技術對三裂葉豚草和豚草的準確識別至關重要。

Notomietal. (2000)研發了一種新型的核酸擴增方法-環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技術,該技術針對目的片段設計4條引物(1對外引物:F3和B3,1對內引物:FIP和BIP) ,在鏈置換DNA聚合酶作用下,將目的片段在等溫條件下進行擴增,其產物是眾多大小不一的DNA片段的混合物。Nagamineetal.(2002)開發出額外的一對引物,稱之為環引物(LF和LB),能夠提高LAMP反應的效率。與常規的聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)檢測相比,該技術具有操作簡便、特異性高、靈敏度高、結果易于觀察判斷等優勢,也因此備受關注(董文敏等,2020)。在植物病原物與入侵害蟲檢測中,已有很多應用該技術的報道,如麥根腐平臍蠕孢BipolarissorokinianaShoem(崔林開等,2022)、蘋果輪紋病菌Botryosphaeriadothidea(Moug)(汪少麗等,2020)、油菜黑脛病菌Leptosphaeriabiglobosa(杜然,2019)、茶黃硬薊馬ScirtothripsdorsalisHood (黃麗莉等,2021)、瓜實蠅BactroceracucurbitaeCoquillett(鐘勇等,2019)、根結線蟲Meloidogynespp.(吳文濤等,2019)等,但目前有關該技術在植物檢測上的研究報道還較少。

鑒于此,本研究擬利用三裂葉豚草和豚草特異性序列設計一套LAMP引物,并對反應條件和反應體系進行優化,以建立三裂葉豚草和豚草的快速檢測技術,以期實現田間快速精準識別三裂葉豚草和豚草并阻止其擴散。

1 材料與方法

1.1 供試材料

主要實驗材料:三裂葉豚草采自新疆維吾爾自治區哈薩克自治州新源縣鐵熱克阿吾孜村(83°37′50.40″E,43°52′15.40″N,海拔817.9 m),豚草采自新疆維吾爾自治區哈薩克自治州新源縣109鄉道(83°21′77.91″E,43°43′67.70″N,海拔 874.7 m)。對照材料艾草ArtemisiaargyiH.采自新疆維吾爾自治區烏魯木齊市新疆農業科學院綜合試驗場(87°48′31.73″E, 43°95′78.83″N,海拔 874.7 m)。

主要實驗試劑:DNA裂解液購自寶日醫生物技術(北京)有限公司,Bst II DNA polymerase 8 U·μL-1Glycerol-free、10×Bst Buffer(含8 mmol·L-1MgSO4)、dNTP Mix(10 mmol·L-1each)和核酸染料 SYBR Green I均購自上海翊圣生物科技有限公司等。

1.2 基因組 DNA 的提取

使用TaKaRa的DNAiso Reagent提取試劑,實驗步驟參考試劑說明(https:∥www.takarabiomed.com.cn/)。

1.3 LAMP引物設計與合成

在Bold Systems v4網站(http:∥www.boldsystems.org/index.php/Public_SearchTerms)上獲得三裂葉豚草和豚草的基因序列。其中,三裂葉豚草GenBank:rbcLa:491;豚草GenBank:MH517698。選用NEBLAMP (https:∥lamp.neb.com/#!/)在線設計引物,設計3套引物同時選取其中1套進行引物合成,引物信息見表1。序列在金斯瑞生物科技有限公司進行合成。

表1 用于LAMP檢測的引物信息

1.4 LAMP反應體系

LAMP反應體系:2.5 μL 10×Bst Buffer(含8 mmol·L-1MgSO4),3.5 μL dNTP Mix(10 mmol·L-1each),1 μL BstⅡDNA polymerase,8 U·μL-1Glycerol-free,2.5 μL 10×Primers (10 μmol·L-1GF-FIP和GF-BIP各4 μL,2 μmol·L-1GF-F3和GF-B3各0.5 μL,4 μmol·L-1Loop F/B each各1 μL,ddH2O 14 μL)和1 μL 模板DNA,最后加入滅菌超純水至25 μL。上述試劑混均勻后,放置于恒溫55～65 ℃水浴鍋中反應60 min,80 ℃滅活5 min,篩選出最佳反應時間。

1.5 LAMP特異性檢測

針對三裂葉豚草和豚草的不同發育階段(幼苗期、生長期、種子期),通過提取基因組DNA,進行擴增反應。使用焦磷酸酶沉淀-比濁法,開展LAMP檢測技術的開發。以清水和艾草為對照,如產生沉淀則為陽性,如未產生沉淀則為陰性(林瑤等,2014)。

1.6 LAMP靈敏度檢測

選用特異性檢測結果最穩定的葉片作為靈敏度檢測對象。提取濃度為127.5 ng·μL-1,然后用無菌水進行10倍梯度稀釋,使其終濃度分別為100、10、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11ng·μL-1,最終使用不同濃度作為模板進行LAMP反應,以ddH2O為空白對照。反應結束后加入1 μL核酸染料SYBR Green I,若其結果為陽性,則為明顯的綠色熒光,而陰性結果則為橙色,并以此檢測LAMP技術的靈敏度。

2 結果與分析

2.1 LAMP反應體系的建立

LAMP引物最佳反應溫度為65 ℃。用于檢測三裂葉豚草和豚草的LAMP最佳反應體系: 2.5 μL 10×Bst Buffer(含8 mmol·L-1MgSO4),3.5 μL dNTP Mix(10 mmol·L-1each),1 μL BstⅡDNA polymerase,8 U·μL-1Glycerol-free,2.5 μL 10×Primers (16 μmol·L-1GF-FIP和GF-BIP各4 μL,2 μmol·L-1GF-F3和GF-B3各0.5 μL, 4 μmol·L-1Loop F/B each各1 μL,ddH2O 14 μL)和1 μL 模板DNA,最后滅菌超純水補足25 μL。反應程序:在65 ℃恒溫水浴鍋中溫育1 h,80 ℃變性5 min,使Bst DNA 聚合酶失活。最后加入核酸染料SYBR Green I,結果出現明顯的綠色熒光為陽性,出現橙色則為陰性。

2.2 三裂葉豚草和豚草LAMP特異性檢測

使用本研究設計的三裂葉豚草LAMP引物Atr-1 (GF-FIP、GF-BIP、GF-F3、GF-B3、GF-LB、GF-LF),以豚草和艾草對照,對三裂葉豚草幼苗期、生長期、種子期進行LAMP擴增,結果(圖1)顯示,只有三裂葉豚草產生白色沉淀,有陽性反應,豚草和艾草對照均無產生白色沉淀,為陰性反應。

圖1 三裂葉豚草LAMP特異性檢測

使用本研究設計的豚草LAMP引物Aar-1 (GF-FIP、GF-BIP、GF-F3、GF-B3、GF-LB、GF-LF),以三裂葉豚草和艾草為對照,對豚草幼苗期、生長期、種子期進行LAMP擴增,結果(圖2)顯示,只有豚草產生白色沉淀,有陽性反應,三裂葉豚草、艾草對照均無產生白色沉淀,為陰性反應。以上結果說明,該LAMP引物具有較強的特異性。

圖2 豚草LAMP特異性檢測

2.3 三裂葉豚草LAMP靈敏度檢測

因三裂葉豚草和豚草基因組DNA提取方法與靈敏度檢測方法一樣,故本研究只進行三裂葉豚草實驗驗證。提取三裂葉豚草基因組DNA,紫外分光光度計測量提取的基因組DNA濃度為127.5 ng·μL-1,將DNA濃度調整為100 ng·μL-1,進行10倍梯度稀釋為模板進行LAMP擴增,驗證LAMP體系的靈敏度。從LAMP反應結果(圖3) 可以看出,DNA濃度為10-10ng·μL-1以下的實驗組反應液呈淺橘色,DNA濃度為10-10ng·μL-1及以上的實驗組反應液顏色為熒光綠,表明LAMP引物最低限度為10-10ng·μL-1。

圖3 三裂葉豚草LAMP靈敏度檢測

3 討論與結論

LAMP檢測方法具有操作快速簡便、特異性強、靈敏度高、檢測成本低等優點,該技術已廣泛運用于植保等領域。國外學者最初通過LAMP檢測番茄花葉病毒病(Shiroetal.,2003);彭軍等(2013)建立的柑桔黃龍病LAMP技術可以檢測到最低下限約為1 pg·μL-1質粒DNA,是PCR檢測靈敏度的100倍;王賢達等(2014)利用LAMP技術檢測柑橘黃龍病病原菌,檢測靈敏度達10-6ng·μL-1,是普通PCR的1000倍,為柑橘黃龍病早期診斷提供了快速檢測的方法;鐘勇等(2019)建立的瓜實蠅快速可視化分子檢測方法可檢測到1.65 ng·μL-1的DNA模板,能夠將瓜實蠅與其近似種進行區分。

本研究通過三裂葉豚草和豚草的DNA序列區間設計了3組引物,并從中篩選獲得1組引物,通過優化反應體系的溫度以及時間,建立了高效檢測三裂葉豚草和豚草的LAMP技術體系。通過對前期優化后的反應體系與反應條件進行驗證,該LAMP體系僅對三裂葉豚草和豚草的特異性檢測結果呈陽性,且靈敏度結果中最低檢測限為10-10ng·μL-1,優于常規PCR的檢測結果;此外,LAMP快速檢測技術在反應時間方面具有較大優勢,常規PCR對目標DNA片段的檢測需要花費2～4 h,LAMP體系反應時間僅需1 h,且設備成本較低。但是本實驗所使用的商品裂解液與SYBR GreenⅠ熒光染料成本較高,對引物設計的要求比較高且LAMP產物不能進行后續實驗(秦文韜等,2013)。

盡管LAMP技術還存在一些缺點和不足,但隨著LAMP技術的日益完善和發展,加上LAMP所需儀器設備價格極低、擴增快速高效、適合各種環境下的快速檢測、實用性強等優點,LAMP有望成為檢測入侵性雜草的常用工具,并將在入侵性雜草的分子檢測和診斷中發揮更大的作用。后續應開展三裂葉豚草和豚草DNA快速提取方法的建立與優化研究,并與本研究的LAMP檢測體系相結合,提高其檢測能力,從而實現檢測體系的高效、便捷,以達到從入侵種子源頭控制的目的,這不僅可以為識別鑒定外來入侵性雜草三裂葉豚草和豚草提供技術支撐,還能為三裂葉豚草和豚草的綠色防控提供參考(胡章薇等 2021; 朱志偉和趙金紅,2020)。