金絲桃苷通過AMPK/mTOR/ULK1 信號通路對腎病綜合征大鼠自噬反應的影響

孔露嬌王 心劉 靜郭曉陽薛明偉

(邢臺市人民醫院腎內科,河北 邢臺 054000)

腎病綜合征(nephrotic syndrome,NS)是由于基底膜受損和腎小球通透性增加等導致的臨床綜合征,多伴隨水腫、蛋白尿和低白蛋白血癥等癥狀,若不能有效糾正,可能導致感染、血栓形成、腎功能衰竭等,威脅患者生命[1]。 盡管多數患者對類固醇有反應,但是易復發,且長期服用類固醇的患者面臨耐藥、全身感染、骨質疏松等并發癥的風險[2],因此,有必要開發新型治療藥物。 據報道,感染、過量藥物等病理生理壓力會導致足細胞損傷,損害腎小球的濾過功能,使得蛋白質等未經過濾直接進入尿液,導致蛋白尿癥狀[3-4]。 與NS 相對應的動物模型是目前國際公認的大鼠阿霉素腎性水腫模型,與臨床NS 患者腎活檢結果相似,是經典的研究NS 的動物模型,基于該模型可篩選治療腎病相關中藥的藥效評價。 足細胞丟失后無法通過增殖恢復數量,但在其脫落前及時給予藥物干預,能讓足細胞恢復到健康狀態[5]。 據報道,自噬功能障礙會導致足細胞損傷,而AMP 活化蛋白激酶/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白/unc-51 樣自噬激活激酶1 (AMP-activated protein kinase/mammalian target of rapamycin/unc-51 like autophagy activating kinase 1, AMPK/mTOR/ULK1)通路的活化可誘導自噬[6],可能是防止足細胞衰老和損傷的保護機制,有望成為NS 的治療策略。 金絲桃苷(hyperoside,Hyp)為桔?？?、豆科、金絲桃科等植物的天然活性物,具有抗炎、調節自噬、抑氧化及腎保護等活性[7]。 研究顯示,Hyp 可通過抑制線粒體分裂減輕足細胞損傷,改善糖尿病腎病大鼠的腎炎癥、腎小球硬化等損傷[8-9],但其對足細胞自噬的調節作用鮮見報道。 本研究擬構建NS 大鼠模型,探討Hyp 對NS 大鼠足細胞自噬和AMPK/mTOR/ULK1 通路的影響,以進一步揭示Hyp 對NS的治療機制,為Hyp 的開發提供基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

32 只雄性SD 大鼠,SPF 級,體重190 ～205 g,6 周齡(北京維通利華實驗動物公司[SCXK(京)2019-0009])。 統一在河北醫科大學實驗動物中心[SYXK(冀)2020-0002]的動物房中分籠飼養,溫度(25.0±1.0)℃、濕度(46.0±2.0)%,晝/夜循環設為12 h/12 h,確保自由獲取水和食物。 本研究通過河北醫科大學實驗動物倫理委員會審批(IACUC-202103008)。 實驗動物飼養和實驗過程中按實驗動物使用的3R 原則給予人道關懷。

1.2 主要試劑與儀器

金絲桃苷(Hyp,≥95%純度)(美國Merck 公司,批號:20200405);AMPK 抑制劑Compound C(CC)(美國MCE 公司,批號:20200811);阿霉素(每支10 mg,深圳萬樂藥業有限公司,批號:1905E1);HE 試劑盒、電泳預制膠(上海碧云天生物技術有限公司,批號:C0105S、P0539S);兔源抗pAMPK、AMPK、微管相關蛋白輕鏈3(microtubuleassociated protein light chain 3,LC3)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、自噬相關蛋白5(Autophagy associated protein 5,Atg5)、Atg7、pmTOR、mTOR 抗體(美國CST公司,批號:#2535、#2532、#4108、#5174、#12994、#8558、#5536、#2983);兔源NPHS2、pULK1、ULK1 抗體、小鼠源Beclin-1 抗體、羊抗兔(Cy3)和羊抗小鼠(Alexa Flour 488)熒光二抗(美國Proteintech 公司,批號:20384-1-AP、29006-1-AP、20986-1-AP、66665-1-Ig、SA00009-2、SA00006-1)。 帶熒光組件的光學顯微鏡(德國Leica 公司);7100 型全自動生化分析儀、透射電子顯微鏡(日本HITACHI 公司);全自動生化分析儀(美國BECKMAN 公司);轉膜及電泳儀器(美國BioRad 公司);7500 型RT-qPCR 儀(美國ABI 公司);MDF-392 型超低溫冰箱(日本SONY 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 NS 大鼠模型建立及分組

將6 周齡SD 大鼠適應喂養至7 周齡,分為正常組(N 組)、腎病綜合征組(NS 組)、金絲桃苷組(Hyp組,60 mg/kg Hyp)、金絲桃苷+AMPK 抑制劑組(Hyp+CC 組,60 mg/kg Hyp+0.2 mg/kg CC),每組8只。 除N 組的8 只外,其他大鼠一次性尾靜脈注射6.5 mg/kg 阿霉素建立NS 大鼠模型[10]。 末次阿霉素注射14 d 后,尾靜脈采血檢測血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)和血清肌酐(serum creatinine,Scr)水平,并收集大鼠24 h 尿液,檢測尿蛋白含量。以建模大鼠BUN 和Scr 水平顯著高于N 組大鼠,且24 h 尿蛋白量＞100 mg 為模型復制成功。 實驗共采用32 只大鼠造模,在造模過程中有5 只大鼠死亡,3 只大鼠造模失敗,共成功造模24 只大鼠,模型成功率為75.0%。 Hyp 劑量(溶在1%羧甲基纖維素鈉中)根據文獻[9]和體表面積法確定為60 mg/kg 且預實驗顯示60 mg/kg Hyp 灌胃可有效減輕NS 大鼠腎損傷;抑制劑CC 劑量根據文獻[11]確定為0.2 mg/kg,N 組和NS 組給予等量1%羧甲基纖維素鈉灌胃和生理鹽水腹腔注射。 每天1 次,連續14 d。

1.3.2 樣本采集

給藥結束后,收集24 h 尿液測定尿總蛋白(urine total protein,UTP);異氟醚麻醉大鼠后從頸動脈針刺采血,4℃離心(3000 r/min,15 min)收集血清,分裝存在-80℃冰箱用于檢測BUN、Scr 及白蛋白(albumin,ALB)水平;處死大鼠,剖腹取腎,剪下左腎縱剖為兩半,一半甲醛固定并做石蠟切片(5 μm)用于HE 染色和免疫熒光染色,另一半戊二醛、鋨酸固定并做超薄樹脂切片用于透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)實驗;剪碎右腎用RIPA 裂解液提取蛋白,分裝、標記并存在-80℃冰箱用于Western blot 實驗。

1.3.3 UTP、BUN、Scr 及ALB 水平測定

取尿液和血清樣本,采用全自動生化分析儀檢測24 h 尿液總蛋白(UTP)、BUN、Scr 和白蛋白(ALB)水平。

1.3.4 HE 染色觀察腎組織病理變化

取腎石蠟切片,進行脫蠟復水后,采用蘇木素染色和伊紅染色,脫水封片后,在光鏡下觀察腎組織病理形態變化。

1.3.5 TEM 觀察腎組織超微結構變化

將腎超薄樹脂切片放在銅網上烙片,用醋酸鈾和檸檬酸鉛行雙重染色,TEM 下觀察腎小球超微結構,并用Image J 軟件分別對每只大鼠某一腎切片電鏡圖的隨機5 個視野下腎小球基底膜、足細胞突等超微結構進行分析,計算平均值。

1.3.6 Western blot 檢測

將20 μg 腎蛋白樣品冰上解凍、凝膠孔上樣、恒壓電泳、 恒流轉聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF) 膜, 取 封 閉 后 的 膜 與 pAMPK、AMPK、GAPDH、LC3、Beclin-1、Atg5、Atg7、NPHS2、pmTOR、mTOR 特異性一抗孵育(4℃過夜),之后與二抗孵育(室溫1.5 h),用化學發光液顯示條帶,在凝膠成像系統的暗盒中曝光拍照,分析相對灰度(以GAPDH 為內參)。

1.3.7 免疫熒光染色

腎石蠟切片經烤片、抗原修復、封閉混雜抗原表位等處理后,滴加小鼠源Beclin-1、兔源NPHS2 特異性一抗孵育(4℃過夜),次日滴加羊抗兔(Cy3)和羊抗小鼠(Alexa Flour 488) 熒光二抗避光孵育50 min,接著加DAPI 染細胞核后封片,熒光顯微鏡下(同樣曝光時間)觀察拍照。 綠色熒光的Beclin-1+小泡為自噬體,紅色熒光的NPHS2+細胞為足細胞,Image J 隨機統計每只大鼠某一腎切片熒光圖的隨機5 個視野腎小球區域的熒光強度,計算平均值。

1.4 統計學方法

數據使用GraphPad Prism 8.0 軟件進行分析和作圖,計量資料用平均數±標準差(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Hyp 對生化指標的影響

相比于N 組,NS 組UTP、BUN、Scr 水平顯著增高,ALB 水平顯著降低(P＜0.05);相比于NS 組,Hyp 組UTP、BUN、Scr 水平顯著降低,ALB 水平顯著增高(P＜0.05);相比于Hyp 組,Hyp+CC 組UTP、BUN、Scr 水平顯著增高,ALB 水平顯著降低(P＜0.05),見表1。 提示Hyp 可改善NS 大鼠腎小球濾過功能。

表1 各組UTP、BUN、Scr 和ALB 水平比較(±s,n=8)Table 1 Comparison of UTP、BUN、Scr and ALB levels among groups

表1 各組UTP、BUN、Scr 和ALB 水平比較(±s,n=8)Table 1 Comparison of UTP、BUN、Scr and ALB levels among groups

注:與正常組比較, *P＜0.05;與腎病綜合征組比較, #P＜0.05;與金絲桃苷組比較, ▲P＜0.05。Note.Compared with N group, *P＜0.05.Compared with NS group, #P＜0.05.Compared with Hyp group, ▲P＜0.05.

組別Groups尿總蛋白(mg)UTP血尿素氮(mmol/L)BUN血清肌酐(μmol/L)Scr白蛋白(g/L)ALB正常組N group 6.28±1.47 4.27±1.05 28.61±2.53 43.89±4.16腎病綜合征組NS group 45.37±5.46* 6.86±1.16* 46.02±4.17* 19.46±2.53*金絲桃苷組Hyp group 20.75±3.52# 4.51±0.73# 31.38±3.76# 37.68±3.17#金絲桃苷+AMPK 抑制劑組Hyp+CC group 39.64±4.27▲ 6.63±0.94▲ 40.42±4.28▲ 25.74±3.02▲

2.2 Hyp 對腎組織形態的影響

如圖1 所示,N 組腎小球、腎小管形態完整、結構清晰;NS 組腎小球體積變大、系膜基質增生、大量腎小管空泡變性;Hyp 組腎形態明顯恢復;與Hyp組比較,Hyp+CC 組腎病理形態損傷加重,腎小管空泡變性增多。 提示Hyp 可減輕NS 大鼠腎組織損傷。

圖1 各組腎組織學觀察(HE 染色)Figure 1 Histological observation of the renal issue among groups (HE staining)

2.3 Hyp 對腎小球超微結構的影響

如圖2,表2 所示,TEM 下可見NS 大鼠基底膜普遍增厚,足細胞腫脹,足突消失、散開或融合。 量化分析顯示,相比于N 組,NS 組基底膜厚度和足突寬度顯著增加(P＜0.05);相比于NS 組,Hyp 組基底膜厚度和足突寬度顯著降低(P＜0.05);相比于Hyp 組,Hyp+CC 組基底膜厚度和足突寬度顯著增高(P＜0.05)。提示Hyp 可減輕NS 大鼠腎組織腎小球損傷。

圖2 各組腎小球透射電鏡圖Figure 2 Representative image of glomerular transmission electron microscope

表2 各組基底膜厚度和足突寬度比較(±s,n=8)Table 2 Comparison of glomerular basement membrane thickness and foot process width among groups

表2 各組基底膜厚度和足突寬度比較(±s,n=8)Table 2 Comparison of glomerular basement membrane thickness and foot process width among groups

注:與正常組比較, *P＜0.05;與腎病綜合征組比較, #P＜0.05;與金絲桃苷組比較, ▲P＜0.05。Note.Compared with N group, *P＜0.05.Compared with NS group,#P＜0.05.Compared with Hyp group, ▲P＜0.05.

組別Groups腎小球基底膜厚度(μm)Glomerular basement membrane thickness足突寬度(μm)Foot process width正常組N group 0.22±0.06 0.14±0.03腎病綜合征組NS group 0.34±0.08* 0.21±0.04*金絲桃苷組Hyp group 0.25±0.05# 0.16±0.04#金絲桃苷+AMPK抑制劑組Hyp+CC group 0.31±0.09▲ 0.20±0.05▲

2.4 Hyp 對自噬蛋白和足細胞蛋白的影響

如圖3 所示,NS 組LC3-Ⅱ/Ⅰ比值、Beclin-1、Atg5、Atg7 和NPHS2 蛋白水平顯著低于N 組(P＜0.05);Hyp 組LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、Atg5、Atg7 和NPHS2 蛋白水平顯著增高于NS 組(P＜0.05);而Hyp + CC 組 LC3-Ⅱ/Ⅰ、 Beclin-1、 Atg5、 Atg7 和NPHS2 蛋白水平顯著低于Hyp 組(P＜0.05)。 提示Hyp 可提高NS 大鼠腎組織自噬水平。

注:與正常組比較, *P＜0.05;與腎病綜合征組比較, #P＜0.05;與金絲桃苷組比較, ▲P＜0.05。圖3 Western blot 檢測LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、Atg5、Atg7 及NPHS2 蛋白表達Note.Compared with N group, *P＜0.05.Compared with NS group, #P＜0.05.Compared with Hyp group, ▲P＜0.05.Figure 3 The level of LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、Atg5、Atg7 and NPHS2 protein detected by Western blot

2.5 免疫熒光觀察自噬體和足細胞在腎小球中的定位

如圖4、圖5 所示,足細胞采用NPHS2 抗體標記,呈紅色熒光;自噬體采用Beclin-1 抗體標記,呈綠色熒光,綠色熒光主要集中在紅色熒光附近。 NS組NPHS2、Beclin-1 相對熒光強度弱于N 組(P＜0.05);Hyp 組NPHS2、Beclin-1 蛋白相對熒光強度強于NS 組(P＜0.05);Hyp+CC 組NPHS2、Beclin-1相對熒光強度弱于Hyp 組(P＜0.05)。 提示Hyp 可增強NS 大鼠腎組織足細胞自噬。

圖4 自噬體和足細胞標記蛋白的免疫熒光染色圖Figure 4 Representative images of immunofluorescence staining for autophagosome and podocyte marker proteins

注:與正常組比較, *P＜0.05;與腎病綜合征組比較, #P＜0.05;與金絲桃苷組比較, ▲P＜0.05。圖5 各組NPHS2、Beclin-1 相對熒光強度比較Note.Compared with N group, *P＜0.05.Compared with NS group,#P＜0.05.Compared with Hyp group, ▲P＜0.05.Figure 5 Comparison of relative fluorescence intensity of NPHS2 and Beclin-1 among groups

2.6 Hyp 對AMPK/mTOR/ULK1 通路的影響

如圖6 所示,相比于N 組,NS 組p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1 比 值 顯 著 降 低, p-mTOR/mTOR 比值顯著增加(P＜0.05);相比于NS 組,Hyp組p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1 水平顯著增加,p-mTOR/mTOR 比值顯著降低(P＜0.05);相比于Hyp 組,Hyp+CC 組p-AMPK/AMPK、p-ULK1/ULK1比值顯著降低,p-mTOR/mTOR 比值顯著增加(P＜0.05)。 提示Hyp 可激活NS 大鼠腎組織AMPK/mTOR/ULK1 通路。

注:與正常組比較, *P＜0.05;與腎病綜合征組比較, #P＜0.05;與金絲桃苷組比較, ▲P＜0.05。圖6 Western blot 檢測AMPK/mTOR/ULK1 通路蛋白水平Note.Compared with N group, *P＜0.05.Compared with NS group, #P＜0.05.Compared with Hyp group, ▲P＜0.05.Figure 6 Level of AMPK/mTOR/ULK1 pathway protein deteced by Western blot

3 討論

NS 腎損傷涉及炎癥、氧化、自噬等參與,類固醇等藥物為主要治療藥物,但對器官實質性損傷的改善效果有限。 阿霉素是一種含醌式結構的抗腫瘤藥物,在體內藥物代謝酶的作用下,形成半醌自由基,半醌自由基與氧化反應生成超氧陰離子和羥自由基,兩者可通過膜的脂質過氧化作用,對腎造成損傷,從而誘發腎小球上皮細胞脂質過氧化反應,破壞濾過膜結構和功能,產生蛋白尿,并導致腎小管和腎小球發生病理變化[10]。 尾靜脈注射阿霉素是制作NS 大鼠模型常用的造模方法,具有操作簡單、成模較快、動物死亡率低等優點,已被廣泛應用于NS 治療藥物的藥效學研究[12]。 在本研究中,模型組大鼠在造模后第15 天24 h 尿蛋白含量、BUN和Scr 水平顯著高于正常大鼠,表明成功復制阿霉素腎病模型。 Hyp 已被證實具有保護腎細胞免于氧化損傷[13]、抑制缺血再灌注造成的腎細胞凋亡[7]、預防糖尿病相關腎小球基底膜損傷[14]等作用,因此Hyp 可作為腎保護藥物。 本研究與Zhou 等[9]研究一致,Hyp 可降低NS 大鼠UTP、BUN、Scr 和ALB 水平,減輕腎小球體積變大、腎小管萎縮、足細胞腫脹、足突消失等損傷,表明Hyp 可恢復足細胞形態,提高腎小球濾過功能,對NS 大鼠腎損傷有保護作用。

足細胞為一類有很多足突的無法增殖且高度特化上皮細胞,包圍著腎小球基底膜、毛細血管等組成濾過屏障,其穩態和完整性依賴于較高的基礎自噬水平[15]。 研究已指出,自噬水平的變化與足細胞穩態密切相關,并參與多種腎病的發展[16-17]。 細胞質中的LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺結合并轉變為膜型LC3-Ⅱ,是自噬體膜形成的關鍵標志[18];在ATG家族蛋白的作用下自噬體膜進一步延伸[18];另外,Beclin-1 也可通過招募其他自噬蛋白參與自噬過程的啟動[19]。 因此,LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1 和ATG 蛋白表達增加提示自噬激活。 在本研究中,NS 大鼠LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、Atg5、Atg7 蛋白水平降低;同時足細胞特異蛋白NPHS2 表達降低。 推測NS 組大鼠的腎自噬活性不足,導致受損細胞器、蛋白質等在足細胞中不斷積累,損害足細胞。 而給予Hyp 干預后,LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、Atg5、Atg7 蛋白水平和NPHS2 表達均升高,提示Hyp 可增強NS 大鼠自噬活性,恢復足細胞穩態,減輕足細胞損害。 另外,免疫熒光半定量分析顯示,腎組織中NPHS2 和Beclin-1 的熒光總量均呈NS 組、Hyp 組、N 組依次增 高 趨 勢, 與 Western blot 結 果 趨 勢 相 符, 且Beclin-1+的綠色自噬體主要分布在NPHS2+的紅色足細胞周圍,佐證了足細胞是自噬活性增強的主要受益者。

自噬可作為適應性應激,促進對有害物質的清除,減輕細胞損傷或死亡[20]。 AMPK/mTOR/ULK通路是重要的自噬通路之一,其中AMPK 為主要的能量傳感器,通過直接磷酸化并活化ULK1 來維持細胞的能量代謝、促進自噬并維持細胞穩態[21]。 而mTOR 也通過磷酸化活化,活化的mTOR 可抑制ULK1 的激活,是自噬過程的關鍵負調節劑[22]。AMPK/mTOR 通路已被證實參與腎病大鼠的自噬進程,AMPK/mTOR 通路的激活有利于自噬體的形成、足細胞的恢復和腎病理損傷的改善[11,23]。 Hyp 對自噬具有雙重調節作用,一方面Hyp 可通過抑制AMPK-ULK1 介導的自噬來減輕D-半乳糖誘導的腎衰老和損傷[24];另一方面Hyp 可通過激活沉默信息調節因子1(silent information regulator 1,Sirt1)/AMPK 信號通路,促進自噬,改善糖尿病骨質疏松大鼠骨代謝[25];在皮膚癌中,Hyp 可激活AMPK 信號,誘導癌細胞自噬和凋亡,抑制增殖[26]。 本研究中,給予Hyp 干預后大鼠p-AMPK/AMPK 和p-ULK1/ULK1 水平增加,p-mTOR/mTOR 水平降低,結合Hyp 可增加LC3-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1 和ATG 蛋白水平的結果,提示Hyp 可促進NS 大鼠體內的AMPK/mTOR/ULK1 自噬通路活化。 此外,在Hyp 的基礎上采用AMPK/mTOR 通路抑制劑CC 抑制AMPK/mTOR/ULK1 通路的活化,結果顯示,CC 可減弱Hyp 的足細胞保護作用及促自噬作用,部分抵消Hyp 對NS 的改善效果,驗證了AMPK/mTOR/ULK1通路的活化在Hyp 保護NS 大鼠足細胞損傷中發揮了積極作用。 本研究結果表明Hyp 在NS 中通過激活AMPK 信號發揮促自噬作用,推測Hyp 對自噬是發揮抑制或促進作用,可能與疾病種類及病程有關,不同疾病或同一疾病在不同時期其自噬水平是不同的。

綜上所述,Hyp 可通過促進腎細胞自噬,減輕足細胞損傷實現對NS 的治療作用,其中AMPK/mTOR/ULK1 通路為其促進自噬的重要靶點。 下一步將分離足細胞,進一步探討Hyp 對足細胞自噬的作用機制。