超高效合相色譜法快速測定嬰幼兒輔食果泥中甲氰菊酯對映體的殘留量

張文華 ,謝 文 ,侯建波 ,張蘊杰 ,徐 繪 ,樓成杰 ,宋 偉,韓 芳

(1.浙江省檢驗檢疫科學技術研究院,杭州 310016;2.中國計量大學 光學與電子科技學院,杭州 310018;3.合肥海關技術中心,合肥 230022)

甲氰菊酯是一種重要的擬除蟲菊酯類廣譜殺蟲殺螨劑[1],毒性中等,可用于荔枝、蘋果、柑橘橙、西瓜等水果的病害防治。大量使用甲氰菊酯農藥,將會對食品和環境造成一定污染,目前該問題已引起人們的廣泛重視。甲氰菊酯存在兩個對映體,分別為(－)-甲氰菊酯和(＋)-甲氰菊酯[2-3],這兩個對映體的殺蟲活性和降解速率差異較大,(＋)-甲氰菊酯的殺蟲活性高于(－)-甲氰菊酯的,降解速率也更快[1]。若只使用(＋)-甲氰菊酯,將會減少甲氰菊酯農藥使用量,更有利于保護生態環境。但是,目前生產和使用的仍是外消旋體甲氰菊酯農藥,GB 2763－2021《食品安全國家標準 食品中農藥最大殘留限量》[4]只規定了甲氰菊酯外消旋體在西瓜、橙、梨等常見水果中的殘留限量(5 mg·kg－1),并未規定單一對映體的殘留限量。介于不同對映體殺蟲活性的差異,有必要開發一種能精準測定西瓜、橙、梨等水果中甲氰菊酯對映體殘留量的方法。

氣相色譜法(GC)[5]、毛細管電泳色譜法(CEC)[6-7]、氣相色譜-質譜法(GC-MS)[8-9]、液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)[10-12]、高效液相色譜法(HPLC)[13-15]等被廣泛用于手性化合物的分離。文獻報道的(－)-甲氰菊酯和(＋)-甲氰菊酯分離及測定的方法較少,如文獻[2-3]采用HPLC 分離了(－)-甲氰菊酯和(＋)-甲氰菊酯,但上述方法存在分析時間長(大于15 min)、分離度差、有機試劑消耗量大等問題。超高效合相色譜法(UPC2)以超臨界二氧化碳為主要流動相,該流動相具備比傳統有機流動相更快的傳質速率和更高的分離效率等優點[16],更適合分析傳統LC 難以分離的同分異構體和結構類似物。UPC2已成功的應用于三唑類農藥[17-18]、左旋肉堿減肥藥[19-20]、獸用興奮劑[21-22]等手性化合物的分離和測定,但是還未見在甲氰菊酯對映體的分離及殘留量測定方面的應用。鑒于此,本工作采用配有多糖衍生物手性固定相的UPC2快速測定嬰幼兒輔食果泥樣品中甲氰菊酯對映體的殘留量。該方法操作便捷、分離效率高、綠色環保,可為嬰幼兒輔食果泥中其他手性農藥對映體殘留量的測定提供新思路。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Acquity UPC2型超高效合相色譜儀,配二極管陣列檢測器(PDA);MULTIFUGE X1R 型臺式冷凍離心機;N-1210BV 型旋轉蒸發儀;JJ500型電子天平;AE260型電子天平;WH-861型渦旋混勻器;Synergy185型超純水儀;N-EVAP-24 型氮吹儀;Supelco 24 位固相萃取儀;CNW C18固相萃取柱(500 mg/3 mL,C18柱);0.22μm 有機相濾膜。

對映體單標準儲備溶液:1.0 g·L－1,取(－)-甲氰菊酯、(＋)-甲氰菊酯標準品各10 mg,用異丙醇溶解并定容于10 mL容量瓶中,搖勻備用。

混合標準溶液系列:取適量對映體單標準儲備溶液,用正庚烷逐級稀釋,配制成1.0,2.0,4.0,10.0,20.0 mg·L－1的混合標準溶液系列。

(－)-甲氰菊酯、(＋)-甲氰菊酯標準品純度均不小于97%;正庚烷、異丙醇、甲醇、乙酸乙酯、乙腈均為色譜純;其余試劑為分析純;試驗用水為超純水。

1.2 色譜條件

Acquity Trefoil AMY1 色譜柱(150 mm×3.0 mm,2.5μm),填料為直鏈淀粉-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯);柱溫31℃;檢測波長230 nm;系統背壓17.2 MPa;流動相A 為超臨界二氧化碳,B為含0.5%(體積分數,下同)氨水的甲醇溶液;流量1.5 mL·min－1;進樣量5.0μL。梯度洗脫程序:0～0.2 min時,B為3%;0.2～0.3 min時,B 由3%跳轉至10%,保持1.7 min;2.0～2.5 min時,B 由10%降至3%,保持0.5 min。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的提取

取5 g(精確至0.01 g)嬰幼兒輔食果泥樣品,置于50 mL具塞塑料離心管中,依次加入20 mL乙酸乙酯和3.0 g氯化鈉,渦旋2 min,以轉速4 000 r·min－1離心5 min。將上清液轉移至濃縮瓶中,在下層殘渣中加入20 mL乙酸乙酯,按照上述步驟重復提取1次。合并上清液,于40 ℃減壓濃縮至近干,在殘渣中加入5 mL甲醇,溶解后待凈化。

1.3.2 樣品的凈化和測定

用3 mL甲醇活化C18柱。將上述待凈化液轉移至活化好的C18柱中,收集全部流出液,在40 ℃水浴中氮吹至近干。在殘渣中加入1 mL 正庚烷,渦旋1 min溶解殘渣,過0.22μm 有機相濾膜,濾液按照色譜條件測定。

2 結果與討論

2.1 流動相中助溶劑的選擇

采用UPC2分析時,在主體流動相超臨界二氧化碳中加入少量乙腈、甲醇、異丙醇等助溶劑,可有效調節流動相的洗脫和溶解能力,從而精確調控目標物的分離效果和分析速率。另外,通過調節流動相的酸度,可有效改善目標物色譜峰形。異丙醇的黏度較大,使用過程中儀器容易出現超壓報警。因此,試驗考察了甲醇、含0.5%氨水的甲醇溶液、含0.5%(體積分數,下同)甲酸的甲醇溶液、乙腈等助溶劑對目標物分離效果的影響,結果見圖1。

圖1 助溶劑對甲氰菊酯對映體分離效果的影響Fig.1 Effect of co-solvent on the separation of fenpropathrin enantiomers

由圖1可知:使用甲醇和乙腈作助溶劑時,甲氰菊酯對映體均未能實現基線分離;在甲醇中添加了0.5%氨水或0.5%甲酸時,甲氰菊酯對映體的分離度得到提高,且添加0.5%氨水時甲氰菊酯對映體的響應更強。因此,試驗選擇含0.5%氨水的甲醇溶液作為助溶劑。

2.2 洗脫程序的選擇

試驗考察了3種洗脫程序(洗脫程序1,8.0 min以內,流動相A,B 體積比為90∶10,等度洗脫;洗脫程序2,見1.2 節梯度洗脫程序;洗脫程序3,8.0 min以內,流動相A,B體積比為95∶5,等度洗脫)對目標物分離效果的影響,結果見圖2。

圖2 洗脫程序對甲氰菊酯對映體分離效果的影響Fig.2 Effect of elution program on the separation of fenpropathrin enantiomers

由圖2可知:以洗脫程序1分離時,甲氰菊酯對映體不能完全分離;以洗脫程序2分離時,甲氰菊酯對映體的分離度較好,色譜峰形尖銳、對稱;以洗脫程序3分離時,甲氰菊酯對映體的分離度良好,但峰形較差,且存在拖尾現象。因此,試驗選擇以洗脫程序2分離甲氰菊酯對映體。

2.3 柱溫的選擇

主體流動相超臨界二氧化碳的密度會因柱溫的變化而變化,當柱溫升高時,流動相密度變小,洗脫能力降低,目標物的保留時間延長。結合推薦的最高柱溫(40 ℃)和維持二氧化碳超臨界狀態的溫度(不小于31 ℃),試驗考察了柱溫分別為31,35,40 ℃時對目標物分離效果的影響。結果表明,甲氰菊酯對映體在31,35,40 ℃柱溫下的分離度分別為1.5,1.3,1.2,31 ℃下兩種目標物的分離度更高且色譜峰形更尖銳。因此,試驗選擇的柱溫為31 ℃。

2.4 定容試劑的選擇

考慮到定容試劑可能影響目標物的分離效果,試驗比較了5種常用于UPC2的定容試劑(甲醇、乙醇、乙腈、異丙醇、正庚烷)對甲氰菊酯對映體的分離效果,結果見圖3。

圖3 定容試劑對甲氰菊酯對映體分離效果的影響Fig.3 Effect of constant volume reagent on the separation of fenpropathrin enantiomers

由圖3可知,以甲醇、乙醇、乙腈和異丙醇作為定容試劑時,甲氰菊酯對映體的分離度和色譜峰形均較差;選擇正庚烷作為定容試劑時,甲氰菊酯對映體的分離度較好,且色譜峰形更尖銳、對稱。因此,試驗選擇正庚烷作定容試劑。

2.5 凈化柱的選擇

試驗考察了分別以C18柱[23]、CNW 弗羅里硅土(Florisil)固相萃取柱(1 g/6 mL,Florisil柱)[24]對加標陰性樣品凈化效果的影響,結果見圖4。

圖4 凈化柱對甲氰菊酯對映體凈化效果的影響Fig.4 Effect of purification column on the purification of fenpropathrin enantiomers

結果表明:采用C18柱凈化時,甲氰菊酯對映體分離度較好,二者峰面積均較大,峰形對稱,(－)-甲氰菊酯和(＋)-甲氰菊酯的回收率分別為92.3%和106%;采用Florisil柱凈化時,(－)-甲氰菊酯的峰面積較小,峰形較差,回收率僅為65.4%。因此,試驗選擇的凈化柱為C18柱。

2.6 標準曲線和測定下限

按照儀器工作條件測定混合標準溶液系列,以兩種目標物的質量濃度為橫坐標,對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線,所得(－)-甲氰菊酯和(＋)-甲氰菊酯的質量濃度均在1.0～20.0 mg·L－1內和對應的峰面積呈線性關系,線性回歸方程分別為y＝6.640×103x＋4.060×102和y＝5.620×103x＋2.240×102,相關系數分別為0.999 9 和0.999 8。

以10倍信噪比(S/N)計算測定下限(10S/N),所得(－)-甲氰菊酯和(＋)-甲氰菊酯的測定下限均為0.2 mg·kg－1。

2.7 精密度和回收試驗

按照試驗方法對陰性果泥樣品進行加標回收試驗,每個濃度水平平行測定6次,計算回收率及測定值的相對標準偏差(RSD),結果見表1。

表1 精密度和回收試驗結果(n＝6)Tab.1 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表1可知,兩種目標物的回收率為81.4%～106%,測定值的RSD 為4.1%～7.2%,回收率和精密度均符合GB/T 27404－2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》[25]的要求,能夠滿足嬰幼兒輔食果泥樣品中甲氰菊酯檢測的要求。

2.8 樣品分析

按照試驗方法對隨機抽取的20份市售西瓜泥、橙泥、梨泥樣品(其中西瓜泥8 份、橙泥5 份、梨泥7份)中甲氰菊酯對映體進行檢測。結果顯示,在1份梨泥樣品中檢出(－)-甲氰菊酯和(＋)-甲氰菊酯,檢出量分別為0.25,0.22 mg·kg－1,其他樣品均未檢出甲氰菊酯對映體。其中,陽性梨泥樣品的色譜圖見圖5。

圖5 陽性梨泥樣品的色譜圖Fig.5 Chromatogram of the positive pear puree sample

本工作提出了UPC2快速測定嬰幼兒輔食果泥(西瓜泥、橙泥、梨泥)中甲氰菊酯對映體殘留量的方法。該方法操作便捷、分離效率高、綠色環保,具有一定的應用推廣價值。