蜂王漿主蛋白研究進展

秦凱鑫,潘露霞,王子龍*

(1. 江西農業大學蜜蜂研究所,南昌 330045; 2. 江西省蜜蜂生物學與飼養重點實驗室,南昌 330045)

蜂王漿是蜜蜂工蜂頭部咽下腺和上顎腺分泌的淡黃色漿狀物(Knecht and Kaatz, 1990)。只有蜂王和3 d內的幼蟲被飼喂蜂王漿,因此,蜂王漿被認為是影響雌性蜜蜂級型分化的主要因素(Buttstedtetal., 2014)。蜂王漿中含有60%～70%水,12.5%粗蛋白,10.16%糖,3%～6%脂類,2%～3%維生素、鹽和游離氨基酸等(Albertetal., 1999)。其中,王漿主蛋白是蜂王漿中水溶性蛋白,為蜂王漿中蛋白質的主要成分,占總蛋白含量的46%～89%(Schmitzovetal., 1998)。MRJPs家族一共有9個成員,依次命名為MRJP1～MRJP9。本文主要對近幾年王漿主蛋白的研究進展進行綜述,為今后開展相關研究提供幫助。

1 MRJPs家族鑒定

對蜂王漿中蛋白的研究始于1960年,Patel等人通過電泳分析蜂王漿中的蛋白質,其目的是為了研究幼蟲食物中蛋白質與接受食物時幼蟲的年齡和級型分化之間的關系,結果顯示,與1～3齡幼蟲相比,工蜂和雄蜂第4～6齡幼蟲食物缺少水溶性蛋白質(Pateletal., 1960)。由于最初人們是通過分子量或者發現順序對蜂王漿中蛋白質命名的,這就導致相同的蛋白質卻有不同的名字(Kuboetal., 1996; Scarsellietal., 2005)。1992年,imuith等人首次發現蜂王漿中分子量為57 kDa的蛋白質,該蛋白在蜂王漿中最為豐富,被命名為“MRJP”,后被命名為MRJP1(Hanes andimuith, 1992)。MRJP2～5是通過其cDNA的克隆測序鑒定的(Klaudinyetal., 1994; Schmitzovetal., 1998; Albertetal., 1999),而MRJP6～8是通過蜜蜂腦表達序列標簽(EST)文庫進行同源搜索而檢測到的(Albert and Klaudiny, 2004)。之后人們將蜜蜂咽下腺和毒囊進行蛋白質組學分析,發現一個蛋白水解片段,通過克隆測序證實是MRJP9(Albert and Klaudiny, 2007)。9個mrjps編碼基因均在蜜蜂11號染色體上(Honeybee Genome Sequencing Consortium, 2006),所有mrjps以串聯排列的形式位于一個大約60 kb的DNA片段上(Drapeauetal., 2006),各成員之間的核酸序列和氨基酸序列均具有較高的相似性(Helbingetal., 2017)。mrjp基因簇兩側是編碼YELLOW家族蛋白的5個基因,基因組區除了 9個轉錄的mrjps外,中間還有1個非轉錄的偽基因mrjp-ψ(Drapeauetal., 2006)。

2 MRJPs家族蛋白質結構

成熟的MRJPs由400～578個氨基酸組成,其分子量在45～68 kDa之間(Buttstedtetal., 2014)。MRJP1～5富含10種必須氨基酸,且MRJP1～5是蜂王漿中最為豐富的蛋白質,占90%,說明MRJP1～5具有營養作用(Schmitzovetal., 1998)。MRJPs家族各成員N端含有信號肽序列,因此被認為是分泌蛋白(Klaudinyetal., 1994)。所有成員共享4個保守半胱氨酸殘基和幾個高度保守氨基酸區域,半胱氨酸殘基會形成二硫鍵(Buttstedtetal., 2014)。MRJPs剛合成時pH值為7.0,在飼喂幼蟲之前,工蜂會將其與上顎腺分泌的脂肪酸混合,使得蜂王漿pH值為4.0,MRJPs在酸性pH值中更穩定,pH值為4.0～4.5時穩定性最高(Murean and Buttstedt, 2019)。

MRJPs中具有重復區域。Su等人研究發現,MRJP2的C端具有9個五肽重復區域(Suetal., 2005)。MRJP3在編碼區C端具有可變串聯重復序列(VNTR)區域,該區域被認為是導致蛋白質多態性的位點(tefanetal., 1999)。MRJP5在367和540氨基酸殘基之間具有廣泛重復區域,重復三肽基序共出現58次,其中MRJP3和MRJP5的兩個重復區域共同特征是帶正電的精氨酸/賴氨酸殘基和帶負電的天冬氨酸殘基有規律的出現(Albertetal., 1999)。由于MRJPs的重復區域中含有大量的富含氮的氨基酸,這顯著增加MRJPs中氮含量,因此重復區域也被認為是生物加工形式儲存氮的結構域(tefanetal., 1999)。

Klaudiny等人認為MRJP3和MRJP4存在潛在的N端糖基化和磷酸化位點,并首次提出MRJPs可能具有翻譯后修飾(Klaudinyetal., 1994)。Zhang等人通過雙向凝膠電泳(2-DE)、鳥槍法分析、高效液相色譜-電噴霧四極桿飛行時間串聯質譜和生物信息學相結合的方法對蜂王漿的翻譯后修飾進行分析,檢測到MRJP1和MRJP2具有磷酸化位點,并且MRJP1～5還存在甲基化或脫酰胺化(Zhangetal., 2012)。此外,MRJP1和MRJP2都被檢測出具有糖基化位點(Bílikovetal., 2009; Kimuraetal., 2010)。如今,MRJP1～9被檢測出具有11～35個磷酸化和1～8個糖基化位點(Buttstedtetal., 2014)。如此多的數據證明MRJPs具有翻譯后修飾,形成許多MRJP的異構體。

MRJP1的二級結構含有9.6%的α螺旋,38.3%的β折疊和20%的β轉角,并且是一種高度穩定的蛋白質(Cruzetal., 2011)。Watanabe等人將MRJP1溶解于磷酸鹽緩沖生理鹽水中,在不同溫度中加熱30 min,結果表明,60℃熱處理不會影響MRJP1的生長刺激活性(Watanabeetal., 1998)。但是MRJP1是一種鈣調蛋白結合蛋白(Calbriaetal., 2008),鈣離子會改變MRJP1構象,使其易受溫度和pH值的影響(Cruzetal., 2011)。MRJP1具有獨特的六葉β螺旋折疊,即MRJP1被折疊成1個六葉β螺旋槳形狀,其中具有31條β鏈和11條α螺旋,中間還有一個通道(Tianetal., 2018)。六葉結構里有3個二硫鍵,其中2個二硫鍵的半胱氨酸殘基在MRJPs家族成員中是保守的,這2個二硫鍵對結構穩定性至關重要(Tianetal., 2018)。MRJP1會與apisimin形成高濃度的長脂蛋白纖維結構(MRJP14-apisimin4-24-methylenecholesterol8),增加蜂王漿的粘度,使幼蟲不會從王臺中掉落(Buttstedtetal., 2018)。Apisimin是蜜蜂特有的一種富含絲氨酸-纈氨酸的多肽,具有形成寡聚體的傾向(Bílikovetal., 2002)。通過低溫電子顯微鏡可以觀察到這種纖維結構是由4個MRJP1組成的外殼,內部有4個apisimin,中間是8個被緊密包裹的脂質(Matteietal., 2020),分子之間通過疏水作用和氫鍵鏈接,而apisimin分子是將復合物連接在一起的關鍵橋梁(Tianetal., 2018)。這種纖維結構在pH值為4.0時,各單元之間靜電斥力降低,使其更加穩定,而另一方面是帶正電的His294與相鄰的Asp292之間可能具有靜電引力,因為Asp292在pH值為4.0時部分帶負電荷(Matteietal., 2020)。雖然對MRJP1的二級結構有一定了解,但是MRJPs家族其他成員的二級結構研究卻少之又少。

3 MRJPs在蜂產品中分布

迄今為止,許多研究者對蜜蜂的蜂王漿進行了蛋白質組學分析,所有MRJPs家族成員都能在蜂王漿中檢測出來(Schmitzovetal., 1998; Sanoetal., 2004; Santosetal., 2005; Sch?nlebenetal., 2007)。MRJPs家族各成員在蜂王漿中含量差異非常大,其中,MRJP1～5在蜂王漿中含量較多,尤其是MRJP1,其所占比例為31%(Hanesetal., 1992)。除此之外,MRJPs也可以在其他蜂產品中檢測到。Rossano等人在蜂蜜中檢測到MRJP1～3相對應的多肽(Rossanoetal., 2012)。Silva等人用非靶向LC-ESI-Triple-TOF-MS/MS鑒定甘露蜜中MRJPs,通過LC-QqQ-MS/MS對蜂蜜中MRJPs標記多肽進行定量分析,結果表明,MRJP4中標記肽(QNIDVVAR)的含量可以作為區分甘露蜜和花蜜的指標(Silvaetal., 2020)。MRJP1和MRJP2也在蜜蜂粉脾中被檢測到(Scarsellietal., 2005)。MRJP8和MRJP9在蜜蜂毒液和假定的過敏原中被鑒定出來(Blanketal., 2012)。因此,不論是蜂王漿還是其他蜂產品都可以檢測到MRJPs。

4 mrjps家族的表達

4.1 mrjps在蜜蜂體內的表達

mrjps在蜜蜂多個組織中均有表達。Dobritzsch等人通過qRT-PCR和定量質譜分析發現,工蜂咽下腺和大腦中mrjp1～5和mrjp7的表達具有年齡依賴性,即mrjps的表達在哺育蜂時期上調,而在采集蜂時期下調,并且咽下腺中的相對豐度高于大腦(Dobritzschetal., 2019)。哺育蜂的任務是飼喂幼蟲,其咽下腺mrjps表達顯著高于采集蜂,從側面證明MRJPs具有營養功能(Fengetal., 2009)。但是蜜蜂咽下腺細胞具有靈活性,隨著日齡增加,蜜蜂將不再哺育而是出門采集花粉、蜜和樹脂等,若蜂群需要,采集蜂將重新激活腺泡,合成與分泌MRJPs,哺育幼蟲(Ohashietal., 2000)。不僅僅是工蜂,mrjps在蜂王和雄蜂的頭部、胸部和腹部都有表達,其中mrjp1～7在工蜂頭部表達更為顯著(Buttstedtetal., 2013)。李曉燕等人研究表明mrjp6在蜜蜂幼蟲和蛹期時表達量較低,而三型蜂中,蜂王與工蜂的表達量顯著高于雄蜂(李曉燕等,2016)。李江紅等人發現mrjp8在工蜂毒腺組織內表達量高,而雄蜂體內表達量最低,這可能暗示mrjp8與工蜂防御有關(李江紅等,2014)。有趣的是,mrjp9表達與其他的mrjps不同,其在蜂王和工蜂的頭部、胸部、腹部表達都很高,因此MRJP9被認為是最古老的王漿主蛋白(Buttstedsetal., 2013)。

4.2 外界因素對mrjps表達的影響

mrjps及蛋白質的表達會受到外界因素影響。在食物中添加20-羥基蛻皮酮(20E)后,蜜蜂中mrjp1～3表達下調,其中mrjp3表達量最低(Winkleretal., 2018)。Fent等人將蜜蜂暴露不同的殺蟲劑中,結果顯示毒死蜱會使采集蜂大腦中mrjp2和mrjp3表達下調,吡蟲啉會使采集蜂大腦中mrjp1表達下調(Fentetal., 2020)。Scharlaken等人研究表明,蜜蜂在感染大腸桿菌8 h之后,mrjp3在頭部的表達上調,而mrjp4表達下調(Scharlakenetal., 2007)。蜜蜂幼蟲在感染類芽孢桿菌后,mrjp1～3在蜜蜂血淋巴中的表達下調(Chanetal., 2009)。多菌靈是一種殺菌劑,在多菌靈的刺激下,蜜蜂頭部中mrjp1～7和9的表達會下調(Wangetal., 2021)。因此,mrjps及蛋白質的表達受激素、殺蟲劑和細菌的影響。

5 mrjps在其他膜翅目昆蟲中同源體

除了蜜蜂之外,mrjps在其他膜翅目中也存在同源體。在寄生蜂Nasoniavitripennis中鑒定出10個與蜜蜂mrjps類似的基因,分子證據表明,這兩組基因擁有一個共同祖先(Werrenetal., 2010)。Sumner等人研究表明,mrjps在群居型黃蜂Polistescanadensis的蜂王中表達(Sumneretal., 2015)。Tian等人的研究發現,膜翅目蟻科的火蟻也會表達mrjps,并且認為這與蟻后交配或繁殖行為有關(Tianetal., 2004)。在阿根廷螞蟻Linepithemahumile中也鑒定出10個yellow和10個mrjps(Smithetal., 2011)?；蛟Smrjps在其他膜翅目昆蟲中具有重要的作用。

6 mrjps家族進化

最初,Albert等人只鑒定出5種王漿主蛋白,即MRJP1～5,并且發現MRJPs與果蠅的YELLOW有著共同的進化起源,MRJPs家族的分化可能導致該基因家族有新功能(Albertetal., 1999)。Drapeau等人不僅證實了Albert等人的研究,還認為mrjp家族是由yellow-e3進化而來(Drapeauetal., 2006)。Drapeau等人將內含子/外顯子結構進行對比,發現mrjps與yellow-e3內含子/外顯子結構高度相似,通過微陣列表達數據得出yellow-e3與mrjp功能上有共同之處(Drapeauetal., 2006)。Buttstedt等人認為mrjp9是mrjps中的始祖基因,蜜蜂高拷貝數是由一個古老基因復制而導致的,mrjp9在蜂王和工蜂的頭部、胸部、腹部表達都很高,并且一些只分泌1種MRJP的物種(如熊蜂Bombusterrestris等)的mrjp與mrjp9相似度最高,因此mrjp9被認為是最古老的基因(Buttstedtetal., 2013)。Kupke等人認為熊蜂是一個過渡物種,熊蜂的王漿主蛋白稱為BtRJPL(B.terrestrisroyal jelly protein-like),將熊蜂BtRJPL基因簇與西方蜜蜂apismelliferamrjps的對比顯示,除了yellow-e3和yellow-h之間只有一個BtRJPL基因外,其基因排列順序相同,并且發現BtRJPL參與食物的消化(Kupkeetal., 2012)。寄生蜂中5個mrjps串聯排列在3號染色體上,兩側是yellow,在染色體遠端還有1個mrjp,另外3個mrjps在4號染色體上,最后1個在Scaffold 1011上(Buttstedtetal., 2014)。寄生蜂是迄今為止在昆蟲中發現mrjps數量最多的,與蜜蜂mrjps具有一個共同起源(Werrenetal., 2010)。阿根廷螞蟻具有10個yellow和10個mrjps,其中8個yellow與黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的相似,可能為同源基因(Smithetal., 2011)。類似于西方蜜蜂和寄生蜂,阿根廷螞蟻基因組中mrjps獨立聚類為一類,這表明祖先基因在分化過程中可能出現復制,使mrjps有新的功能(Johnson and Linksvayer, 2010; Smithetal., 2011)。

7 MRJPs家族功能

MRJP1及其酶解產物具有多種生物學活性,其中最重要的功能是營養功能。Kamakura研究表明,MRJP1單體(稱為royalactin)在延長蜂王壽命中發揮重要作用,并且能誘導幼蟲分化為蜂王,是影響蜂王和工蜂級型分化的主要物質(Kamakura, 2011)。然而,Buttstedt等人反駁了這個觀點,他們認為決定級型分化的主要因素是攝入的食物量,充足的攝入量會給幼蟲提供更多更均衡的營養物質,而不是單一的化合物,MRJP1為蜂王幼蟲提供必須營養物質(Buttstedtetal., 2016)。

MRJP1對人類骨髓細胞有生長刺激作用(Watanabeetal., 1998)并且MRJP1單體與apisimin所組成的低聚物具有促進細胞增殖作用(Tamuraetal., 2009)。Kamakura等人通過研究表明MRJP1可以刺激原代培養的大鼠肝細胞DNA的合成,從而促進肝細胞的增殖,在這一過程中MRJP1起著有絲分裂原的作用,而且這種刺激作用呈劑量依賴性(Kamakuraetal., 2001)。MRJP1還具有殺菌作用,Vezeteu等人研究發現MRJP1不僅可以抑制歐洲幼蟲腐臭病細菌生長,還能抑制其病原菌生長(Vezeteuetal., 2016)。Brudzynski等人通過半定量徑向擴散法和微量液稀釋法來評估多重耐藥菌對glps(一種包含MRJP1的糖蛋白)的敏感性,結果表明glps具有快速殺菌活性(Brudzynskietal., 2015)。Fan等人通過蛋白質組學分析發現,MRJP1顯著降低血管平滑肌細胞收縮、遷移和增殖,表明MRJP1具有降血壓作用(Fanetal., 2016)。胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解MRJP1后得到11個血管緊張素I型轉化酶抑制肽,可有效地抑制人體血管緊縮素Ⅰ型轉化酶的活性(Matsuietal., 2002)。

低密度脂蛋白(LDL)與氧化修飾的低密度脂蛋白(Ox-LDL)是動脈粥樣硬化病的主要成分,王漿素(Royalisin)和MRJP1、MRJP3的降解產物能與LDL和Ox-LDL結合,從而抑制巨噬細胞增值,減少斑塊信息,有助于治療動脈粥樣硬化(Satoetal., 2021)。Okamoto等人研究表明,MRJP3可以抑制小鼠T細胞產生IL-4(白細胞介素-4)、IL-2(白細胞介素-2)和IFN-γ,具有抗過敏作用(Okamotoetal., 2003)。Maori等人發現,MRJP3是一種分泌的非序列特異性RNA結合蛋白,可以與多價RNA結合,使其轉變為eRNP顆粒,該顆?？梢詽饪s、保護、增強RNA的攝取,促進RNA轉移(Maorietal., 2019)。MRJP3具有細胞增殖和傷口愈合的作用,Minegaki等人證明MRJP3羧基端串聯五肽重復序列能促進細胞增殖(Minegakietal., 2020)。

MRJP4對細菌、真菌和酵母具有廣泛的抗菌作用(Kimetal., 2019)。蜂毒中含有MRJP8和MRJP9(Blanketal., 2012),Kim發現蜂毒處理哺乳動物細胞后會引起炎癥反應,而MRJP8可以調節細胞H2O2和促炎癥分子的產生,保護細胞,并且蜂毒中的MRJP8可以降低caspase-3的活性,具有抗凋亡作用(Kim, 2021)。

8 總結與展望

到目前為止,人們對MRJPs家族進行了大量研究。從蜂王漿中蛋白質的鑒定、MRJPs的表達與合成、mrjps家族進化,到MRJPs的結構與功能,如此多的研究數據讓科研人員不斷地深入了解MRJPs家族,但是仍然有許多地方不清楚。級型分化機制研究對于社會性昆蟲至關重要,MRJP1能影響蜜蜂的級型分化,但是其中的機理仍一無所知,這或許是今后的研究方向。mrjps存在于其他膜翅目昆蟲中,但是其功能我們還是不太了解?；蛟S,在揭示mrjps功能時,不應該僅限于蜜蜂。