多壁碳納米管對水蕨配子體發育及孢子體產生的影響

郭嚴冬 周義峰 鄭玉紅 張明霞 廖恩慧 曹建國*

（1.江蘇省中國科學院植物研究所（南京中山植物園），南京 210014； 2.上海師范大學生命科學學院，上海 200234）

蕨類植物演化地位特殊，既是高等的孢子植物，又是低等的維管植物，同時具有孢子體和配子體2個世代，且均能獨立存活，在植物界獨有，是研究植物進化和系統發育的重要材料。中國蕨類植物資源豐富，其在食用、藥用和環境指示等多個方面均有應用，且部分蕨類植物因其自身的特殊性具有重要的研究價值［1］。但由于自然生態環境的破壞、不合理開發利用，以及孢子自身壽命短、難萌發等問題，一些珍貴、稀有的野生蕨類植物資源已經瀕臨滅絕［2］。加強相關的繁殖技術的基礎研究，對蕨類植物種質資源的利用和保護具有重要價值和現實意義。

水蕨（Ceratopteris thalictroides）是鳳尾蕨科（Pteridaceae）水蕨屬（Ceratopteris）植物，既是蕨類模式植物又是國家二級重點保護野生植物。水蕨在濕地生態、湖泊生態和水生景觀生態中起著重要的作用，同時水蕨具有重要的觀賞價值和藥用價值［3］。已有研究結果表明，孢子本身的萌發力，培養基中的礦質營養［4］、糖類［5］、生長介質［6-7］和特殊化學物質［8-9］，以及培養條件［10-11］等因素都會影響孢子的萌發。例如：陸鎮威［8］研究發現，納米銀顯著影響水蕨孢子的萌發率和性別分化，隨著納米銀濃度的增加，水蕨孢子的萌發率和雌雄同體配子體所占配子體的比例顯著降低，而雄配子體沒有受到顯著影響。由此可見，在培養基中添加不同種類的外源物質會對水蕨萌發產生不同的影響。

多壁碳納米管作為一維納米材料，其徑向尺寸小，具有極高的強度和極大的韌性，同時具有優異的電學和化學性能，被認為是未來的“超級纖維”。近些年隨著多壁碳納米管及納米材料研究的深入，其廣闊的應用前景也不斷地展現出來。鄭玉紅等［12］利用碳納米管的抗菌作用和特殊的化學性能進行了白芨（Bletilla striata）組培快繁，降低了污染率，提高了繁殖效率，并減少組培苗對植物生長調節劑的依賴，從而縮短組培苗移栽后的緩苗期，提高移栽的成活率，縮短白芨成苗的周期。目前，碳納米管在蕨類植物中的應用較少，研究尚不深入，石雷等［13］在桫欏（Alsophila spinulosa）孢子萌發過程中添加了多壁碳納米管，結果表明：多壁碳納米管對桫欏孢子萌發有一定的促進作用，節約了萌發時間，但研究僅至絲狀體階段，對于后續的片狀體、配子體等并未有一個完整世代的研究，且碳納米管的添加對于性器官的形成是否有影響也并未明確。這些問題均有待深入研究。本研究以蕨類模式植物水蕨為供試材料，設置不同質量濃度的多壁碳納米管處理，觀察對水蕨配子體發育和孢子體產生的影響，以期明確碳納米管在蕨類植物組織培養中的作用，為瀕危蕨類植物的保護和繁育奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為水蕨孢子，經體積分數3%NaClO3消毒1 次，12 000 r·min-1離心2 min，雙蒸水清洗3次（12 000 r·min-1離心，每次2 min）后用雙蒸水浸泡過夜、備用。供試基本培養基為1/2MS+6.5 g·L-1瓊脂。供試多壁碳納米管為1 mg·mL-1多壁碳納米管母液（實驗室自配），供試1/2MS 培養基（不含糖和瓊脂）購自青島捷世康生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養基配置

稱取4.94 g 1/2MS和13.00 g瓊脂粉溶于水中，加入2 mL 植物組培抗菌劑（Plant Preservative Mixture，PPM，購自美國Plant Cell Technology 公司），定容至2 L。設置多壁碳納米管質量濃度分別為0（對照）、0.5、1.0、2.5、5.0 mg·L-15 個處理組。取1 mg·mL-1多壁碳納米管母液分別按照設置的梯度加入上述配置好的基礎培養基，調節pH 至5.8，加熱溶解至無顆粒。每個處理組5個培養瓶，放于高壓蒸汽滅菌鍋滅菌，冷卻后備用。

1.2.2 接種和發育情況觀察

將上述孢子懸浮液接種至添加了不同質量濃度多壁碳納米管的培養基，每個處理組接種5瓶。置于25 ℃、光照時間18 h·d-1、光照強度100～300 μmol·m-2·s-1條件下培養，每天觀察孢子萌發情況，使用Mshot 生物顯微鏡（MS60，廣州）和明美體式顯微鏡（MZ62，廣州）拍照記錄。

2 結果與分析

2.1 對水蕨配子體發育及孢子體產生的影響

在多壁碳納米管對照組中，培養15 d 后觀察到大部分孢子還未萌發（圖版Ⅰ：A1），僅少量孢子的外壁開裂，或有數個細胞和假根伸出孢子壁（圖版Ⅰ：A2）；培養19 d后產生片狀體，片狀體上有精子器（圖版Ⅰ：A3）；培養32 d后片狀體發育為原葉體，且原葉體上有頸卵器產生（圖版Ⅰ：A4）；培養至41 d，部分原葉體上已經完成有性生殖，產生孢子體（圖版Ⅰ：A5），進入孢子體世代。

在0.5 mg·L-1多壁碳納米管處理組中，培養7 d后觀察到孢子已發育為片狀體（圖版Ⅰ：B1）；培養15 d 后片狀體上產生精子器（圖版Ⅰ：B2）；培養19 d 后片狀體發育為原葉體，且原葉體上有頸卵器產生（圖版Ⅰ：B3）；培養至32 d，頸卵器數量增多（圖版Ⅰ：B4），部分原葉體上已經完成有性生殖，產生孢子體（圖版Ⅰ：B5），進入孢子體世代。

在1.0 mg·L-1多壁碳納米管處理組中，培養7 d后觀察到孢子已發育為片狀體（圖版Ⅰ：C1）；培養15 d 后片狀體上產生精子器（圖版Ⅰ：C2）；培養19 d 后片狀體發育為原葉體，且原葉體上有頸卵器產生（圖版Ⅰ：C3）；培養至32 d，頸卵器數量增多，部分原葉體在生長點附近發生營養生長，產生小的片狀體（圖版Ⅰ：C4）；培養至41 d原葉體上產生孢子體，進入孢子體世代（圖版Ⅰ：C5）。

在2.5 mg·L-1多壁碳納米管處理組中，培養7 d后觀察到孢子萌發，產生由數個細胞組成的絲狀體（圖版Ⅰ：D1）；培養12 d 后絲狀體發育為片狀體，且片狀體上產生數量較多的精子器（圖版Ⅰ：D2）；培養15 d 后片狀體發育為原葉體（圖版Ⅰ：D3）；培養19 d 后原葉體上產生頸卵器，體積較大（圖版Ⅰ：D4）；培養至32 d，頸卵器數量增多，部分原葉體在生長點附近發生營養生長，產生小的片狀體（圖版Ⅰ：D5）；培養至41 d原葉體上產生孢子體，進入孢子體世代（圖版Ⅰ：D6）。

在5.0 mg·L-1多壁碳納米管處理組中，培養9 d后觀察到有少量孢子出現假根伸出孢子壁（圖版Ⅰ：E1）；培養16 d 后產生片狀體（圖版Ⅰ：E2）；培養18 d后片狀體上有精子器（圖版Ⅰ：E3）；培養至28 d，大部分配子體仍處于片狀體階段（圖版Ⅰ：E4），偶有部分原葉體上已經完成有性生殖，產生孢子體（圖版Ⅰ：E5），進入孢子體世代。

此外，總體上看，多壁碳納米管的質量濃度越高，精子器產生的時期越早，在幼片狀體時期就產生數量較多精子器的配子體為雄配子體，后期不會出現雌雄同株的現象；且高質量濃度多壁碳納米管處理會導致部分配子體在片狀體階段就出現衰退現象，精子器退化，細胞中葉綠體出現失綠現象（圖版Ⅰ：E4），部分發育出的孢子體上的細胞也出現失綠等衰退現象（圖版Ⅰ：E5）。

2.2 對水蕨配子體發育及孢子體產生的影響效果

對多壁碳納米管對水蕨的整體影響效果進行進一步總結，結果如表1 所示：與對照組相比，0.5 mg·L-1多壁碳納米管對水蕨孢子萌發的促進效果最好，1.0～2.5 mg·L-1多壁碳納米管的促進效果次之，5.0 mg·L-1多壁碳納米管的促進效果較弱。0.5～1.5 mg·L-1多壁碳納米管對絲狀體和片狀體產生的促進效果最好，2.5 mg·L-1多壁碳納米管的促進效果次之，5.0 mg·L-1多壁碳納米管的促進效果較弱。2.5 mg·L-1多壁碳納米管對原葉體和孢子體產生的促進效果最好，0.5～1.5 mg·L-1多壁碳納米管的促進效果次之，而5.0 mg·L-1多壁碳納米管對原葉體和孢子體產生有一定的抑制作用。間［14］。本研究中，對照組水蕨孢子培養至15 d 時，大部分孢子仍未萌發。造成這種差異的原因除了培養條件有差異以外，主要原因可能是使用的培養基不同，戴錫玲等［14］使用的是改良Knop’s 培養基，該培養基在MS 培養基的基礎上加入了Ca、K、

表1 不同質量濃度多壁碳納米管對水蕨配子體發育及孢子體產生的影響Table 1 Comparison of gametophyte development and sporophyte production in water fern with different mass concentrations of multi-walled carbon nanotubes

圖版Ⅰ 多壁碳納米管對水蕨配子體發育及孢子體產生的影響A1～A5.分別是對照組水蕨孢子培養15、15、19、32、41 d 的萌發情況；B1～B5.分別是0.5 mg·L-1多壁碳納米管處理組水蕨孢子培養7、15、19、32、32 d 的萌發情況；C1～C5.分別是1.0 mg·L-1多壁碳納米管處理組水蕨孢子培養7、15、19、32、41 d 的萌發情況；D1～D6.分別是2.5 mg·L-1多壁碳納米管處理組水蕨孢子培養7、12、15、19、32、41 d的萌發情況；E1～E5.分別是5.0 mg·L-1多壁碳納米管處理組水蕨孢子培養9、16、18、28、28 d的萌發情況；An.精子器；Ar.頸卵器；Sp.孢子體；PV.營養生殖產生的片狀體。PlateⅠ Effects of multi-walled carbon nanotubes on gametophyte development and sporophyte production of C. thalictroide（sL.） Brongn A1-A5.The spore germination of the control group was cultured for 15，15，19，32 and 41 d，respectively；B1-B5.The spore germination of 0.5 mg·L-1 multi-walled carbon nanotube treated group was cultured for 7，15，19，32 and 32 d，respectively；C1-C5.The spore germination of 1.0 mg·L-1 multi-walled carbon nanotube treated group was cultured for 7，15，19，32 and 41 d，respectively；D1-D6.The spore germination of 2.5 mg·L-1 multi-walled carbon nanotube treated group was cultured for 7，12，15，19，32 and 41 d，respectively；E1-E5.The spore germination of 5.0 mg·L-1 multi-walled carbon nanotube treated group was cultured for 9，16，18，28 and 28 d，respectively；An.Antheridium；Ar.Archegonium；Sp.Sporophyte；PV.Plate produced by vegetative reproduction.

3 討論

早期在對水蕨配子體發育的研究中發現，水蕨在4～5 d 可以萌發，6～7 d 形成絲狀體，2～3 周出現性器官，但未提及片狀體和原葉體出現的時Mg和Fe等營養元素，有利于蕨類孢子發育。但本研究中0.5～1.0 mg·L-1多壁碳納米管處理組中的孢子萌發較快，絲狀體階段很短，培養7 d 就可以發育至片狀體階段，比對照組孢子萌發提前約15 d，且性器官出現的時間也較早，培養15 d 后就出現數量較多的精子器，培養19 d 頸卵器出現，說明多壁碳納米管處理可以有效促進水蕨孢子萌發和配子體發育。同時也側面說明，與培養基和培養條件相比，添加外源物質對水蕨配子體發育影響更大。這可能依賴于碳納米管自身較大的比表面積及碳管之間較強的作用力等優良性能［15］。

本研究中，水蕨培養適宜的多壁碳納米管質量濃度為0.5～2.5 mg·L-1。而在多壁碳納米管對中華桫欏（Alsophila costularis）和椒樣薄荷（Mentha×piperita）離體培養的研究中，發現100 mg·L-1質量濃度以下的多壁碳納米管處理后，中華桫欏孢子萌發縮短了4 d，75 mg·L-1以上質量濃度的處理會導致假根扭曲和膨大，50 mg·L-1多壁碳納米管是促進中華桫欏孢子在離體條件下萌發的最適質量濃度，而椒樣薄荷最佳培養基中多壁碳納米管的質量濃度為100 mg·L-1［16］。上述研究結果表明不同物種適宜的多壁碳納米管濃度存在差異，這種種間差異也反映了植物對環境的適應性［17-18］。但不同物種均會出現“高濃度抑制”的現象，5.0 mg·L-1多壁碳納米管處理會使部分水蕨配子體在發育過程中出現衰退現象，這在植物中是普遍現象，這是因為過高濃度外源物質的添加對植物的酶活性和細胞結構等產生了復雜的影響［19-20］。李佳慧［21］的研究發現，25 mg·L-1碳納米管對幼苗生長具有較好的促進效果，而50 mg·L-1的碳納米管對幼苗生根的促進作用明顯。本研究中0.5～1.0 mg·L-1多壁碳納米管處理在水蕨片狀體階段前促進效果最為明顯，2.5 mg·L-1多壁碳納米管處理在片狀體階段以后促進效果較為明顯。說明在實際應用過程中應根據具體的需要選擇相應的添加量。

相關研究［22］表明，水蕨配子體有雌雄同株和雌雄異株之分，戴錫玲等［14］在水蕨常規培養中未觀察到雄配子體。本研究觀察到，在各處理組的片狀體階段就產生較多精子器的配子體一般后期會發育為雄配子體，且質量濃度較高的多壁碳納米管處理會使片狀體發生畸形，通常這類配子體上的精子器數量較多。這可能是由于多壁碳納米管的加入使細胞的導水、導熱等能力發生改變，部分孢子在有限資源環境中會為了增加生殖行為成功的幾率，形成雄配子體，促進配子體之間的雜交，保證遺傳的多樣性［23］。

綜上所述，0.5～2.5 mg·L-1多壁碳納米管處理可以明顯促進水蕨配子體發育和孢子體的產生，且精子器數量明顯增多。0.5～2.5 mg·L-1多壁碳納米管處理可使水蕨孢子萌發提前約15 d，其中，0.5～1.0 mg·L-1多壁碳納米管處理在片狀體階段前促進效果最為明顯，2.5 mg·L-1多壁碳納米管處理在片狀體階段以后促進效果較為明顯。高質量濃度（5.0 mg·L-1）多壁碳納米管處理會使水蕨配子體發育出現“高濃度抑制”現象。建議根據實際研究目的或生產需要選擇多壁碳納米管質量濃度。