大孔弱酸型離子交換樹脂分離純化-氨基酸分析儀測定醬油中ε-聚賴氨酸的含量

陳 雄 ,方宣啟 ,鄭利軍 ,陳同強

(1.中大檢測(湖南)股份有限公司,長沙 410000;2.湖南省產商品質量檢驗研究院,長沙 410007)

ε-聚賴氨酸(ε-PL)作為一類天然防腐劑,一般由25～30個賴氨酸殘基構成。相對于其他防腐劑,ε-PL具有抗菌譜廣、穩定性好等特點[1-4]。在日本,ε-PL 早已進入消費市場,被添加至各類市售食品中。在我國,ε-PL 還處于研究階段,應用前景良好[5-7]。

2014年,國家衛生和計劃生育委員將ε-PL 列為食品添加劑的新品種,添加量為150～250 mg·kg－1[8],涉及的食品包括焙烤食品、熟肉制品以及果蔬汁類等。但是,ε-PL 在食品中的應用不廣泛,其含量檢測報道較少,我國也尚未制定相關檢測標準。已報道的方法多是針對基質簡單的食品,如發酵液等,檢測方法包括比色法和高效液相色譜法(HPLC)[9-11]。然而,食品種類繁多、基質復雜,比色法很難滿足實際檢測需求;以HPLC 檢測時,ε-PL較難分離,且ε-PL屬于高聚物,其色譜峰寬度普遍較大,測定結果準確度難以保證。有研究人員采用瓊脂擴散法[12]測定食品中ε-PL 的含量,但是該方法存在準確度不好以及易出現假陽性結果等問題。我國目前還未允許將ε-PL 添加至醬油中,為了解市售醬油的添加情況,本工作以醬油為待測對象,采用大孔弱酸型離子交換樹脂分離純化其中的ε-PL,并將ε-PL水解成賴氨酸,采用氨基酸分析儀進行測定。該方法具有靈敏度高、重現性好、準確度高等特點,可為ε-PL 在食品工業領域應用的監管提供有力技術支撐。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Biochrom 30＋型全自動氨基酸分析儀;BS-100N 型自動部分收集器;BT100N 型數顯恒流泵;玻璃層析柱(20 cm×2.5 cm);UV-Vis-840型紫外-可見分光光度計。

ε-PL標準儲備溶液:1.0 g·L－1,稱取ε-PL 標準品100 mg,用水溶解并定容至100 mL,搖勻備用。

ε-PL標準溶液系列:取適量ε-PL 標準儲備溶液,用水逐級稀釋,配制成質量濃度為1.0,5.0,10,20,50,100,200 mg·L－1的標準溶液系列。

Amberlite IRC-50 H＋型大孔弱酸型離子交換樹脂(簡稱IRC-50 樹脂),體積全交換容量不小于3.0 mol·L－1,填料粒徑280～700μm;ε-PL 標準品純度不小于95%;雙縮脲試劑(A 液是0.1 g·mL－1氫氧化鈉溶液,B 液是0.01 g·mL－1硫酸銅溶液);鹽酸、氫氧化鈉為分析純;其他試劑為色譜純;試驗用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

磺酸型陽離子樹脂色譜柱;檢測波長570 nm;流動相按照儀器說明書配制或購買;其他條件參照GB 5009.124－2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的預處理

取醬油樣品2～3 g,加入1～5 mL 水(視醬油黏稠情況)溶解,超聲提取30 min,以5 000 r·min－1轉速離心5 min,收集上清液。按照上述步驟重復提取1次,合并上清液,用甲酸或乙酸將溶液的酸度調至中性,待凈化。

1.3.2 IRC-50樹脂的預處理

取IRC-50樹脂,先用水浸泡除去其中破損的樹脂與雜質,再依次用10倍樹脂體積的1 mol·L－1氫氧化鈉溶液、1 mol·L－1鹽酸溶液、1 mol·L－1氫氧化鈉溶液在磁力攪拌條件下依次浸泡樹脂約5 h。每次浸泡完后,均用水洗滌樹脂2～3次,除去其中的酸、堿溶液,完成樹脂的轉型[13]。離心,棄去上層液體后,用普通漏斗將IRC-50樹脂慢慢填充至玻璃層析柱中,填充量約為層析柱體積的3/4。

1.3.3 樣品的凈化

取待凈化液(ε-PL標準溶液取5 mL)過玻璃層析柱,用0.20 mol·L－1氫氧化鈉溶液洗脫,洗脫流量為1.0 mL·min－1,用30個試管接收洗脫液,每管收集10 min。參考文獻[14],以考馬斯亮藍法(檢測波長595 nm)示蹤,以管號為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制凈化曲線。參照ε-PL 標準溶液的收集情況,將13～21號管洗脫液合并后置于100 mL容量瓶中,用甲酸或乙酸調至中性,用水定容至刻度,待水解。

1.3.4ε-PL的水解和測定

取待水解液2.0 mL,參照GB 5009.124－2016中5.3節方法進行水解和調節溶液酸度至中性,所得溶液用水定容至1.0 mL,按照儀器工作條件測定其水解產物賴氨酸的含量。

2 結果與討論

2.1 洗脫條件的選擇

由于樹脂的解吸率與洗脫時間相關,而洗脫時間和洗脫劑氫氧化鈉溶液濃度有關。為保證ε-PL解吸完全,將最長洗脫時間設定為5 h,考察了氫氧化鈉溶液濃度分別為0.05,0.10,0.15,0.20,0.25,0.30 mol·L－1時對洗脫效果的影響,結果見表1。

表1 洗脫劑濃度對ε-PL洗脫效果的影響Tab.1 Effect of eluant concentration on the elution effect ofε-PL

由表1 可知:當氫氧化鈉溶液濃度為0.05 mol·L－1和0.10 mol·L－1時,設定的最長時間內ε-PL回收率均較低(低于70.0%),說明這兩個濃度的洗脫劑均不能使ε-PL 解吸完全;當氫氧化鈉溶液濃度不低于0.15 mol·L－1時,ε-PL 回收率均較高,且洗脫時間隨著洗脫劑濃度的升高而縮短,洗脫劑消耗量則隨之增加。洗脫是將吸附在樹脂內部的ε-PL 釋放出來擴散到洗脫劑里,而擴散速率與擴散界面兩側氫氧化鈉溶液濃度差成正比,樹脂外部氫氧化鈉溶液濃度越高,越有利于ε-PL的擴散,洗脫時間越短[15-18]。當氫氧化鈉溶液濃度過高時,將導致Na＋過載,部分Na＋不能結合到樹脂上,導致氫氧化鈉利用率下降,氫氧化鈉消耗量增加。綜合考慮ε-PL 回收率、洗脫時間及氫氧化鈉消耗量等,試驗選擇洗脫劑氫氧化鈉溶液的濃度為0.20 mol·L－1。

試驗進一步優化了洗脫流量,結果顯示,以不同流量(0.1～2.0 mL·min－1)洗脫時,ε-PL回收率均大于95.0%,且隨著洗脫流量的上升,洗脫時間縮短,洗脫劑消耗量增加。綜合考慮,試驗選擇的洗脫流量為1.0 mL·min－1。

分取1.0 g·L－1ε-PL 標準儲備溶液5 mL,按照試驗條件凈化,收集了30管溶液,1～30管內洗脫液595 nm 處的吸光度見圖1。

圖1 ε-PL標準溶液的凈化曲線Fig.1 Purification curve ofε-PL standard solution

由圖1可知,洗脫液中ε-PL 主要集中在14～20號管,為充分收集目標物,試驗選擇使用13～21號的溶液進行后續分析。

2.2 色譜行為

取2.0 mL 水解液,加入1 mL 雙縮脲試劑(A液0.5 mL,B液0.5 mL),于60 ℃反應10 min后,水解液不變色,說明ε-PL 已水解完全,其水解液的色譜圖見圖2。

由圖2可知,ε-PL的水解產物賴氨酸色譜峰為單一對稱峰,溶液中其他成分均不干擾賴氨酸的測定。

2.3 標準曲線、檢出限和測定下限

按照試驗方法處理并測定ε-PL 標準溶液系列,以ε-PL的質量濃度為橫坐標,其對應的水解產物賴氨酸的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結果顯示:ε-PL 標準曲線的線性范圍為1.0～200 mg·L－1,線性回歸方程為y＝4.503×104x－1.040×102,相關系數為0.999 2。

以3,10倍信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N)和測定下限(10S/N),結果分別為0.02,0.06 g·kg－1。

2.4 精密度和回收試驗

取18份陰性醬油樣品2.0 g,添加適量ε-PL標準溶液,加標濃度水平分別為0.1,0.2,1.0 g·kg－1,每個濃度水平均做6份平行樣,按照試驗方法測定,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD)。結果顯示,3 個加標濃度水平下的回收率分別為83.9%～93.4%,83.9%～97.6%和88.2%～105%,測定值的RSD 為4.0%～6.8%。

2.5 樣品分析

按照試驗方法分析10種不同類型市售醬油,在2種醬油中檢出了ε-PL,檢出率為20%,檢出量分別為0.3,0.5 g·kg－1,說明市售醬油有ε-PL 添加情況,需要引起相關監測部門重視。

本工作采用一種大孔弱酸型離子交換樹脂凈化醬油樣品,分離得到的ε-PL 水解為賴氨酸后用氨基酸分析儀測定。該方法具有靈敏、準確、重現性好等特點,可為保障我國食品質量安全、打擊違規添加提供一定技術保障。