基于COⅠ基因的5種新疆土著魚類DNA條形碼鑒定及聚類分析

強壯,趙年樺,張旦旦,,秦凱瑞,聶竹蘭*,李立偉,鐘馨,胡仁云

(1 塔里木大學生命科學與技術學院,新疆 阿拉爾 843300)(2 塔里木大學動物科學與技術學院,新疆 阿拉爾 843300)(3 武漢中科瑞華生態科技股份有限公司,湖北 武漢 430000)

裂腹魚亞科屬鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae),共11屬,中國境內存在10屬,主要分布于青藏高原及其附近水域,有明顯的地域特征性[1]。扁吻魚(Aspiorhynchuslaticeps)[2]、塔里木裂腹魚(Schizothoraxbiddulphi)[3]、寬口裂腹魚(Schizothoraxeurystomus)[4]、斑重唇魚(Diptychusmaculatus)[5]等眾多裂腹魚亞科魚類是新疆塔里木河流域重要的土著魚[6],近年來,水庫堤壩的大量修建,嚴重破壞土著魚類產卵場、洄游通道以及索餌場,加之性成熟晚、繁殖力低、生存和繁殖環境要求高等眾多因素制約,這些魚類的野外種群數量急劇下降[7-8]。扁吻魚于1988年在《中國瀕危動物紅皮書》中被列為國家Ⅰ類重點保護水生野生動物[9];斑重唇魚于2021年列入《中國國家重點保護野生動物名錄》二級[10];塔里木裂腹魚被列為新疆維吾爾自治區Ⅱ類重點保護水生野生動物,又于2021年被列入國家二級重點保護水生野生動物[11]。

高原鰍屬魚類屬鰍科(Cobitidae)、條鰍亞科(Nemachilinae)、高原鰍屬(Triplophysa)[12],在青藏高原地區廣泛分布,隨著全球氣候變暖,導致高原湖泊、水庫、河流的水位逐年下降,水利工程建設及水域資源過量開發,許多高原鰍物種都失去了生存條件[13]。

DNA條形碼技術通過利用生物體內能代表該物種的一段或幾段共有DNA序列[14-15],再結合形態學鑒定分析,即可實現新物種、潛藏種以及物種有效性的鑒定[16]。正確的物種鑒定對資源管理和生態保護起著顯著作用[17],尤其是在漁業資源匱乏地區,盡早采取系統科學的技術措施保護本地區的漁業資源變得尤為重要[18-19]。然而裂腹魚亞科中很多種類間的形態差異極為微小[20],同屬物種間的鑒定十分困難,過去簡單的形態學分析因其具有低效率、低準確率、對鑒定者實踐經驗和技術手段過于依賴等局限性,已不再適應于當今時代科技發展水平的需求[17]。隨著分子技術的快速發展、PCR技術的普及和測序成本的大幅降低,DNA條形碼技術應時而生[16],在出現后的短短20余年內不斷糾正物種鑒定中存在的同種異名或異種同名問題[21-22]。楊天燕等[2]基于COⅠ基因比較和分析了扁吻魚和塔里木裂腹魚遺傳差異,表明兩者間的親緣關系較特化等級更高的新疆裸重唇魚、斑重唇魚更近。海薩·艾也力汗等[23]通過COⅠ基因對塔里木河流域4種裂腹魚間的親緣關系進行分析鑒定,表明塔里木裂腹魚與厚唇裂腹魚、重唇裂腹魚、寬口裂腹魚之間存在豐富的基因交流,并且表明這4種裂腹魚可能尚未達到物種分化程度,仍屬同一物種的不同亞種。

本研究通過對新疆5種土著魚類的DNA條形碼進行比較分析,驗證COⅠ基因對當地土著魚類物種鑒定的有效性,以此為DNA條形碼數據庫的建立奠定基礎,并為該地區魚類生物資源調查以及建立健全的種質資源保護體系提供理論參考依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2021年4月于烏恰縣克孜勒河采集樣品魚30尾、于拜城縣克孜爾水庫采集樣品魚3尾,采集工具為地籠網(網長10 m,33節20洞,框架2 cm×3 cm,網目4 mm),樣品分類鑒定參照《新疆魚類志》[9]。使用MS-222進行麻醉,取部分尾鰭浸泡在裝有無水乙醇的離心管中,放入-20 ℃冰箱保存,以備后續的分子生物學鑒定。

1.2 新疆5種土著魚類DNA提取、PCR擴增及測序

使用DNeasy Blood &Tissue Kit試劑盒提取基因組DNA,提取的DNA置于-20 ℃冰箱保存備用。PCR擴增引物如表1所示,反應體系為25 μL,包含2.5 μL 10×buffer,2 μL dNTPs (2.5 mmol/L),正反引物(10 μmol/L)各0.5 μL,0.5 μLTaq酶,DNA模板1 μL,其余用ddH2O補足至25 μL。擴增條件為95 ℃預變性5 min,循環數為1;95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸7 min,35個循環;72 ℃延伸9 min,4 ℃保存。PCR儀為ABI-2720。PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳(120 V,30 min),在紫外燈下觀察,選取單一明亮的條帶PCR產物送至青島鵬翔生物科技有限公司進行測序。

表1 COⅠ基因擴增引物序列

1.3 新疆5種土著魚類序列分析

測序結果使用Chromas軟件編輯,人工輔助校對,然后用SeqMan軟件拼接、人工核對。再使用Clustal W與鯉科同源序列多重比對,去除兩端冗余區域,保留共有序列在NCBI數據庫的Blast中檢索一致性,確定物種確切的分類地位。若與NCBI數據庫中確定物種一致性在98%以上,則視為同一種,一致性位于92%～98%為同屬,85%～92%為同科。處理后的序列利用MEGA-X分析序列長度、核苷酸含量、變異位點數和保守位點數、密碼子組成、簡約信息位點等參數,并計算種內和種間的遺傳距離,模型選擇為Kimuar 2 parameter model雙參數模型(k2p),使用鄰接法(neighbor-joining,NJ)構建系統發育樹,聚類樹的可靠性利用Bootstrap軟件進行檢驗,設置1 000次重復抽樣評估。

2 結果與分析

2.1 新疆5種土著魚類形態學分類鑒定

33尾樣品初步鑒定為4屬5種,具體信息如表2所示。

2.2 新疆5種土著魚類序列比對和分析

33尾樣品魚的DNA條形碼逐條與NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)數據庫中的Blast進行一致性比對。比對結果表明:33尾新疆土著魚類經過與Genbank比對,屬于4屬5種(扁吻魚、塔里木裂腹魚、寬口裂腹魚、斑重唇魚、長身高原鰍)與形態學鑒定結果一致。

5種魚類檢測出13個單倍型,其中Hap_4和Hap_7為最優單倍型,均出現5次,其次為Hap_2(4次),第三為Hap_5和Hap_8(均出現3次)。33尾樣品魚的COⅠ基因測序一致,序列長度為674 bp(剔除引物區)。

分析COⅠ基因序列的平均堿基組成為G=18.4%、C=28.3%、A=25.4%、T=27.9%,(G+C)mol%值為46.7%,(A+T)mol%值為53.3%,出現反G偏倚現象。A、G、C、T在第1、第2、第3位點的平均含量差別較大(表3)。分析可知,密碼子堿基的使用存在明顯的偏向性,第1個密碼子中,T堿基使用頻率顯著高于其他堿基,第2位密碼子的A堿基使用頻率最高,G堿基的使用頻率在第3位密碼子中最多。且第2密碼子位點處(A+T)mol%值59.8%,明顯高于第1位和第3位密碼子的(A+T)mol%值,第3位密碼子處的(C+G)mol%值55.9%,極高于第1和第2密碼子處的(C+G)mol%值,說明第1、2、3位密碼子中的堿基組成存在差異。

表3 新疆5種土著魚類COⅠ基因序列堿基組成 %

MEGA-X分析表明,5種新疆土著魚類COⅠ基因序列包含保守位點C(conserved sites)499個,變異位點V(variable sites)173個,簡約性信息位點PI (parsimony informative sites)170個,3個單突變位點S(singleton variable sites)。分別占總堿基數的74.04%、25.67%、25.22%、0.45%。所分析的序列中(表4),不變位點(ii)包括599個,45個轉換位點(si),21個顛換位點(sv),轉換位點明顯大于顛換位點,R值為2.10(轉換/顛換),R值大于2,說明該段序列轉換與顛換未達到飽和狀態,且該序列可靠,可進行下一步的系統發育樹構建。其中第1位密碼子的不變位點最多,為222個,轉換位點和顛換位點屬第2位密碼子居多。T和C是主要發生轉換的堿基,顛換主要發生在A和C之間。

表4 新疆5種土著魚類COⅠ基因堿基變異情況

如表5所示,從堿基組成分析,5種魚類的(A+T)mol%值均大于(G+C)mol%值,表現出明顯的反G偏倚;從遺傳多樣性分析(表5),斑重唇魚的單倍型多樣性指數最高,為0.833,說明斑重唇魚的遺傳多樣性最高;從核苷酸相關參數分析,斑重唇魚的核苷酸多樣性指數和平均核苷酸差異數最高,分別為0.002 5和1.667 0,說明其分化速度最快,變異程度最高。

表5 新疆5種土著魚COⅠ基因片段堿基組成與遺傳多樣性參數

2.3 新疆5種土著魚類遺傳距離

如表6所示,從NCBI的Genbank中選擇相似度高于90%以上的同屬物種,基于k2p模型分別計算新疆4屬5種土著魚類的遺傳距離以及和其他種的遺傳距離,結果表明,5種新疆土著魚類種內遺傳距離最小值為(0.07±0.06)%,最大為(0.25±0.14)%,分別存在于塔里木裂腹魚和斑重唇魚中。

表6 新疆5種土著魚類的種內遺傳距離 %

如表7所示,5種新疆土著魚的種間遺傳距離兩兩比對結果顯示,最大種間遺傳距離和最小種間遺傳距離分別為(22.73±2.11)%和(0.24±0.16)%,前者存在于長身高原鰍和斑重唇魚之間,后者為塔里木裂腹魚和寬口裂腹魚的種間遺傳距離,均大于0.02的種間遺傳分化臨界值。種間平均遺傳距離為(11.55±0.95)%,種內平均遺傳距離為(0.14±0.10)%。前者遠大于后者的10倍,根據Hebert提出鑒定物種的“10倍法則”,能符合該要求,說明COⅠ基因在不同的物種中形成了明顯的“條形碼間隙”。

表7 新疆5種土著魚類的種間遺傳距離 %

如表8所示,基于COⅠ基因計算塔里木裂腹魚和寬口裂腹魚與其他同屬裂腹魚屬的種間遺傳距離,結果表明,塔里木裂腹魚與齊口裂腹魚(Schizothoraxprenanti)和中華裂腹魚(Schizothoraxsinensis)的遺傳距離最大,均為0.056 8,與寬口裂腹魚的遺傳距離最小;寬口裂腹魚與弧唇裂腹魚(Schizothoraxcurvila-biatus)、巨須裂腹魚(Schizothoraxmacropogon)、瀾滄裂腹魚(Schizothoraxlantsangensis)、光唇裂腹魚(Schizothoraxlissolabiata)的最大遺傳距離為0.053 6。如表9所示,長身高原鰍與軟口高原鰍(Triplophysachondrostoma)的遺傳距離最大,為0.071 6,與梭形高原鰍(Triplophysaleptosoma)的遺傳距離最小,為0.008 6。

表8 新疆土著魚類裂腹魚屬與其他裂腹魚屬的種間遺傳距離

表9 新疆土著魚類高原鰍屬與其他高原鰍屬的種間遺傳距離

2.4 新疆5種土著魚類系統發育關系分析

本次構建的系統發育樹包括4屬32種,其中裂腹魚屬17種、高原鰍屬13種,扁吻魚屬1種、重唇魚屬1種。由圖1分析可知,進化樹分為四大支,第一支為塔里木裂腹魚、寬口裂腹魚和其他同屬裂腹魚的3個種,且塔里木裂腹魚和寬口裂腹魚系統位置較近,符合進化分類地位;第二支為扁吻魚和親緣關系較近的裂腹魚屬;第三支為斑重唇魚,形成單系,且支持度高達100%;第四支為高原鰍屬和已發表的同屬物種,符合進化地位?；谛螒B學特征,將裂腹魚類劃分為3個等級,即形態學原始等級、形態學特化等級和形態學高度特化等級。本研究中,塔里木腹魚和寬口裂腹魚屬于原始等級裂腹魚類,扁吻魚屬于特化等級裂腹魚類,而斑重唇魚屬于高度特化等級裂腹魚類。因此,本研究基于COⅠ基因構建的系統發育樹拓撲結構合理,且進化分析顯示,各物種都能有效區分,說明COⅠ基因條形碼對于不同物種的魚類具有較為準確的辨識力。

圖1 4屬5種新疆土著魚類的系統發育樹

3 討論

3.1 新疆5種土著魚類DNA條形碼技術的適用性

本研究的5種裂腹魚均具有特有的COⅠ基因序列,各物種間無共享的單倍型;系統發育樹結果也表明,塔里木裂腹魚和寬口裂腹魚屬于原始等級裂腹魚類,扁吻魚屬于特化等級裂腹魚類,而斑重唇魚屬于高度特化等級裂腹魚類。各物種能夠有效區分,這說明COⅠ基因條形碼對于不同物種的魚類具有較為準確的辨識力。因此,結果表明以COⅠ基因作為DNA條形碼可鑒定5種新疆土著魚類,并且具有較高的適用性和可行性。

3.2 新疆5種土著魚類遺傳變異分析

33尾新疆土著魚類COⅠ基因一致序列長度674 bp,(G+C)mol%值表現出較為明顯的反偏倚性(46.7%),符合硬骨魚類線粒體COⅠ基因堿基組成的典型特征[24-25],與光唇魚屬(Acrossocheilus)[26]、沙帶魚(Lepturacanthussavala)[27]等魚類的研究結果一致。其中克孜勒河塔里木裂腹魚(G+C)mol%值的反偏倚性與阿克蘇河水系、和田河的塔里木裂腹魚研究結果一致[2,23],克孜爾水庫的扁吻魚與喀拉喀什河和野生扁吻魚的堿基含量偏向性一致[9],斑重唇魚與伊犁河厚唇裂腹魚也存在相同的堿基偏向[28]。本研究通過對5種裂腹魚線粒體COⅠ基因的序列進行分析,發現第三位密碼子堿基變異最多,密碼子變異程度最高,表明不同類群魚類的DNA條形碼堿基組成有所不同。

通過COⅠ基因序列的分析,斑重唇魚的單倍型多樣度和核苷酸多樣性指數最高,分別為0.833和0.002 5,說明該物種分化程度較大分化較快,核苷酸變異程度較高,遺傳資源也較為豐富,與楊天燕等[28]的結果相比(h=7,Hd=0.808,π=0.013 3),前者偏低,中間者近似且后者偏低,可能是本研究采樣點分布較為單一或者采集樣本數量較少導致。近年來,斑重唇魚主要棲息地克孜勒河興修水利設施,分為諸多河段,阻斷了洄游路線,各個河段的斑重唇魚長期無法進行基因交流,因而分化程度較大。寬口裂腹魚只存在1個單倍型數,單倍型多樣度和核苷酸多樣性指數最低。扁吻魚的單倍型數、單倍型多樣度和核苷酸多樣性指數與楊天燕等[2]的結果相比(h=2,Hd=0.381,Pi=0.000 61),單倍型數一致,其余指數均偏高,說明單倍型之間序列差異較大,同時也表明該物種豐富度較高,對環境的耐受能力較強。本研究中塔里木裂腹魚的各指數與喀拉喀什河和玉龍喀什河的塔里木裂腹魚群體相比(Hd=0.733,Pi=0.001 58)[2],Hd偏低,Pi將近一致,可能與COⅠ基因的保守性有關。長身高原鰍的核苷酸多樣性指數為0.000 81,和寬口裂腹魚相似。

3.3 遺傳距離與系統發育樹分析

4屬5種新疆土著魚類的種內平均遺傳距離為(0.142±0.100)%,遠低于HEBERT P N等[29]提出的2%閾值;種間平均遺傳距離為(11.55±0.95)%,是種內平均遺傳距離的43.8倍,遠高于Hebert等提出的2%閾值和“10倍法則”。本研究采用鄰接法(neighbor-joining,NJ)系統發育樹對結果進行驗證分析,可以得到裂腹魚亞科和高原鰍屬魚類同種不同個體均聚在同一分支,形成單系。塔里木裂腹魚、寬口裂腹魚和厚唇裂腹魚聚為一大支,扁吻魚、斑重唇魚、長身高原鰍也各自形成了獨立的進化支。塔里木裂腹魚和厚唇裂腹魚又同聚為一小支,表明兩者的親緣關系更近。因此基于COⅠ基因的DNA條形碼技術可應用于扁吻魚、塔里木裂腹魚和斑重唇魚等5種新疆土著魚類的物種鑒定。

4 結論

本研究證明了基于COⅠ基因的DNA條形碼技術可以有效鑒定新疆5種土著魚類,減少了形態學分析過程中人為錯誤和外界因素的影響,補充和豐富了裂腹魚亞科和高原鰍屬的DNA條形碼庫,有利于更加精確地鑒定各物種,對當地裂腹魚的種質資源保護有著重要的意義。