常見水稻病蟲害脅迫對轉cry1C基因抗蟲水稻Bt蛋白表達量的影響

王 歡, 曹征鴻, 葉恭銀, 黨 聰*

1上海農林職業技術學院, 上海 201699; 2浙江大學昆蟲科學研究所, 水稻生物學國家重點實驗室/農業農村部作物病蟲分子生物學重點實驗室/浙江省作物病蟲生物學重點實驗室, 浙江 杭州 310058; 3鷹潭市林業局, 江西 鷹潭 335001

我國是世界上第一大水稻OryzasativaL.生產國,面對日趨嚴重的糧食危機,水稻的綠色高產穩產對于我國糧食安全至關重要(FAOetal.,2022)。近年來,由于蟲源基數、種植制度、作物布局、氣候變化、害蟲抗藥性等因素,我國水稻病蟲害發生呈上升趨勢。轉Bt(Bacillusthuringiensis)基因抗蟲水稻(簡稱Bt水稻)為水稻害蟲防治提供了新的途徑(https:∥www.natesc.org.cn/)。我國在轉基因抗蟲水稻研究方面處于領先地位,目前已經有一系列的Bt水稻相繼問世(Lietal.,2016)。其中“華恢1號”水稻(轉cry1Ab/cry1Ac基因)已經先后2次拿到我國生物安全證書,并且通過了美國食品和藥品管理局的安全性評價咨詢,標志著Bt水稻商業化種植又邁出了重要的一步(https:∥www.accessdata.fda.gov/scripts/fdcc/?set=Biocon)。Bt水稻抗蟲效果評價是商業化種植的基礎,也是支撐Bt水稻在病蟲害綜合治理中重要性的科學依據。

轉Bt基因植物的抗蟲效果主要來源于其體內表達的Bt殺蟲蛋白,這類蛋白進入昆蟲腸道后經蛋白酶水解成小肽,結合到中腸上皮細胞膜的特異性受體上,使細胞通透性發生變化,進而引起害蟲死亡(Schnepfetal.,1998)。然而,多種因素可能影響Bt蛋白的表達,進而影響其抗蟲效果。Bt蛋白含量在轉基因植物的不同生長季節及不同組織中有所不同,張益文等(2012)發現Cry1Ac蛋白含量在抗蟲棉生長過程中均呈動態下降趨勢,而根中下降的速率最快,莖和葉片次之。非生物脅迫因素也可能影響Bt蛋白的表達水平:姜周庚等(2012)的研究結果表明,高溫脅迫會顯著降低抗蟲棉鈴殼中Bt蛋白表達量,且隨著溫度水平的提高,下降的幅度也更大;張祥等(2017)發現干旱脅迫下,供試抗蟲棉鈴殼中殺蟲蛋白質含量下降;低溫、高鹽等非生物脅迫因子均會顯著影響轉Bt基因抗蟲棉及抗蟲玉米中Bt蛋白的表達水平(常麗娟等,2020; Trtikovaetal.,2015)。

目前,關于生物脅迫因子(病害、蟲害侵染等)對轉Bt基因作物中Bt蛋白表達的影響研究較少。本試驗以Bt水稻T1C-19 (表達Cry1C蛋白)為研究對象,探究水稻6種常見病蟲害脅迫下其體內Bt蛋白的表達量變化,以期為Bt水稻的抗蟲效果評價提供數據基礎,也為Bt水稻病蟲害綜合治理提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 供試水稻

試驗所用Bt水稻品系為T1C-19,是采用農桿菌介導法獲得的表達cry1C基因的轉基因水稻。轉入的cry1C基因是以蘇云金芽孢桿菌的野生型cry1Ca5基因為模板,通過去除一些影響其在植物細胞表達的序列,并且根據植物中的密碼子偏好性來優化設計的,由玉米ZeamaysL. 的ubiquitin啟動子驅動,T1C-19在田間和室內條件下對鱗翅目水稻害蟲二化螟Chilosuppressalis(Walker)、稻縱卷葉螟CnaphalocrocismedinalisGuenée等都表現高抗(Tangetal.,2006)。對照是非轉基因親本明恢63 (MH63)。所有供試水稻采用木村營養液室內培養(Yoshidaetal.,1976)。

1.2 供試昆蟲

試驗所用的褐飛虱NilaparvatalugensStál、黑尾葉蟬NephotettixcincticepsUhler和二化螟均采自于浙江大學農場,采回后在人工氣候室內分別于感蟲水稻品種TN1(Taichung Native 1,國際標準水稻鑒定品種)上連續飼養多代。室內飼養條件:溫度(28±1) ℃,光周期(明∶暗)14∶10,相對濕度(60±5)%,光照度3500～4000 lx。

1.3 供試病害

試驗所用的稻瘟病菌PyriculariagriseaCavara為野生型Guy11,培養基為CM培養基。所用的白葉枯病菌Xanthomonasoryzaepv.oryzaeIshiyama為PXO99小種,培養基為NA培養基。水稻普通矮縮病毒(Ricedwarfvirus, RDV)由黑尾葉蟬傳播。所用菌種與80%甘油按照1∶1混合后保存于-70 ℃冰箱,使用之前在相應平板上分別進行劃線活化。

1.4 蟲害脅迫試驗

取1株苗齡40 d左右的T1C-19和MH63稻株于自制養蟲籠(高36 cm,直徑10 cm,由2個保鮮盒組成,將根莖分開)中,每籠接入饑餓處理6 h的褐飛虱(或黑尾葉蟬)3～4齡若蟲10頭,待褐飛虱(或黑尾葉蟬)取食3 d之后,分別對每株水稻的葉片和葉鞘進行取樣,保存于-70 ℃冰箱用于后續Bt蛋白含量檢測。同樣,取1株苗齡40 d左右的T1C-19和MH63稻株于自制養蟲籠中,每籠接入饑餓處理6 h的二化螟2～3齡幼蟲10頭,待二化螟取食3 d后,取出水稻葉鞘中的二化螟幼蟲,分別取每株水稻的葉片和葉鞘進行檢測。以未接蟲的水稻作為對照,每個處理5個重復。

1.5 病害脅迫試驗

將稻瘟病菌株Guy11的孢子制成約每毫升105個的孢子懸浮液,參考劉同寶(2008)的方法,取10 mL孢子懸浮液用噴霧器噴灑到1株水稻植株上。噴霧完后,用黑色塑料袋將接種的水稻套住密封避光培養36 h,其間多次噴水加濕。36 h后去除塑料袋,正常培養。5 d后,接病的植株葉片逐漸出現小病斑,2周后病斑明顯,出現典型的梭形病斑,取其中癥狀明顯的水稻葉片及葉鞘用于Bt蛋白含量檢測,以未接菌的水稻作為對照,每個處理5個重復。

將白葉枯病菌PXO99菌液配成光密度0.8～1.0的細菌懸浮液,參考儲昭暉(2006)的方法,用剪刀沾菌液后,剪水稻上部健康葉片葉尖1～2 cm,每沾一次菌液剪1～2片葉,每株剪5～6片葉。接種完后,放置在溫室中培養10 d左右,水稻葉片剪葉周圍呈枯白色,15～20 d癥狀明顯,部分水稻葉片上部呈枯白色卷曲。取其中癥狀明顯的水稻葉片及葉鞘用于Bt蛋白含量檢測,以未接菌的水稻作為對照,每個處理5個重復。

取4～5葉期的T1C-19和MH63水稻各15株,移栽到密封接蟲瓶中,每株水稻內接一頭帶毒的黑尾葉蟬若蟲,取食3 d后,移栽到溫室中培養,4 d左右,水稻葉片中央葉脈周圍會出現一連串透明的白點,即為水稻普通矮縮病癥狀。2周后,取經過傳毒的新鮮水稻葉片0.1 g,采用TRIZOL法提取水稻葉片總RNA,并用試劑盒One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix (北京全式金生物技術有限公司)反轉錄得到cDNA,以RDV的S8片段設計引物(F:5′-ATAGCTGGCGTTACGGCTAC-3′;R:5′-AAACCGTCCACCTGACTACG-3′)進行PCR,將PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,確認水稻植株是否帶RDV病毒(王前進,2017)。取經過帶毒驗證的水稻植株的葉片及葉鞘,用于Bt蛋白含量檢測,以未傳毒的水稻為對照,每個處理5個重復。

1.6 Bt蛋白含量測定

采用酶聯免疫試劑盒(ENVIROLOGIX)測定Bt蛋白的含量,各處理中用于Bt蛋白含量測定的水稻組織為0.1 g (鮮質量)。參考Dangetal.(2021)中的操作步驟,將取樣的水稻組織液氮冷凍后,用組織研磨儀充分磨碎,加1 mL提取液振蕩提取2 h后,15000 r·min-14 ℃離心5 min,取上清液按照1∶50的體積比例稀釋后進行檢測。檢測的具體步驟參照試劑盒的說明書進行,酶標儀采用Varioskan Flash (Thermo Scientific, 美國)全波長多功能酶標儀,分別在波長450和650 nm測定相應光密度,根據標準曲線計算各樣品中Bt蛋白的含量。

1.7 數據處理和統計分析

將測得的各樣品Bt蛋白含量用Excel 2010進行數據處理,采用SPSS 20.0軟件進行統計分析,Studentt檢驗比較被病蟲害侵染的水稻與未被侵染水稻中Bt蛋白含量的差異(α=0.05)。

2 結果

2.1 水稻蟲害脅迫對Bt蛋白含量的影響

相較于未被褐飛虱取食的Bt水稻(圖1A),葉片中Bt蛋白含量在褐飛虱取食后出現顯著下降(t=-4.454,P=0.005),而葉鞘中Bt蛋白含量在褐飛虱取食后沒有出現顯著變化(t=-1.679,P=0.202)。對于另外一種刺吸式害蟲黑尾葉蟬(圖1B),取食T1C-19后葉鞘中Bt蛋白含量發生顯著下降(t=3.581,P=0.046),而葉片中Bt蛋白含量與未被取食的水稻之間沒有顯著差異(t=1.050,P=0.797)。二化螟取食T1C-19前后(圖1C),水稻葉鞘及葉片中Bt蛋白含量均沒有發生顯著變化。

圖1 褐飛虱(A)、黑尾葉蟬(B)、二化螟(C)脅迫下T1C-19水稻葉片和葉鞘中Bt蛋白含量

2.2 水稻病害脅迫對Bt蛋白含量的影響

對于水稻病害脅迫(圖2),感染稻瘟病和健康轉基因水稻T1C-19葉片和葉鞘中的Bt蛋白含量均沒有顯著差異(葉片:t=2.079,P=0.066;葉鞘:t=-0.892,P=0.398)。而白葉枯病菌侵染極顯著促進了T1C-19水稻葉鞘中Bt蛋白含量的上升(t=8.656,P=0.001),并沒有影響葉片中Bt蛋白含量(t=1.805,P=0.145)。與未感染RDV的T1C-19水稻相比,感染了RDV的水稻葉片和葉鞘中的Bt蛋白含量均沒發生顯著變化(葉片:t=1.579,P=0.165;葉鞘:t=-0.610,P=0.575)。

3 討論

轉基因作物品系培育出來之后,在自然條件下是否有預期的目標優良性狀,需要對其進行抗性效率評價。對于抗蟲作物,重點關注其對靶標害蟲的抗蟲效果。根據《農業轉基因生物安全評價指南》的規定,抗蟲轉基因植物的功能效率評價需提供在室內和田間試驗條件下,轉基因植物對靶標生物的抗性生物測定報告、靶標生物在轉基因材料及受體品種田間季節性發生危害情況和種群動態的試驗數據與結論。目前,多種因素已被發現可能影響Bt作物體內Bt蛋白的表達,進而影響其抗蟲效果。因此,開展生物因子或非生物因子對作物中Bt殺蟲蛋白含量的影響是Bt作物抗蟲效果評價的關鍵內容。

從病蟲害脅迫的結果中可發現,病蟲害脅迫因種類不同對Bt水稻中Bt蛋白表達量的影響不同。二化螟、水稻普通矮縮病、稻瘟病對轉基因水稻T1C-19葉片和葉鞘中的Bt蛋白含量影響不明顯;褐飛虱的取食會造成轉基因水稻T1C-19葉片的Bt蛋白含量明顯降低,而對葉鞘的Bt蛋白含量沒有明顯影響;黑尾葉蟬的取食會導致轉基因水稻T1C-19葉鞘的Bt蛋白含量明顯降低,而對葉片沒有明顯影響;轉基因水稻T1C-19在感染白葉枯病后葉鞘內Bt蛋白含量會明顯上升,而對葉片內Bt蛋白含量沒有顯著影響。研究表明,轉Bt基因植物的抗蟲性與其體內表達的Bt蛋白含量呈正相關,即表達量越高,抗蟲效果越好(華樺,2012)。當轉基因作物體內的Bt蛋白含量在受到外界因素影響而變化時,作物的抗蟲性也會隨之發生變化,有可能給我們農業生產帶來損失。轉基因抗蟲棉在實際生產上就有高溫氣候下不抗蟲的現象,陳源等(2014)研究發現,38 ℃以上的高溫會使抗蟲棉棉蕾中Bt蛋白表達量顯著降低,導致其抗蟲效果大幅度降低。轉基因抗蟲水稻目前還沒有在脅迫條件下不抗蟲的報道,而本研究發現,褐飛虱、黑尾葉蟬和白葉枯病均會對轉基因水稻T1C-19的Bt蛋白表達量產生影響,至于這種影響是否會導致T1C-19水稻對靶標害蟲的抗性變化,還需要進一步研究,但在今后的研究和實際生產上要對這個問題引以重視。

對于褐飛虱、黑尾葉蟬取食和白葉枯病感染導致轉基因水稻T1C-19體內Bt蛋白含量變化的原因,目前還不明確。姜周庚等(2012)研究發現,高溫脅迫下Bt棉棉鈴內Bt殺蟲蛋白含量下降時,棉鈴內可溶性蛋白含量也會下降,谷丙氨酸轉氨酶活性降低,而游離氨基酸含量、蛋白酶和肽酶活性升高,因此,轉基因抗蟲棉Bt蛋白含量在高溫脅迫下降低可能是因為高溫減少蛋白質合成,促進蛋白質降解。張祥等(2017)研究發現,水分虧缺導致棉鈴殼Bt蛋白含量下降,而在轉錄水平Bt基因表達量未下降。這說明非生物脅迫導致轉基因抗蟲棉Bt蛋白含量下降的原因可能只涉及翻譯水平的調控而不涉及轉錄水平的調控。而生物脅迫的影響可能更加復雜,因為病蟲害的侵染會誘導植物的防御反應。水稻轉錄組學和蛋白組學分析發現,褐飛虱取食水稻后植物在基因表達和蛋白質調控層面發生了復雜的生物學變化,基因表達的變化主要與氧脅迫、傷害反應和信號途徑有關(Zhangetal.,2004)。因此,病蟲害等生物脅迫引起的轉基因抗蟲水稻Bt蛋白含量變化的原因,可能不僅僅和轉基因水稻體內蛋白質合成、降解有關,還可能涉及植物防御應答引起的轉錄水平的調控。當然,對于生物和非生物因素導致轉基因作物Bt蛋白含量變化的具體機制,還需要經過進一步的研究才能確定。

在轉基因水稻和水稻害蟲互作的研究中,研究者往往關注的是轉基因水稻對害蟲的影響,而甚少關注害蟲對于轉基因水稻的影響。但是,轉基因水稻作為水稻害蟲的食物來源,不僅害蟲會因食料的變化受到影響,轉基因水稻自身的生長發育也會受到害蟲取食的影響,尤其是轉基因水稻體內與抗蟲性密切相關的Bt蛋白含量。本研究發現,轉基因水稻T1C-19體內的Bt蛋白含量會因部分病蟲的脅迫而發生變化,這可能會導致轉基因水稻的抗蟲性發生變化。在實際田間環境中,Bt水稻可能面臨的脅迫將更加復雜,這些脅迫因素都有可能影響到Bt水稻的抗蟲效果。因此,在進行Bt水稻的抗蟲性評價時,需要充分考慮到外界生物及非生物因素互作所帶來的影響。