AOS1 基因克隆及其在鮮切芋頭褐變中的表達模式分析

袁 曉，楊盼迪，王 斌

（1.廣東省粵北食藥資源利用與保護重點實驗室/韶關學院生物與農業學院，廣東 韶關 512005；2.華南農業大學園藝學院/廣東省果蔬保鮮重點實驗室，廣東 廣州 510642）

【研究意義】芋頭（Colocasiaesculenta）是天南星科芋屬植物，起源于印度、馬來半島以及中國南方等熱帶地區［1］。芋頭在全球大部分地區均有栽培種植，其中以非洲和我國珠江流域的種植面積最大［2］。芋頭的主要食用器官是地下肉質球莖，是非洲許多地區的主糧，在我國主要以菜用為主［3］。芋頭球莖中淀粉含量很高，食用風味獨特，烹飪后口感軟糯香甜可口，深受消費者喜愛［4］。但芋頭中的草酸含量也很高，每100 g 鮮芋頭的草酸含量可達574 mg［5］，草酸能與鈣離子結合形成草酸鈣，多以草酸鈣等草酸鹽的形式儲存植物體內，在芋頭去皮、切分等前處理過程中，草酸鈣結晶會使接觸芋頭的皮膚產生紅腫、瘙癢難忍等過敏癥狀，給消費者的食用帶來很多不便［6］。在生產基地或食品加工廠將芋頭切配好銷售，消費者在購買后無需再次加工處理，可有效避免消費者皮膚過敏的發生、促進芋頭的銷售。但切分好的芋頭（鮮切芋頭）在銷售過程中切面會發生褐變現象，表現出變黃、變褐等不良癥狀，嚴重降低鮮切芋頭的商品性，制約芋頭產業的高質量發展［7］。研究表明，鮮切果蔬表現出褐變癥狀主要有兩個方面的原因：一方面，果蔬感受到切割產生的損傷信號，會激活自身的防御系統誘導一些黃酮類物質的合成積累，使鮮切果蔬的切面表現出黃褐色；另一方面，切割處理破壞了切面細胞的完整性，使細胞的區隔功能喪失，導致酚酶能與底物（主要是酚類物質）直接反應，從而形成黃褐色的化合物。另外，切割處理會誘導細胞膜脂過氧化反應，使細胞膜的完整性和流動性降低，增加了參與酶促褐變反應的酶與底物的接觸機會，加劇酶促反應［8-9］。因此，鑒定在鮮切芋頭褐變過程中起促進作用的相關基因，并探究其表達與鮮切芋頭褐變的相關性，對于解析鮮切芋頭褐變發生機制、研發安全高效的鮮切芋頭褐變防控技術具有重要意義。

【前人研究進展】近年研究表明，脂質氧化是促進鮮切果蔬褐變的重要原因［10］，尤其膜脂過氧化導致的細胞膜完整性和流動性降低，使得底物和酶直接接觸，加速了酶促褐變反應。丙二烯氧化物合成酶（Allene oxide synthase,AOS）是一種典型的細胞色素P450 酶，在脂肪酸氧化過程中具有重要作用，能促進脂肪酸的氧化［11］。另外，植物AOS 是茉莉酸（Jasmonic acid,JA）合成途徑中的關鍵酶，AOS 以13(s)-氫過氧化亞麻酸為底物直接催化13(s)-氫過氧化亞麻酸生成12-氧-植物二烯酸，生成的產物隨后進入細胞質經過1 次還原和3 次氧化反應最終生成JA；JA 作為信號分子傳遞機械損傷信號使植物對機械損傷作出反應，也可以反饋調控AOS家族基因的表達［12］，植物中誘導AOS的表達可能也是一種防御反應。植物AOS家族基因的表達受多種生物和非生物因素的誘導［13］，例如：鹽脅迫顯著誘導水稻AOS基因的表達，而aos突變體水稻對鹽脅迫的敏感性很低［14］；真菌性生物脅迫處理顯著誘導板栗AOS表達，在擬南芥中過表達板栗AOS1基因可顯著延緩樟疫霉（Phytophthora cinnamomi）病原菌的生長，并促進擬南芥的生長［15］。在煙草中，傷信號能顯著誘導AOS基因的表達，過表達一個細胞質定位的AOS基因能促進傷誘導的JA 積累［16］；在擬南芥中突變一個AOS基因CYP74A，會阻斷傷信號誘導的JA 合成積累［17］?！颈狙芯壳腥朦c】芋頭鮮切處理本身就是一種物理性的機械損傷，褐變可能是鮮切芋頭對傷信號的一種反應。前期分析轉錄組測序數據時發現，在鮮切芋頭褐變過程中，許多與脂質氧化和代謝相關基因的表達顯著上調。植物AOS在脂肪酸氧化和JA 合成過程中具有重要作用，但芋頭AOS1是否參與對傷信號的響應，以及其表達是否與鮮切芋頭有關，目前尚未見相關研究報道。此外，植物AOS基因最先在亞麻中成功克隆，之后陸續在擬南芥、水稻、煙草等模式植物和一些經濟作物中成功克隆了AOSs基因［18］，但尚未在芋頭中見到AOS基因克隆的研究報道?！緮M解決的關鍵問題】為研究脂質氧化代謝基因在鮮切芋頭褐變中的作用，本研究從鮮切芋頭中克隆AOS1基因的編碼序列（Coding sequence,CDS），通過分析AOS1基因在鮮切芋頭褐變過程中的表達變化，及抗褐變劑對其表達的影響，初步明確AOS1基因表達與鮮切芋頭褐變的關系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用芋頭球莖分別于2021 年11、12月購自廣東省韶關市湞江區當地的一個農貿市場，品種為‘檳榔芋’。挑選個頭大小基本一致，無病蟲害和明顯機械傷的芋頭作為試驗材料，自來水清洗干凈表面的泥沙，去皮并切分成厚度約1 cm 的薄片，備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 鮮切芋頭褐變試驗 將鮮切芋頭裝在一次性塑料托盤，每個托盤裝9 片，3 個重復共27 片；用一次性塑料薄膜保鮮袋密封包裝，分別放置在20 ℃和4 ℃的恒溫培養箱中觀察褐變變化。20 ℃貯藏期間，依次在0、12、24 h 觀察褐變變化，每個重復中隨機取1 片芋頭作為代表拍照；4 ℃貯藏期間，每隔2 d 測定色度值，并每次隨機取3片芋頭作為分析樣品（每個重復取1 片）。

1.2.2 褐變抑制處理試驗 試驗設3 個處理，芋頭片分別用0.1 g/L 的肉桂酸（Cinnamic acid,CA）、乙醇酸（Glycolate,GA）和香草酸（Vanillic acid,VA）溶液浸泡30 min，用自來水浸泡30 min作為對照（CK）。撈出并瀝干鮮切芋頭表面的水分，用塑料薄膜保鮮袋密封包裝，放置在4 ℃低溫冰箱貯藏12 d。每個處理3 次重復共27 片鮮切芋頭，在處理0、12 d 分別收集樣品，送至北京百邁客生物科技有限公司進行轉錄組測序分析。

1.2.3 鮮切芋頭表面L*值測定 使用CR-400 型色差儀（日本，柯尼卡美能達）測定鮮切芋頭表面的L*值（亮度），分別在芋頭切面的3 個不同部位測定，以3 次數據的平均值表示該片芋頭表面的亮度。

1.2.4 芋頭AOS1基因全長克隆 使用北京天根生化科技有限公司的總RNA 提取試劑盒（產品編號：DP441）提取鮮切芋頭的總RNA，利用反轉錄試劑盒合成cDNA。以芋頭cDNA 為模板，使用高保真Taq 酶，通過RT-PCR 法擴增AOS1基因全長序列。全長克隆引物序列如下：正向引物5'-ATGGCTTCGGCCTCTCTCT-3'，反向引物5'-TCAGAAGGTCGCCCTCTTCAA-3'。PCR 擴 增完成后，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增DNA 片段在確認符合預期大小后，將PCR 產物回收并連接到pUCm-T 載體上，構建重組克隆載體，并轉化DH 5α 感受態細胞。使用含有氨芐霉素的LB平板篩選陽性克隆，并再次通過菌落PCR 法鑒定克隆產物。

1.2.5 序列特性分析 根據測序序列推導出對應的編碼蛋白序列，將蛋白序列提交至NCBI 數據庫中與擬南芥、煙草和番茄等模式植物的基因組比對，在相應的基因組數據中找到AOS1 同源蛋白，使用DNAman 軟件繪制多序列比對圖。在Expasy 網站（https://www.expasy.org/）分析芋頭AOS1 蛋白的理化性質。通過Plant-mPLoc 網站（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）預測芋頭AOS1 蛋白的亞細胞定位。使用芋頭AOS1 蛋白氨基酸序列在NCBI 數據庫中Blast 同源蛋白，在Blast 結果中每種植物挑選一個AOS蛋白序列，使用MEGA 軟件中的鄰接法（Neiborjoining,NJ）構建進化樹。

1.2.6AOS1表達分析 采用熒光定量PCR 法檢測鮮切芋頭褐變過程中AOS1表達變化，引物序列如下：正向引物5'-TTCCCCACCGTCATCAAGTG-3'，反向引物5'-GTCCTGATCTCCTCCGCAAG-3'。利用轉錄組測序檢測CA、GA 和VA 處理對AOS1表達的影響，結果用每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的片段數（Fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments,FPKM）值表示。

1.2.7 啟動子上順式作用元件分析 根據克隆的AOS1基因cDNA 序列，在NCBI 數據庫中檢索同源基因（登錄號：mQL89524.1），找到翻譯起始密碼子（ATG）上游長度為2 000 bp 左右的DNA 序列［19］。在PlantCARE 網站（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預測啟動子序列中的順式作用元件，根據預測結果，使用TBtools 軟件繪制順式作用元件在啟動子上的分布。

1.3 數據分析

試驗數據用Microsoft Power Point 軟件繪圖，使用SPSS 22.0 軟件分析差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 鮮切芋頭在不同溫度下貯藏期間的褐變表現變化

為觀察鮮切芋頭在貯藏期間的褐變變化，以及明確低溫貯藏對鮮切芋頭褐變的抑制作用，將鮮切芋頭分別貯藏在20 ℃和4 ℃的環境下。在20 ℃貯藏期間，鮮切芋頭貯藏12 h 即產生輕微的變黃癥狀，在24 h 時切面明顯變黃，基本喪失了商品性（圖1A）；在4 ℃貯藏期間，鮮切芋頭褐變進程較為緩慢，貯藏6 d 僅觀察到輕微的變黃癥狀，在12 d 時褐變癥狀才較為明顯（圖1B）。表明貯藏溫度是影響鮮切芋頭褐變的重要因素，4 ℃低溫貯藏可有效延緩鮮切芋頭褐變。但即使在4 ℃低溫貯藏期間，鮮切芋頭褐變仍會緩慢發展。因此，探究鮮切芋頭在低溫貯藏期間的褐變發生機制，對于研發安全高效的抗褐變技術，減少鮮切芋頭采后損失具有重要意義。

圖1 鮮切芋頭在不同貯藏溫度下的褐變變化Fig.1 Changes in browning of fresh-cut taros at different storage temperatures

2.2 芋頭AOS1 全長序列克隆

轉錄組測序組裝的芋頭AOS1基因的CDS 序列長度為1 560 bp。為從鮮切芋頭中克隆AOS1全長，以鮮切芋頭cDNA 為模板，采用RT-PCR法擴增芋頭AOS1基因全長序列。經PCR 擴增后在1 000～2 000 bp 間得到一條DNA 條帶（圖2A），表明初步擴增到目的片段。將該片段回收，并連接至T 載上轉化大腸桿菌。挑選2 個單菌落，進行菌落PCR 驗證，結果（圖2B）顯示，從2個單克隆菌落中均擴增出1 條約1 500 bp 長度的DNA 條帶，表明回收產物成功與T 載連接，可用于測序鑒定。

圖2 AOS1 全長序列的PCR 產物電泳圖Fig.2 Electrophoregram of PCR product of AOS1 full-length sequence

2.3 芋頭AOS1 生物信息學分析

芋頭AOS1編碼519 個氨基酸，編碼的蛋白質分子量大小為57.63 kD，理論等電點為8.68。氨基酸殘基中，60 個氨基酸帶負電荷，64 個帶正電荷。蛋白質的不穩定指數為46.24，是一個不穩定蛋白；脂肪指數為87.92，親水性指數為-0.108。Plant-mPLoc 分析結果顯示，芋頭AOS1 蛋白定位在葉綠體。

在擬南芥等模式植物中對具體基因的功能研究較為深入，基于已有文獻分析芋頭AOS1基因的潛在功能，比較芋頭AOS1 與其他植物AOS1蛋白的氨基酸序列一致性，結果（圖3）表明，芋頭AOS1 與同屬天南星科的浮萍（Spirodela intermedia）SiAOS1 的同源性最高，序列相似性為74.42%；與擬南芥（Arabidopsisthaliana）、煙草（Nicotianatabacum）和番茄（Solanum lycopersicum）等模式植物AOS1 蛋白的序列相似性較低，相似性分別為38.50%、67.41%和28.87%，與番茄SlAOS1 蛋白的序列相似性最低，與擬南芥AtAOS1 蛋白的氨基酸序列一致性差異最大。

圖3 植物AOS1 蛋白序列比對Fig.3 Sequence alignment of AOS1 proteins of plant

通過同源比對，篩選到與芋頭AOS1 蛋白同源性較高的植物AOS1 蛋白，利用他們構建系統發育樹，分析不同植物AOS1 蛋白間的親緣關系。同樣，芋頭AOS1 與同屬天南星科的浮萍SiAOS1的親緣關系最近，聚在同一分支（圖4）。盡管與擬南芥AtAOS1 和番茄SlAOS1 聚在一大支上，但他們之間的親緣關系很遠，暗示著芋頭AOS1可能與擬南芥等模式植物AOS1 蛋白的功能有著較大差異。

圖4 幾種同源性較高的植物AOS1 蛋白系統發育分析Fig.4 Phylogenetic analysis of AOS1 proteins in several plants with high homology

2.4 鮮切芋頭褐變過程中AOS1 表達變化

為探究芋頭AOS1基因表達在鮮切芋頭褐變過程中的作用，分析了其在鮮切芋頭褐變過程中的表達變化及其與褐變指標的相關性。L*是一個亮度指示指標，L*值越小，物體表面亮度越低。在低溫貯藏期間，鮮切芋頭的L*值逐漸降低（圖5A），表明切面的亮度在貯藏期間下降，鮮切芋頭發生了較嚴重的褐變現象（圖1）。AOS1的表達量在鮮切處理3 d 后迅速增加，表明鮮切處理誘導了AOS1表達。在低溫貯藏期間，AOS1的表達總體呈增加趨勢（圖5B）。相關性分析結果顯示，L*值與AOS1表達呈明顯的負相關（圖5C）。

圖5 AOS1 基因在鮮切芋頭褐變過程中的表達Fig.5 Changes in expression of AOS1 gene during the browning process of fresh-cut taro

2.5 褐變抑制劑處理對AOS1 表達的抑制作用

CA、GA 和VA 是天然的褐變抑制劑，外源處理可有效抑制鮮切芋頭褐變［20］。分析0.1 g/L CA、GA 和VA 浸泡處理30 min 對AOS1表達的影響，結果（圖6）表明，處理12 d 后，對照（CK）中AOS1表達量是0 d 的3.71 倍，再次證實鮮切后AOS1表達量顯著增加；CA、GA 和VA 處理AOS1的表達量僅為CK 的0.89、0.86 和0.29 倍，GA 和VA 處理中AOS1表達量顯著低于CK，表明褐變抑制劑處理能有效抑制AOS1表達，尤其VA 處理對AOS1表達的抑制作用最為強烈。這從另一個角度反映AOS1表達可能與鮮切芋頭褐變相關。

圖6 3 種褐變抑制劑處理對AOS1 基因表達的影響Fig.6 Effects of three browning inhibitors on AOS1 gene expression

啟動子是感受環境變化并直接調控基因表達的重要元件［19］。AOS1在鮮切處理后表達量顯著增加，意味著鮮切處理產生的傷信號可能通過啟動子中的響應元件調控AOS1表達。為此，在芋頭基因組中查找到AOS1基因ATG 上游2 053 bp的DNA 序列，默認該序列為芋頭AOS1基因的啟動子序列，提交至PlantCARE 網站分析其上的順式作用元件。啟動子序列中含有豐富的TATAbox 和CAAT-box 等啟動子核心元件，證明查找的DNA 序列符合啟動子特性，是AOS1基因的啟動子序列。

AOS1基因啟動子序列中含有豐富的逆境響應元件，其中光響應元件（P-box、TCCC-motif、Box 4、Sp1、GT1-motif、G-box 和GATA-motif）數量最多、共11 個，說明AOS1表達可能受光照的影響。此外，還鑒定到了多個植物激素響應元件，如2 個赤霉素響應元件（GARE-motif 和TATC-box）、4 個脫落酸響應元件（ABRE）、4個水楊酸響應元件（TCA-element）、1 個乙烯響應元件（ERE）（圖7）。啟動子中還含有多個反式作用因子結合元件，如4 個MYB 識別位點（MYB）、2 個MYC 轉錄因子識別位點（Myc）和2 個WRKY 結合位點（W box），表明AOS1的表達還受轉錄因子的調控。

圖7 芋頭AOS1 基因啟動子中的逆境響應元件Fig.7 Stress response elements in the promoter of taro AOS1 gene

3 討論

AOS 是脂質氧化過程中的關鍵酶之一，也是通過脂質氧化途徑合成JA 前體物質的關鍵酶［21］。細胞膜脂過氧化是導致鮮切果蔬發生褐變的重要原因［22］。因此，克隆芋頭AOS1基因并分析其在鮮切芋頭褐變過程中的表達變化，明確其在鮮切芋頭褐變過程中的作用，對于挖掘關鍵基因資源具有重要意義。本研究成功克隆了芋頭AOS1基因，其編碼519 個氨基酸殘基。芋頭AOS1 與同屬天南星科的浮萍SiAOS1 的進化關系最近，序列同源性最高，證明芋頭AOS1 屬于植物AOS家族。但與擬南芥、煙草AOS1 蛋白的親緣關系較遠，說明不同植物AOS1 蛋白的生物學功能可能存在一定差異，暗示不同植物AOS1 功能的多樣性［23］。預測結果分析顯示芋頭AOS1 定位在葉綠體，與其他植物AOS1 蛋白的定位特性一致［24］。但芋頭AOS1 蛋白的亞細胞定位結果仍需進一步通過試驗確認，因為芋頭肉質球莖是淀粉等養分的主要貯藏器官，葉綠體數量不會很豐富。

機械傷誘導植物合成積累酚和黃酮以及醌等褐色物質，是植物對機械損傷作出反應的一種自我防御機制［25］。植物AOS1表達也受到機械傷處理的誘導，但機械傷誘導AOS1表達與鮮切果蔬褐變的關系尚不明確。水稻中含有4 個AOSs基因，機械損傷能顯著誘導OsAOS1的表達，但未能誘導OsAOS4表達［26］。本研究中，鮮切芋頭AOS1在鮮切3 d 后急劇增加，表明切分等物理損傷誘導了芋頭AOS1表達。在隨后的低溫貯藏期間，芋頭AOS1表達量隨貯藏時間延長而逐漸增加，且與L*值呈顯著負相關性。褐變抑制劑處理又能顯著抑制芋頭AOS1表達，尤其是香草酸處理。以上結果表明，AOS1表達與鮮切芋頭褐變密切相關。此外，我們還發現芋頭AOS1與木薯AOS1 的進化關系也較近，芋頭和木薯的主要食用器官均是地下球莖，且在采后或切分后顏色會變黑變褐［27］。暗示著芋頭AOS1 和木薯AOS1 可能具有類似的功能，其在鮮切后褐變發生過程中具有重要促進作用。

植物AOS家族基因的表達受多種因子的調控，啟動子中的順式作用元件是響應環境因子變化的重要元件。甘蔗AOS家族基因的啟動子中存在光響應、ABA 響應、JA 響應、厭氧、干旱等多種脅迫響應元件［11］。與甘蔗AOS家族基因啟動子相似，芋頭AOS1啟動子中含有豐富的光響應、植物激素（ABA、SA、JA、GA、乙烯）響應等逆境響應元件，表明機械傷誘導的激素信號在調控AOS1表達中發揮重要作用。在水稻葉片和莖中，紅光和遠紅光能誘導OsAOS1和OsAOS4表達，其中OsAOS1的轉錄應答迅速但短暫，而OsAOS4的轉錄應答緩慢但持久，且OsAOS1的轉錄上調程度比OsAOS4高很多［26］。表明AOS1表達受光照調控，加之其表達與鮮切芋頭褐變的相關性，意味著其可通過調節光照控制鮮切芋頭褐變，為鮮切芋頭綠色高效褐變防控技術研發提供了思路。此外，芋頭AOS1啟動子中還含有多個MYB、MYC 和WRKY 轉錄因子識別位點，表明芋頭AOS1表達還受到MYB 等反式作用因子的調控，但具體的轉錄調控機理尚需深入研究。

4 結論

本研究克隆到的芋頭AOS1屬于植物AOS 家族，芋頭AOS1 與同屬天南星科的浮萍SiAOS1的氨基酸序列一致性最高，與模式植物擬南芥等AOS1 蛋白的序列一致性較低，表明植物AOS家族基因可能具有豐富多樣的生物學功能。鮮切處理誘導芋頭AOS1表達，其表達與鮮切芋頭褐變呈明顯正相關，且褐變抑制劑處理能抑制其表達，證明AOS1表達可能與鮮切芋頭褐變有關。芋頭AOS1啟動子中含有豐富的植物激素和環境響應元件，以及反式作用因子結合位點，表明其表達受到轉錄因子和植物激素的調控。