基于底物消耗規律優化乳酸乳球菌增殖發酵工藝

胡雙露,毛丙永,唐鑫,張秋香,崔樹茂,張灝

(江南大學 食品學院,江蘇 無錫,214122)

乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)是乳球菌屬中重要的模式菌,一般認為乳酸乳球菌包括了乳酸乳球菌乳酸亞種、乳酸乳球菌乳脂亞種和乳酸乳球菌霍氏亞種,傳統上被用作發酵乳制品(如奶酪、酸奶油和酪乳)生產的發酵劑[1]。2022年被中國衛計委列入《可用于食品的菌株名單》。近年來,乳酸乳球菌許多功能特性不斷被挖掘出來,如緩解結直腸癌[2]、腸應激綜合征[3]、便秘[4]等癥狀,它與人體腸道健康息息相關,越來越多地在乳品、醫療醫藥、動物飼料等行業被應用。

乳酸乳球菌必須達到一定的活菌數才能在體內發揮相應的功效,所以需要通過優化培養基和培養工藝來提高培養密度。目前使用最多的是恒pH培養,但是存在滲透壓抑制和底物不足等問題。培養基的滲透壓與溶質的量直接相關,而培養基中的底物濃度直接決定了菌株發酵最終的生物量,但如果初始底物濃度過高反而會抑制菌株的生長,如何在兩者之間尋找一個平衡點就顯得非常重要。已知培養基中的無機鹽在分批培養時主要起到中和作用,而在恒pH分批培養時,則可以不添加無機鹽成分以降低初始培養基的滲透壓。氮源利用率比較低,培養基中底物不能夠全部用來增殖導致底物不足抑制產生;而不同菌株因為生境的不同,其蛋白酶解系統不同,對不同氮源的偏好性也不同,因此需要篩選或制備一種可高效利用的氮源,使底物能夠物盡其用,變相去提高菌株的耐滲能力。

傳統的優化方法主要是通過單因素試驗或者正交試驗篩選更優的底物和培養條件,然而卻無法準確解釋底物對菌株增殖的影響。本研究通過底物解析,尋找或制備最優的碳氮源后基于耐滲透壓能力和碳氮消耗比去配制培養基,使得底物盡可能被菌株利用,結合培養工藝優化,大幅提高發酵液中的生物量水平。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

2株乳酸乳球菌CCFM1093、CCFM1032均來自江南大學食品微生物保藏中心(無錫,中國),該菌株在MRS培養基中培養,將培養基的初始pH值調節到6.2～6.4,并在115 ℃下高溫滅菌20 min,之后在37 ℃恒溫培養箱中進行培養。

1.1.2 試劑

蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、葡萄糖、CH3COONa、吐溫-80、K2HPO4、檸檬酸二銨、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、NaCl、半乳糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖,國藥集團化學試劑有限公司;安琪酶母浸粉FM 502、安琪酵母浸粉FP 351、安琪酵母浸粉FA 31、安琪酵母浸粉FM 528、安琪酵母浸粉FM 803、酵母浸粉888、酵母浸粉528、酵母浸粉FM 405、酵母蛋白103、PRO 021 YEAST EXTRACT、Nucel 786 MG酵母抽提物粉、Nucel 875 MG 酵母抽提物粉、SIGMA-ALDRI、安琪大豆蛋白胨FP 410、胰蛋白胨、酪蛋白胨、魚骨蛋白胨FP351、牛骨蛋白胨、安琪蛋白胨(牛骨)FP 326、牛肉浸粉、魚粉蛋白胨,安琪酵母股份有限公司;葡萄糖試劑盒,上海榮盛生物藥業有限公司。

1.2 儀器與設備

恒溫培養箱,上海森信實驗儀器有限公司;pH計、電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;高溫高壓滅菌鍋,日本SANYO公司;超凈工作臺,上海智誠分析儀器制造有限公司;迷你平行發酵罐,迪比爾生物工程有限公司;冰點滲透壓測定儀,德國l?ser公司;真空冷凍干燥機,西班牙Telstar公司;落地式離心機,賽默飛世爾公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養基的配制

MRS液體培養基(g/L):蛋白胨10,牛肉膏10,酵母浸粉5,葡萄糖20,CH3COONa 5,吐溫-80 1 mL/L,K2HPO42.0,檸檬酸二銨2.0,MgSO4·7H2O 0.1,MnSO4·H2O 0.05,pH 6.2～6.4,115 ℃滅菌20 min。

MRS固體培養基:在MRS液體培養基的基礎上添加1.5～2.0 g/L的瓊脂粉。

篩氮分析培養基(g/L):氮源1、葡萄糖6、K2HPO410、Na2HPO410、MgSO4·7H2O 0.25、MnSO4·H2O 0.05、吐溫-80 1 mL/L,pH 6.0,115 ℃滅菌20 min。

滲透壓培養基:在MRS液體培養基的基礎上,添加不同濃度的NaCl溶液配制成梯度滲透壓的液體培養基,滲透壓為300～3 000 mOsm/kg。

1.3.2 菌株活化與培養

將在-80 ℃冰箱中凍藏的乳酸乳球菌CCFM 1093和CCFM 1032,在MRS固體平板上用接種環三區劃線純化,在溫度為37 ℃的恒溫培養箱下生長24～36 h,挑取單個菌落轉移至5 mL新的液體培養基中,37 ℃下生長24 h,再以2%(體積分數)接種量傳代至新的液體培養基中,在37 ℃條件下生長24 h,連續活化3～5次后作為種子培養液。

1.3.3 菌株碳源偏好性分析

采用20 g/L葡萄糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖作為MRS培養基中的碳源,其余條件不變,按照2%(體積分數)的比例接種第三代活化對數末期的菌株于培養基中,置于37 ℃恒溫培養箱中培養,使用分光光度計測定菌株穩定期的OD600。

1.3.4 菌株氮源偏好性分析

將市售氮源分為四大類(表1),每類挑選一種按照1.3.1節的方法配制篩氮分析培養基,然后將表現較好的一類的所有氮源再進行二次篩選,測定乳酸乳球菌在不同氮源的培養基下的生長曲線及對數期代時。

表1 氮源分類

代時是指菌株在生長過程中平均每分裂一次所需要的時間,其代時能夠直接反映生長的快慢,代時越短表明生長的越快。代時計算方法為:取指數生長期的數據,以菌株生長時間為橫坐標,以lg(OD600, 2)為縱坐標,繪制曲線,計算代時,線性斜率倒數即為代時。

1.3.5 酪蛋白肽的制備

采用復合蛋白酶對酪蛋白進行水解,酶解條件如表2所示,采用pH-STAT法使體系pH穩定在7±0.05,不斷攪拌使得充分酶解30 min,反應結束后立即沸水浴10 min使體系中的酶失活,待冷卻到室溫后,將體系pH調整至4.6使得未水解的酪蛋白沉淀,然后離心(8 000×g,20 min)取上清液備用。將收集到的上清液在透析袋(MD25-100)中透析48 h,每6 h換1次水,除去體系中的游離氨基酸,截留下所需要的多肽,凍干成粉作為氮源按照不同比例添加到發酵培養基中,測定發酵液穩定期的活菌數。

表2 不同蛋白酶酶解酪蛋白條件

1.3.6 生長限制性微量元素

在1.3.1節篩氮分析培養基的基礎上配制,其中氮源為1.3.4節中篩選出的最佳氮源,分為4組微量元素含量不同的培養基;A組:添加MnSO4·H2O 0.06 g/L;B組:添加MgSO4·7H2O 0.087 g/L;C組:添加MgSO4·7H2O 0.043 g/L、MnSO4·H2O 0.03 g/L;D組:不添加微量元素,其余成分均不變,調節pH 6.2～6.4,115 ℃滅菌20 min后按照2%(體積分數)的比例接種種子液于培養基中,測定其穩定期的OD600。

1.3.7 碳氮消耗比的測定

采用1.3.1節篩氮分析培養基,其中氮源為最佳氮源,以2%(體積分數)的接種量接種在5 mL培養基中,37 ℃恒溫培養,每隔2 h取樣測定生長曲線以及發酵液中葡萄糖的含量,葡萄糖含量采用葡萄糖試劑盒進行測定。

1.3.8 耐滲透壓能力測定

將活化后的種子液體以2%(體積分數)的接種量接種在按照1.3.1節配制的梯度滲透壓的液體培養基中,在恒溫培養箱中生長12～18 h,每隔2 h取樣測定發酵液的OD600,根據生長曲線計算其對數期的代時。

1.3.9 最適生長pH的測定

根據生長速率初始被抑制碳氮消耗比和菌株的耐滲透壓能力確定發酵培養基的初始碳氮源的最適添加量,115 ℃滅菌20 min后,調節轉速為300 r/min,溫度為37 ℃,分別設置pH為5.0、5.5、6.0、6.5,以2%(體積分數)的接種量將種子液接種到平行發酵罐中培養,在穩定期取樣測定發酵液中的活菌數。

1.3.10 數據統計與分析

所有實驗至少重復3次,結果表示為平均值±標準差。使用SPSS 22.0軟件(SPSS Inc.,Chicago,Illinois,USA)分析數據。并進行了單因素方差分析(ANOVA)和DUNCAN多重比較完成了差異顯著性分析,P<0.05值的差異被認為具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 底物利用偏好性

2.1.1 碳源的利用偏好性分析

乳酸乳球菌CCFM 1093和CCFM 1032在5種不同碳源的培養基中的生長情況如圖1所示,結果顯示2株菌對不同糖類的偏好性不盡相同,對同一糖類的偏好性也存在差異,但在葡萄糖為碳源的培養基中穩定期的生物量均為最大,分別為5.808和3.241。葡萄糖作為碳源時利用率更高,因此鑒于乳酸乳球菌對葡萄糖的高親和力和高增殖效率,綜合考慮后,后續實驗將會采用葡萄糖作為培養基最佳的碳源。

a-乳酸乳球菌CCFM 1093;b-乳酸乳球菌CCFM 1032

2.1.2 氮源偏好性分析

MRS中的氮源通常不能被完全利用,當培養基中的碳源不足或者滲透壓抑制作用導致菌株停止生長時,就會導致氮源的浪費。因此就需要挑選合適的氮源,采用篩氮培養基,提高其中的碳氮比,低濃度的碳氮源也能確保培養基中的pH不會降低到抑制菌株生長的水平,保證菌株停止生長時,培養基中仍有充足的碳源和適宜的pH,分析哪種氮源可以更好地提供氨基酸和肽段。將不同的市售氮源分為四大類:微生物類氮源、植物類氮源、乳基類氮源和動物類氮源(表1),挑選其中的安琪酵母浸粉FM 803、PRO 021 YEAST EXTRACT、安琪大豆蛋白胨FP 410、酪蛋白胨、安琪蛋白胨牛骨FP 326進行初次篩選。

采用單位質量氮源的細胞增殖量結合代時評估對氮源的利用率,圖2結果顯示不同類別的氮源對菌株的生長和代時有顯著性差異,其中安琪酵母浸粉FM 803作為微生物類氮源顯示了最高的親和力,生物量為最大的同時對數期代時也為最小。

a-CCFM 1093不同氮源下的生長曲線;b-CCFM 1093不同氮源下的對數期代時;c-CCFM 1032不同氮源下的生長曲線;d-CCFM 1032不同氮源下的對數期代時

在對微生物類氮源進行第二次篩選時,圖3的結果表明安琪酵母浸粉FM 803相較于其他氮源,其對數期代時具有顯著性差異,表明相較于其他微生物類氮源更具有競爭力。有研究表明,乳酸乳球菌的蛋白水解系統相關基因表達量不僅會隨著生長時期的延長而增大,在對數期達到最大值,而且還受到外界環境和肽供應的影響,更偏好于利用含寡肽的氮源。有研究通過高效液相色譜法對不同氮源氨基酸和肽的組成特性進行了分析,發現安琪酵母浸粉FM 803分子質量2 kDa以下占比為99.3%,含有豐富的游離氨基酸和多肽,這也和微生物類氮源中含有較多的寡肽段的結果相吻合[5-6];而且酵母浸粉中含有嘌呤堿和嘧啶堿以及維生素B,如煙酸、葉酸、泛酸等,這些都是乳酸菌生長所必須的[7]。

a-CCFM 1093不同氮源下的生長曲線;b-CCFM 1093不同氮源下的對數期代時;c-CCFM 1032不同氮源下的生長曲線;d-CCFM 1032不同氮源下的對數期代時

2.1.3 酪蛋白肽對乳球菌生長的影響

不同菌株對氮源的偏好性不同是由其蛋白水解系統決定的,菌株在不斷的進化過程中,形成了不同的蛋白水解系統水解外界蛋白質產生肽段和氨基酸來滿足自身生長需要。目前,蛋白水解系統在乳酸乳球菌中研究的最為清楚,主要分為3個部分:水解酪蛋白的胞外蛋白酶、將水解后的多肽轉移至胞內的轉運系統以及可水解成游離氨基酸的多種肽酶[8]。ST-GELAIS等[9]報道氮源中肽鏈的長度是影響乳酸菌生長活性的重要因素;植物乳桿菌缺乏細胞包膜蛋白酶不能夠水解利用牛奶蛋白,短鏈肽相比長鏈肽更容易被植物乳桿菌吸收[10];雙歧桿菌由于缺乏細胞壁蛋白酶,也會更偏好于利用游離氨基酸和小分子肽[11],KUNJI等[12]發現乳酸菌對于小肽的吸收利用還要高于游離氨基酸。

張清麗[13]的研究發現使用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶酶解得到的酪蛋白肽對于乳酸菌具有明顯的促生長作用。因此,為了進一步提高菌株發酵的活菌數,采用牛奶中的酪蛋白為底物,采用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶復合酶酶解制備酪蛋白肽,驗證酪蛋白肽對乳酸菌增殖的影響。

按照表2的條件采用復合胰蛋白酶和木瓜蛋白酶對酪蛋白進行水解,將水解后的產物作為多肽類氮源使用。氮源總質量采用30 g/L,按照酪蛋白肽∶安琪酵母浸粉FM 803=1∶3、1∶2、1∶1、2∶1和3∶1的質量比作為發酵培養基的氮源,在穩定期取樣,生理鹽水梯度稀釋后平板計數去比較不同多肽含量對菌株增殖的影響。

圖4的結果顯示了當酪蛋白肽∶安琪酵母浸粉=1∶2時,乳酸乳球菌的增殖量最多,活菌數分別為(6.80±0.46)×1011和(6.31±0.29)×1011CFU/mL。VERMEULEN等[14]研究了菌株不同生長時期肽的供應對蛋白水解系統基因表達的影響,發現在發酵過程中隨著肽含量的增大,PepT胞內酶的表達水平在一定范圍內有顯著升高,而Opp和DtpT肽轉運系統的基因表達量降低了17倍左右,這和本研究中酪蛋白肽含量過高反而出現了抑制菌株生長的情況相符合,并且酪蛋白肽比例的提高也降低了氮源中其他營養物質的含量,后續實驗氮源采用酪蛋白肽和安琪酵母浸粉FM 803復合氮源,質量比為1∶2。

a-乳酸乳球菌CCFM 1093;b-乳酸乳球菌CCFM 1032

2.1.4 生長限制性微量元素分析

金屬離子在細胞中發揮著十分重要的功能,如作為輔酶因子參與細胞代謝、結構穩定金屬蛋白以及與蛋白結合作為信號轉導因子、調控基因的表達等,因此維持細胞內的金屬離子的相對穩定對細菌的生存至關重要[15]。Mn2+是乳酸菌和其他生物生長所必須的生長因子,可以作為乳酸脫氫酶和其他酶的關鍵組成部分,Mn2+的加入還對超氧化物歧化酶的活性至關重要,可以保護乳酸菌免受活性氧的直接和間接毒性作用[16];Mg2+廣泛參與乳酸菌的葡萄糖代謝,是葡萄糖代謝途徑中包括乙酸激酶、半乳糖激酶、磷酸甘油激酶、轉酮醇酶和葡糖激酶在內的多種酶的酶促因子[17];已有研究表明Mn2+和Mg2+相較于Fe2+、Zn2+、Ca2+和Cu2+在菌株增殖方面更重要[18],因此本研究挑選Mn2+和Mg2+研究其濃度對菌株增殖的影響。

缺乏Mn2+會導致植物乳桿菌的發酵明顯變慢,Mn2+的添加可以增強乳酸脫氫酶的活性,其作為“代謝開關”可以調節丙酮酸到乳酸和其他代謝途徑的代謝通量,Mg2+的添加還可以促進ATP的合成,提高植物乳桿菌的發酵活性[19-20]。如圖5所示,Mn2+、Mg2+均含有的的培養基其穩定期的OD600明顯優于單一添加微量元素和空白組,說明這2種微量元素都是菌株生長所需要的。

圖5 不同微量元素含量對菌株生長的影響

2.2 發酵工藝優化

2.2.1 碳氮消耗比

上述的實驗得到了最優的底物,而碳氮比對菌株增殖的影響也必須闡明。碳氮比會直接影響微生物的生長和代謝[21],在乳酸菌恒pH發酵過程中,菌株生長會不斷消耗發酵培養基中的碳源和氮源,當碳源或氮源有一方不足時,菌株就會停止生長,碳氮比過高過低不僅會造成底物的浪費,還會抑制菌株生長。王玉林等[22]和高欣偉等[23]的研究已經證實了,在乳酸菌的發酵培養中,當初始發酵培養基中碳源和氮源的比例為生長速率被抑制時的碳氮消耗比時,增殖效率最高。按照1.3.6節的方法測定乳酸乳球菌CCFM 1093和CCFM 1032生長速率被抑制時的碳氮消耗比,碳源使用葡萄糖,氮源使用上述復合氮源。圖6的結果顯示乳酸乳球菌CCFM 1093和CCFM 1032在生長速率被抑制時的碳氮消耗比分別為(2.56±0.06)∶1和(2.07±0.05)∶1。

a-乳酸乳球菌CCFM 1093;b-乳酸乳球菌CCFM 1032

2.2.2 菌株在不同滲透壓條件下的生長

滲透壓是指溶液中溶質所產生的機械壓力,滲透壓的大小是由溶液中所含的分子或離子的質點數決定的,高滲溶液會使細胞發生質壁分離,而低滲溶液則會使細胞吸水膨脹,形成很高的膨壓,這對于較脆弱的細胞來說是致命的。微生物不斷的進化已經形成了一套可以有效抵御外界高滲透壓的策略,例如可以通過糖原等大分子貯藏物的合成或分解來調節胞內的滲透壓。如圖7所示,當滲透壓過高時會抑制生長,因此需要盡可能地降低發酵培養基的初始滲透壓,也就是說要盡可能降低底物碳氮源的濃度,然而菌株最終的生物量是和底物的量成正比的,因此需要平衡這兩者對菌株生長的影響。通過加入NaCl配制梯度滲透壓的培養基,測定菌株在不同滲透壓的生長曲線和代時,確定其耐滲能力。

a-CCFM 1093不同滲透壓下的生長曲線;b-CCFM 1093不同滲透壓下的對數期代時;c-CCFM 1032不同滲透壓下的生長曲線;d-CCFM 1032不同滲透壓下的對數期代時

乳酸乳球菌CCFM 1093較CCFM 1032具有更強的耐滲能力,前者在滲透壓低于1 500 mOsm/kg時生長速率不受影響,且滲透壓繼續增高的情況下雖然生長受到一定程度抑制但沒有被完全抑制,菌株依然可以得到生長。在發酵過程中,菌株消耗葡萄糖積累酸根,即滲透壓增加,但發酵前期生物量較少,底物消耗和滲透壓增加亦比較慢,所以培養基濃度控制在不影響菌株生長的濃度,發酵前期對菌株生長的影響不大;待菌達到一定數量且進入對數生長期后期,糖的消耗和滲透壓的積累是個較快的增加過程,此時發酵體系的滲透壓有可能影響菌的生長,但如果尚未達到完全抑制滲透壓,對最高生物量的影響較小。根據前期研究成果[23-24],該菌要達到高生物量,其培養基濃度可以提高至其滲透壓達到或略低于1 500 mOsm/kg(生長速率被抑制時的滲透壓)。對于乳酸乳球菌CCFM 1032,在滲透壓低于1 200 mOsm/kg時,生長速率不受影響,其培養基的濃度可以提高至滲透壓達到或略低于1 200 mOsm/kg。

2.2.3 最適生長pH

各類微生物都有其生長適宜的pH范圍,乳酸菌為5.0～7.0。乳酸菌在生長代謝過程中會產生引起培養基pH變化的代謝產物,影響酶的活性,如果不對此進行調節,就會抑制菌株生長甚至殺死菌株。而在恒pH培養時就需要尋找最適合菌株生長的pH,從而提高發酵生物量,而且適宜的pH還可以提高菌株細胞膜不飽和脂肪酸的比例和環狀脂肪酸的含量,能夠在后續的凍干過程中提高存活率[25]。

根據2.2.1節和2.2.2節的結果分析與前期研究成果,菌株培養要達到最高增殖效率,發酵培養基的碳氮比為生長速率被抑制時的碳氮消耗比,發酵培養基的濃度為初始滲透壓低于但接近菌株生長速率被抑制時的滲透壓[25],因此分別配制乳酸乳球菌CCFM1093和乳酸乳球菌CCFM 1032的發酵培養基為:葡萄糖137 g/L、復合氮源53 g/L、MgSO4·7H2O 0.043 g/L、MnSO4·H2O 0.03 g/L、吐溫-80 1 mL/L(滲透壓1 200 mOsm/kg);葡萄糖106 g/L、復合氮源51 g/L、MgSO4·7H2O 0.043 g/L、MnSO4·H2O 0.03 g/L、吐溫-80 1 mL/L(滲透壓1 000 mOsm/kg)。然后在37 ℃條件下控制不同pH培養,研究pH對最高生物量的影響。

圖8的結果顯示了乳酸乳球菌CCFM 1093和CCFM 1032在pH為5.5的條件下,其發酵液活菌數最高,分別達到了(1.01±0.06)×1012CFU/mL和(9.78±0.38)×1011CFU/mL。另研究分析了培養過程中發酵體系滲透壓的變化,在發酵前期滲透壓未達到各自的生長速率抑制滲透壓,菌株生長不受影響;在發酵后期,發酵體系的滲透壓得到較高的增幅,菌株發酵終點時乳酸乳球菌CCFM 1093和CCFM 1032的發酵體系滲透壓分別為(2 716±12) mOsm/kg和(2 313±17) mOsm/kg,雖對菌株生長速率有影響,但未完全抑制其生長。測定了發酵終點時殘糖的含量,分別為(1.90±0.17) g/L和(2.27±0.26) g/L,說明培養基的營養成分得到了高效利用。

圖8 菌株在不同pH下發酵活菌數

3 結論

乳酸乳球菌對葡萄糖的利用率最高;在氮源方面,更傾向于利用酵母浸粉FM 803;另外,微量元素Mn2+和Mg2+都是乳酸乳球菌生長所需要的。乳酸乳球菌在恒pH分批培養時滲透壓抑制和底物不足是制約生長的主要原因;乳酸乳球菌CCFM 1093在滲透壓達到1 500 mOsm/kg時生長速率被抑制,乳酸乳球菌CCFM 1032在滲透壓達到1 200 mOsm/kg時生長速率被抑制。乳酸乳球菌CCFM 1093和CCFM 1032碳氮消耗比分別為2.56∶1和2.07∶1。

發酵培養基的碳氮比為生長速率被抑制時的碳氮消耗比,發酵培養基的濃度為初始滲透壓低于但接近菌株生長速率被抑制時的滲透壓,菌株培養可以達到較高增殖效率。采用胰蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解制備酪蛋白肽作為氮源添加可提高發酵生物量。乳酸乳球菌CCFM 1093的最優培養基:葡萄糖137 g/L、復合氮源53 g/L、MgSO4·7H2O 0.043 g/L、MnSO4·H2O 0.03 g/L、吐溫-80 1 mL/L;乳酸乳球菌CCFM 1032最優培養基(g/L):葡萄糖106 g/L、復合氮源51 g/L、MgSO4·7H2O 0.043 g/L、MnSO4·H2O 0.03 g/L、吐溫-80 1 mL/L。