不同原核表達載體對非洲豬瘟病毒CD2v蛋白可溶性表達及免疫反應性比較

馮夢珂，王星博，林璐璐，崔明仙，顏焰，周繼勇*

（1.浙江大學動物醫學中心，浙江 杭州 310058；2.農業農村部動物病毒學重點實驗室，浙江 杭州 310058）

非洲豬瘟（African swine fever, ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）引起的一種豬急性、出血性、烈性傳染病，死亡率極高[1]。自20 世紀20 年代首次在肯尼亞被發現以來，ASF先后在非洲和亞歐大陸迅速傳播，2018 年8 月我國遼寧省沈陽市報道首例ASF疫情，隨后ASF在全國范圍內大規模暴發流行[2]。由于缺乏有效的治療手段和安全的疫苗，ASF對動物健康、食品安全、國民經濟乃至生態環境都構成了持續的威脅[3]。

ASFV 基因組由一個170～190 kb 的雙鏈DNA分子組成，病毒粒子呈現對稱的二十面體結構，成熟病毒粒子包含多達68 種結構蛋白和100 多種非結構蛋白，其中結構蛋白對病毒感染研究及疫苗、診斷試劑研制的意義重大[4]。病毒粒子自外而內包括外囊膜、衣殼、內膜、核衣殼和基因組5 個部分[5]，外囊膜由EP402R基因編碼的CD2v 蛋白組成。CD2v是一種與T淋巴細胞表面黏附受體CD2相似的蛋白，由信號肽（1～16 個氨基酸）、胞外區（17～207個氨基酸）、跨膜區（208～228個氨基酸）和胞內區（229～375 個氨基酸）4 部分組成[6]，CD2v 參與ASFV 宿主免疫應答、免疫逃逸和病毒復制等生理生化過程，是病毒診斷和疫苗研發的重要靶點蛋白[7]。用桿狀病毒表達的CD2v 蛋白免疫可保護豬免于致死性感染[8]，而且用CD2v蛋白免疫還可誘導豬產生特異性T細胞免疫反應[9]。

真核細胞和原核細胞均可用于外源基因的表達。真核表達系統表達的重組蛋白在結構和功能上更接近天然蛋白[10]。已有研究利用昆蟲桿狀病毒及CHO等真核表達系統對CD2v蛋白進行表達[11-13]，其純化蛋白能與臨床ASFV抗體陽性血清反應。大腸埃希菌原核表達系統具有操作簡單方便、表達周期短且成本低、蛋白表達水平高等優點，缺點在于所表達蛋白大多為包涵體，無法形成正確的三維結構，往往無生物學活性[14-16]。多個研究小組嘗試利用原核表達系統來表達CD2v蛋白，但表達蛋白主要以包涵體形式存在[17-20]，對包涵體進行溶解及鎳柱親和層析后，CD2v純化蛋白與ASFV抗體陽性血清的免疫反應性較差[19]；而純化的CD2v 可溶性蛋白能夠被ASFV 抗體陽性血清識別，具有良好的反應原性[18]；蛋白質印跡法分析結果表明，表達的可溶性CD2v胞外區蛋白與ASFV抗體陽性血清具有良好的免疫反應性[17]。

綜上所述，原核表達系統主要以包涵體形式表達CD2v 蛋白，包涵體蛋白的免疫反應性較差且純化、復性難度較大，不利于蛋白的功能研究及應用。因此，把CD2v 蛋白與適宜的標簽蛋白進行融合表達，篩選促進蛋白可溶性表達的載體，對CD2v蛋白的可溶性表達具有重要意義[21]。本研究基于5種不同的原核表達載體，篩選能促進CD2v 蛋白可溶性表達的最佳表達載體，通過臨床ASFV 抗體陽性血清檢測并比較可溶性CD2v 蛋白和包涵體CD2v 蛋白的免疫反應性，為原核表達可溶性CD2v 蛋白及探究其免疫原性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

高保真酶（貨號P510-01）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；異丙基硫代-β-D-半乳糖苷[isopropylthio-β-D-galactoside（IPTG），貨 號15529019]、DNA 標志物（貨號01112376）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction, PCR）產物清潔回收試劑盒（貨號2101050）、DNA 凝膠回收試劑盒（貨號2003050）購自杭州新景生物試劑開發有限公司；DH5α和BL21（DE3）大腸埃希菌感受態細胞由本實驗室制備；原核表達載體pET-28a、pET32a、pGEX-4T-1、pMAL-C6T 和pCold-TF 由本實驗室保存；二辛可酸（bicinchoninic acid, BCA）蛋白濃度測定試劑盒（貨號C503021-0500）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；鎳-氨三乙酸（nickelnitrilotriacetic acid, Ni-NTA）瓊脂糖（貨號30210）購自德國QIAGEN公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）標記的羊抗鼠IgG（貨號074-1806）、HRP標記的羊抗豬IgG（貨號14-14-06）購自美國KPL公司；質粒小提試劑盒（貨號DP103-02）購自天根生化科技（北京）有限公司；其他生化試劑均為國產分析純。臨床ASFV 抗體陽性血清（病毒被滅活）和標準陰性血清由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 原核表達質粒的構建與鑒定

根據GenBank 數據庫中公布的非洲豬瘟病毒HLJ-2018 株（登錄號MK333180.1）的序列信息，由杭州尚亞科技有限公司合成去除信號肽和跨膜區的非洲豬瘟病毒CD2v 蛋白（CD2vΔSP-TM）序列。將序列插入原核表達載體pET-28a，構建原核表達質粒pET28a-CD2vΔSP-TM。根據不同的原核表達載體設計引物，以pET28a-CD2vΔSP-TM 原核表達質粒為模板，通過PCR擴增CD2v序列后，將目的片段分別插入pCold-TF、pMAL-C6T、pGEX-4T-1 和pET-32a 原核表達載體，得到原核表達質粒pCold-TF-CD2vΔSP-TM、pMAL-C6T-CD2vΔSP-TM、pGEX-4T-1-CD2vΔSP-TM 和pET32a-CD2vΔSPTM。將上述原核表達質粒轉化至DH5α大腸埃希菌感受態細胞中，涂板并挑選單克隆菌落，將PCR鑒定為陽性的菌液送至杭州尚亞科技有限公司進行測序，對測序正確的陽性菌液進行質粒抽提，用于后續原核表達實驗。

1.2.2 CD2v 蛋白的原核表達與鑒定

將鑒定正確的質粒轉化至BL21（DE3）大腸埃希菌感受態細胞中，涂板培養后，挑取單克隆菌落接種至LB 培養基中，于37 ℃活化，將活化后的菌液按照體積比1∶100 轉接至含抗生素（100 μg/mL）的LB 液體培養基中，于37 ℃、200 r/min 條件下培養約4 h，待菌液在600 nm 處的吸光度值達0.6 時，向菌液中加入終濃度為1.0 mmol/L 的IPTG，于16 ℃、120 r/min 條件下培養16 h，誘導結束后離心收集菌液，在冰浴條件下超聲破碎，離心后分別吸取上清液并保留沉淀，制備樣品，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）后，用考馬斯亮藍R250進行染色，以檢測重組蛋白的表達情況及存在形式。各載體標簽及CD2v重組蛋白分子量如表1所示。

表1 不同原核表達載體標簽及重組蛋白分子量Table 1 Different prokaryotic expression vector tags andmolecular weights of recombinant proteins

1.2.3 CD2v 蛋白的純化與鑒定

離心收集經低溫誘導后的pCold-TFCD2vΔSP-TM菌體沉淀，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution, PBS）重懸后，在冰浴條件下超聲破碎，離心收集上清液。將上清液與Ni-NTA瓊脂糖混合，以4 ℃低溫翻轉孵育4 h，隨后用20 mmol/L咪唑去除雜蛋白，用50 mmol/L 咪唑洗脫CD2v-TF 重組蛋白。同樣，離心收集經低溫誘導后的pET28a-CD2vΔSP-TM菌體沉淀，用尿素溶液（8 mol/L尿素，20 mmol/L NaH2PO4·2H2O，300 mmol/L NaCl，pH 8.0）重懸后，在冰浴條件下超聲破碎，離心收集上清液。將上清液與Ni-NTA 瓊脂糖混合，以4 ℃低溫翻轉孵育4 h，隨后用緩沖液A（8 mol/L 尿素，20 mmol/L NaH2PO4·2H2O，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑，pH 8.0）、緩沖液B（8 mol/L尿素，20 mmol/L NaH2PO4·2H2O，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L 咪唑，pH 6.3）、緩沖液C（8 mol/L 尿素，20 mmol/L NaH2PO4·2H2O，300 mmol/L NaCl，pH 5.9）依次去除雜蛋白，用緩沖液D（8 mol/L 尿素，20 mmol/L NaH2PO4·2H2O，300 mmol/L NaCl，pH 4.5）洗脫CD2v-His重組蛋白。收集每次被洗脫的樣品，用BCA法測定CD2v-TF和CD2v-His重組蛋白濃度，并將這2種重組蛋白保存于－40 ℃冰箱中。

純化蛋白通過考馬斯亮藍R250 染色和蛋白質印跡法（Western blotting）進行鑒定。在蛋白質印跡法中，將經過SDS-PAGE后的純化蛋白分別轉印至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉封閉1 h（37 ℃），加入按體積比1∶1 000稀釋的多聚組氨酸標簽（His-Tag）的鼠源單抗作為一抗，37 ℃孵育1 h后，用含吐溫-20 的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution with Tween-20, PBST）洗滌3次，每次5 min，然后加入按體積比1∶5 000 稀釋的HRP 標記的羊抗鼠二抗，37 ℃孵育1 h，用PBST洗滌后，利用增強型化學發光（enhanced chemiluminescence, ECL）試劑進行顯色。

1.2.4 2 種CD2v 重組蛋白的免疫反應性比較

采用間接酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）方法比較2種CD2v重組蛋白的免疫反應性。將純化后的2 種CD2v 重組蛋白用0.05 mmol/L PBS（pH 9.6）稀釋至2 μg/mL，然后以100 μL/孔包被96 孔酶標板，每塊96 孔酶標板于4 ℃過夜包被12 h，棄包被液，用200 μL/孔PBST 清洗3 次后，每孔加入200 μL 5%脫脂奶粉，37 ℃封閉1 h，然后用200 μL/孔PBST 重復清洗3次。臨床ASFV 抗體陽性血清（n=5）和標準陰性血清（n=5）分別用5% 脫脂奶粉按體積比1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800、1∶25 600 稀釋后，每孔加入100 μL 稀釋后的溶液，37 ℃孵育1 h，每個稀釋度設3個重復。用PBST洗滌3 次后，按100 μL/孔加入經1∶2 000 稀釋的HRP標記的羊抗豬IgG，37 ℃孵育45 min，再用PBST 洗滌3 次后，每孔加入100 μL 3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺（3, 3′, 5, 5′-tetramethylbenzidine, TMB）顯色液，37 ℃避光顯色10 min 后，每孔立即加入50 μL 2 mol/L H2SO4，終止顯色。用酶標儀測定每孔在450 nm 波長處的吸光度值，采用配對樣本t檢驗分析相同稀釋度下2種蛋白的免疫反應性差異。

2 結果與分析

2.1 原核表達質粒的構建與鑒定結果

以合成CD2v基因的質粒為模板，通過PCR 擴增得到去除信號肽和跨膜區的CD2v 序列片段，將其分別構建到pET-28a、pET32a、pGEX-4T-1、pMAL-C6T、pCold-TF 5 個原核表達載體中，獲得原核表達質粒，然后將這些質粒轉化到DH5α大腸埃希菌感受態細胞中，經過對應抗性的LB 平板篩選，挑取單克隆菌落接種于對應抗性的LB液體培養基中進行培養。以特異性引物（上游引物CD2v-F，5′-ATTGATTATTGGGTTAGTTTTAATAAAA-3′；下游引物CD2v-R，5′-TTAAATAATTCTATCTACA TGAATAAGCGA-3′）對菌液進行PCR 鑒定。結果（圖1）表明，在969 bp長度附近出現目的條帶。通過核酸測序確定CD2v基因序列、插入位置及開放閱讀框都正確后，抽提質粒進行后續原核表達實驗。

圖1 重組質粒的PCR鑒定結果Fig.1 PCR identification results of recombinant plasmids

2.2 CD2v 蛋白的原核表達與鑒定結果

將鑒定正確的原核表達質粒轉化至BL21（DE3）大腸埃希菌感受態細胞中，經IPTG 誘導后，通過SDS-PAGE 和考馬斯亮藍R250 染色確定不同重組蛋白的表達形式。結果（圖2）表明：pET28a-CD2vΔSP-TM 重組質粒（圖2A）和pGEX-4T-1-CD2vΔSP-TM重組質粒（圖2C）主要表達包涵體蛋白；pET32a-CD2vΔSP-TM重組質粒（圖2B）未表達CD2v重組蛋白；pMAL-C6T-CD2vΔSP-TM重組質粒（圖2D）同時表達包涵體和可溶性蛋白，其中以包涵體蛋白居多；pCold-TF-CD2vΔSP-TM 重組質粒（圖2E）以表達可溶性蛋白為主。

圖2 5種不同原核表達載體對CD2v重組蛋白表達的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of CD2v recombinant protein expression by five different prokaryotic expression vectors

2.3 CD2v 蛋白的純化與鑒定結果

將低溫誘導表達的CD2v-TF、CD2v-His重組蛋白通過超聲破碎、鎳柱親和層析及洗脫等過程進行純化，并用SDS-PAGE和蛋白質印跡法驗證其純化情況。結果表明，在預期的85 kDa附近有CD2v-TF重組蛋白陽性條帶（圖3），在預期的42 kDa 附近有CD2v-His重組蛋白陽性條帶（圖4）。

圖3 CD2v-TF重組蛋白純化結果Fig.3 Purification results of CD2v-TF recombinant protein

圖4 CD2v-His重組蛋白純化結果Fig.4 Purification results of CD2v-His recombinant protein

2.4 2 種CD2v 重組蛋白的免疫反應性比較分析

利用間接ELISA 方法檢測（圖5）顯示，隨著抗體濃度降低，抗原抗體免疫反應性呈現下降趨勢。采用配對樣本t檢驗分析在相同稀釋度下2 種蛋白的免疫反應性差異，以在450 nm波長處的吸光度值表示。結果（圖5）表明，在體積比1∶200和1∶400稀釋度下，ASFV 抗體陽性血清與CD2v-TF 重組蛋白的免疫反應性顯著高于與CD2v-His重組蛋白的免疫反應性（P＜0.05）。

圖5 利用間接ELISA方法檢測2種CD2v重組蛋白的免疫反應性Fig.5 Immunoreactivity of two CD2v recombinant proteins detected by indirect ELISA

3 討論

ASF 對生豬養殖行業造成了嚴重的經濟損失，由于尚無有效的疫苗和藥物進行預防或治療，目前只能依靠嚴格的生物安全措施進行防控[22]。CD2v是第一個被證實對ASFV致死性攻擊具有保護作用的ASFV 蛋白，已成為DNA 疫苗、病毒載體疫苗等研究的重要靶點，在ASFV 疫苗研發中具有重大潛力[23-25]。

大腸埃希菌原核表達系統具有操作簡單方便、表達量高、周期短、成本低等優點，但其表達的CD2v蛋白多以包涵體的形式存在，經尿素溶解后，蛋白空間結構被破壞而呈變性狀態，空間表位丟失，導致免疫原性較差[11,26-27]，影響了其在低成本疫苗研制中的應用。本研究系統比較了5種原核表達載體不同重組標簽對CD2v 蛋白可溶性表達的影響。結果表明：作為被廣泛應用的pET表達系統中的2 個代表性載體，pET28a 和pET32a 均未能促進CD2v的可溶性表達；pGEX-4T-1載體雖然具有促進蛋白可溶性表達的谷胱甘肽-S-轉移酶（glutathioneS-transferase, GST）標簽[28]，但其仍表達以包涵體形式為主的CD2v 重組蛋白；pMAL-C6T 載體具有麥芽糖結合蛋白（maltose binding protein, MBP）標簽，該標簽不僅能提高重組蛋白表達量，而且能減少蛋白降解并促進其可溶性表達[29]，在本研究中該標簽雖然可提高CD2v 蛋白的可溶性表達，但在非變性親和純化過程中雜蛋白較多，影響了CD2v 蛋白的純度；而pCold-TF 載體表達的CD2v 重組蛋白均以可溶性的方式存在，且可純化獲得純度較高的可溶性重組蛋白。pCold-TF是一種冷休克載體，帶有觸發因子（trigger factor, TF）標簽，而TF是原核細胞中與核糖體相關的分子伴侶蛋白，可促進多肽進行共翻譯折疊表達，并通過提高蛋白的正確折疊來促進可溶性表達[30]。

4 結論

本研究構建了5 種原核表達重組質粒，比較了CD2v蛋白的可溶性表達情況，并利用臨床ASFV抗體陽性血清比較了在可溶性和包涵體形式下CD2v蛋白的免疫反應性。結果表明，TF標簽可有效促進CD2v蛋白的可溶性表達，且可溶性CD2v蛋白的免疫反應性顯著高于包涵體蛋白，表明蛋白的可溶性表達可能在空間表位層面影響蛋白的免疫反應性。因此，選擇合適的表達載體是CD2v 蛋白在原核表達系統中實現正確折疊和可溶性表達的一種有效策略。本研究為ASFV CD2v 蛋白的可溶性表達提供了參考載體，為CD2v 蛋白功能與免疫原性研究及亞單位疫苗研制奠定了基礎。