反復著床失敗患者的臨床病例對照研究

賈婉璐 王海燕 喬杰 劉平 李蓉 陳新娜 王穎

不孕癥是生殖領域內全球性的醫學問題,近年其發病率在全世界呈上升趨勢[1-2]。輔助生殖技術的發展成為治療不孕癥的重要方法,實現了許多不孕女性為人母的愿望。然而,體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)周期的著床率始終徘徊在30%～40%,其中反復著床失敗(recurrent implantation failure,RIF)的發生率約在5%～11.1%[2],成為困擾臨床工作的一大難題。

反復著床失敗自提出以來并無統一的診斷標準,目前公認的定義為:不孕女性至少連續行3個胚胎移植周期(新鮮或解凍移植周期)且每周期移植1～2枚優質胚胎未獲得臨床妊娠,或者不孕女性經歷2～6個IVF-ET周期且共移植≥10枚形態學上的優質胚胎仍未獲得臨床妊娠[2-3]。反復著床失敗的發病機制、高危因素尚不明確,目前根據胚胎著床機制將RIF的病因分為三大類即母體因素、胚胎因素及母胎界面免疫因素。因此,RIF的臨床治療方法也是從這三方面入手,如清除宮腔病變、提高子宮內膜容受性、輔助孵化、囊胚移植及免疫治療等。

雖然以上方案可一定程度地改善了部分RIF患者的著床率和妊娠率,但仍然有許多病人經過這些治療后再次失敗,因此臨床醫生非常有必要繼續尋找RIF的相關病因,而且以上干預方案大多是在患者診斷為RIF后進行的,在臨床工作中,醫生迫切需要知道RIF的預警因素,以提高診治意識。本次研究通過分析RIF患者與同期行第一次IVF助孕即成功的患者的病例資料,旨在研究RIF是否與不孕癥病因及其IVF-ET治療中的臨床因素相關,以期早期識別RIF的高危因素,并減少反復著床失敗的發生率。

對象與方法

一、研究對象

2015年01月—2016年01月在北京大學第三醫院生殖中心行IVF助孕,患者至少連續行3個胚胎移植周期(新鮮或解凍移植周期)且每周期移植1～2枚優質胚胎未獲得臨床妊娠,且年齡小于41歲的共204例,排除既往在其它醫院行IVF助孕的患者8例,共入組196例,作為反復著床失敗組(RIF組)。

與RIF患者在同年同月行第一次IVF助孕并成功分娩的患者共1 508例,按照1:2匹配原則和入選標準共選取對照組392例。本研究對照組患者納入標準:(1)與RIF患者同年同月在北京大學第三醫院生殖中心第一次行IVF-ET助孕;(2)第一次IVF-ET助孕即成功獲得妊娠并分娩;(3)年齡小于41歲;(4)與RIF患者在同天取卵且試管編號最近的兩例。同樣排除既往在其他醫院行IVF助孕的患者。

二、研究方法

1.資料來源:采用臨床資料的病例對照研究方法,RIF組及對照組患者第一次IVF周期時的信息從北京大學第三醫院生殖中心數據庫中獲取,病例的其余信息在北京大學第三醫院病案室檢索獲得。

2. 主要分析指標:(1)患者第一次IVF助孕時的一般情況及輔助檢查資料:年齡、身高、體重、體重指數(body mass index,BMI)、丈夫年齡、不孕類型、不孕年限、基礎激素水平(b-PRL、b-FSH、b-LH、b-E2、b-A)、基礎竇卵泡數(b-antral follicle)、IVF周期月經第二天的激素水平(M2-FSH、M2-LH、M2-E2、M2-P)、甲狀腺自身免疫抗體(TGAb、TMAb)、血型。(2) 行IVF助孕的病因:輸卵管因素、無排卵性不孕(除1例高泌乳素血癥外均為PCOS病人)、男方因素、子宮內膜異位癥、卵巢儲備功能下降及不明原因不孕[4-10]。(3)第一次IVF周期的相關資料:HCG日內膜厚度、HCG日內膜分型、促排卵方案、獲卵總數、受精方式、2PN數、2PN受精率、優質胚胎數、優質胚胎率[11-13]。

3. 統計方法:采用SPSS 17.0進行數據分析。計量資料經正態性檢驗,基礎E2水平、月經第二天E2水平、Gn用量、IVF-2PN率、ICSI-2PN率、總2PN率及優質胚胎率不符合正態分布,以中值表示并行秩和檢驗;其余計量資料均符合正態分布,以均值+標準差表示、應用t檢驗分析;計數資料卡方檢驗分析,多因素分析應用Logistic回歸分析,P<0.05認為差異有統計學意義。

結 果

一、患者第一次移植周期的基礎資料

196例RIF患者既往行IVF失敗次數為(3.80±0.987)次、既往共移植胚胎數(6.65±2.10)個。RIF組的患者年齡及丈夫年齡均大于正常對照組,差異有統計學意義,而身高、體重、體重指數、不孕類型、不孕年限在兩組間無統計學差異。

兩組患者第一次行IVF助孕時,RIF組196例患者中無微刺激方案取卵者;僅有1例患者為自然周期取卵,未用Gn;有1例患者未取到卵細胞,有1例患者的丈夫未取到精子,未受精,因此計算2PN數、優質胚胎數、2PN率及優質胚胎率時排除此2例患者及其相對應的4例對照組患者。RIF組有9例患者未形成2PN受精卵,有44例患者未形成優質胚胎。對照組392例患者均有2PN受精卵形成,但17例患者無優質胚胎形成。分析兩組患者的第一次IVF助孕時的輔助檢查資料及IVF周期相關資料分析,結果顯示基礎FSH水平、內膜厚度、內膜分型、Gn用量、優質胚胎數、ICSI-2PN率、總2PN率及優質胚胎率在兩組間均有顯著差異,而其他統計指標均無差異性,具體見表1。

表1 RIF組和對照組的基礎資料分析[例(%)]Table 1 Basic data analysis of RIF group and control group[n(%)]

二、不孕病因分析

將患者合并的不孕病因分為輸卵管因素、無排卵性不孕、男方因素、不明原因不孕、卵巢儲備功能下降、子宮內膜異位癥(有34例為卵巢巧克力囊腫,其中19例經過腹腔鏡手術;有15例子宮腺肌癥、其中4例同時合并卵巢巧囊)六類。經卡方檢驗分析發現卵巢功能下降和子宮內膜異位癥在兩組間有顯著性統計學差異,具體見表2。

表2 RIF組和對照組的不孕因素分析[例(%)]Table 2 Analysis of the infertility factors between two groups[n(%)]

根據患者合并不孕因素的個數,將兩組中患者分為合并1個不孕因素的的患者、合并2個不孕因素的患者,合并≥3個不孕因素的患者。經卡方檢驗,發現不孕因素個數在兩組間有顯著統計學差異,具體見表2。

三、年齡分層分析

根據患者年齡將患者分為3組:年齡≥35歲、30≤年齡<35歲、年齡<30歲。年齡≥35歲組患者共161例,其中反復著床失敗患者有74例,單因素分析以上資料發現僅丈夫年齡、ICSI-2PN率在RIF組和對照組間有統計學差異。30≤年齡<35歲組患者共264例,其中反復著床失敗患者有86例,單因素分析結果無排卵性不孕、男方因素、優質胚胎數、總2PN率、IVF-2PN率、ICSI-2PN率及優質胚胎率在兩組間有統計學差異。年齡<30歲組患者共163例,其中反復著床失敗患者有36例,單因素分析結果雄激素水平、內膜厚度、獲卵總數及2PN數在兩組間有統計學差異。具體結果見表3。

表3 三組患者的臨床因素分析Table 3 Analysis of clinical factors between three groups

四、多因素回歸分析

根據單因素分析結果及統計學原理將女方年齡、丈夫年齡、基礎FSH水平、卵巢功能下降、子宮內膜異位癥、不孕因素個數、Gn用量、內膜厚度、內膜分型、優質胚胎數、總2PN率及優質胚胎率進行回歸分析,結果發現丈夫年齡、子宮內膜異位癥、內膜形態、優質胚胎率及總2PN率均為反復著床失敗的獨立影響因素,其中丈夫年齡和子宮內膜異位癥是反復著床失敗的危險因子,A型內膜、優質胚胎率及總2PN率則是反復著床失敗的保護因子。具體見表4。

表4 RIF組和對照組間多因素回歸分析Table 4 Logistic regression analysis between the two groups

討 論

一、重視對男性生育年齡的評估

研究已證實女性年齡≥35歲是不孕癥及許多妊娠并發癥的高危因素。而男性年齡對生育的影響卻未受到相應的重視。一方面由于沒有明確的男性影響生育的臨界年齡,另一方面是男性年齡對生育的影響仍存在爭議。而本次研究結果支持男方年齡對IVF周期的臨床結局有影響。入組的196例反復著床失敗患者的丈夫平均年齡為35.53歲,年齡最小為21歲,最大為55歲。而對照組392例不孕患者的丈夫平均年齡為32.26歲,其中年齡最小為22歲,最大為50歲?；貧w分析發現丈夫年齡是反復著床失敗的獨立影響因素(P<0.01,OR=1.112),即男方年齡越大,發生反復著床失敗的風險高。

一直以來關于男方年齡與輔助生殖臨床結局是否相關存在爭議,但2022年[14]最新發表的一篇Meta分析顯示高齡男性與ART臨床結局呈負相關,且男方年齡在總體妊娠率、流產率及活產率的臨界年齡為35歲,而在臨床妊娠率的臨界年齡為40歲。很多的研究表明男性年齡越大,其精液的量和精子活力越低、二倍體精子的量越高[15-18],研究還發現年齡大的男性,其發生精子DNA損傷的風險越高[17][18],且男性的年齡對精子DNA的完整性比常規的精液參數更為重要[19]。而2017年[20]及2021年[21]發表的Meta分析均顯示精子的DNA損傷與輔助生殖技術的妊娠結局呈負相關。由此可見,男方年齡對IVF的成功有至關重要的作用。

二、警惕子宮內膜異位癥

本研究發現子宮內膜異位癥是RIF發生的高危因素(P=0.017,OR=2.47),即合并子宮內膜異位癥的不孕患者在輔助生殖助孕過程中易發生RIF。

已有很多研究證實了子宮內膜異位癥與女性不孕相關。子宮內膜異位癥引起不孕的原因包括卵巢功能下降、排卵障礙、輸卵管拾卵障礙、影響精子的運動、影響受精過程、影響胚胎的轉運及改變盆腔微環境等[22-25]。子宮內膜異位癥的女性有30%～50%合并不孕,這個比率在曾行ART的不孕女性中高達80%,而在反復妊娠丟失的女性中有20%～40%合并子宮腺肌病[23]。雖然輔助生殖技術助孕成為治療不孕癥合并子宮內膜異位癥、尤其是中重度內異癥的重要治療方法,并取得了一定療效[26-27]。但Meta分析顯示子宮腺肌病與IVF妊娠結局呈負相關,其臨床臨床妊娠率、活產率均低于沒有子宮腺肌病的女性,而胚胎著床率、流產率高于無子宮腺肌病的女性[24-25]。子宮內膜異位癥和子宮腺肌病可以通過改變子宮內膜容受性、影響胚胎質量及引起機體免疫環境變化等引起反復著床失敗[28-29],這與本研究的結論相符合。

三、提高卵母細胞受精率及胚胎質量

本研究結果顯示患者IVF周期形成的優質胚胎數、優質胚胎率、ICSI-2PN率及總2PN率在RIF組和對照組間有顯著差異,且優質胚胎率及總2PN率是RIF發生的保護因素,即2PN率高、優質胚胎率高的患者容易獲得妊娠。

精子質量是受精成功的關鍵因素,ICSI技術賦予精子激活卵母細胞的能力,是治療男性重度少精、弱精、畸精和能夠通過手術獲取精子的無精癥的主要方法,可提高男性不育的受精率[30],不僅適用于治療男性不育的患者,對其它原因不孕的患者同樣適用[31]。在ICSI基礎上人們還開展了卵胞漿內形態選擇單精子顯微注射技術(IMSI,intramorphology sperm injection),雖然Gatimel等[32]人的研究顯示IMSI并不能改善曾有兩次ICSI移植失敗患者的臨床結局,但很多的研究證實IMSI技術可提高既往ICSI移植失敗患者胚胎著床率、臨床妊娠率[33]。因此,還需要更多高質量的的研究支持IMSI在RIF患者中的應用價值。

卵母細胞的成熟也是受精及早期胚胎發育的關鍵[34]。對于有IVF/ICSI病史的患者要考慮到會有不滿意的卵母細胞獲取率[35],且ICSI受精成功也離不開卵母細胞的激活,Yanagida等[36]人的研究表明缺乏卵母細胞激活會導致多數ICSI受精失敗。

因此,建議對于在第一個IVF周期中總2PN率低和或優質胚胎率低,尤其是年齡較大、合并子宮內膜異位癥的患者,給予相應治療提高患者再次移植周期的受精率和胚胎質量,以期減少反復著床失敗的發生。

四、建議A型內膜周期移植

本次研究發現內膜厚度、內膜形態在RIF組和對照組中有顯著差異,經多因素回歸分析顯示B型內膜患者較A型內膜患者更易發生反復著床失敗(P=0.016,OR=0.487),可見A型內膜時移植可減少反復著床失敗的發生。此外,本次研究入組的588名患者中僅7名患者內膜厚度>14 mm,僅3例患者<7 mm,其余患者內膜厚度均在7～14 mm。

研究發現內膜厚度>7 mm患者的胚胎著床率高于<7 mm的患者[11]。2019年Meta分析顯示HCG內膜厚度在6 mm以上預測患者的活產率的敏感性達99.9%[38]。該文章還發現A型內膜對IVF助孕患者的臨床妊娠率無預測意義[38]。但2021年的一項納入了12 991個新鮮移植周期的大樣本研究表明當內膜厚度在14 mm以下時,A型內膜患者的臨床妊娠率高于B型內膜患者,且具有統計學差異[39]。以上研究納入的均不是RIF的患者,因此關于內膜厚度、內膜形態對RIF患者的影響仍需進一步高質量研究。

五、年齡分層化管理

Ocal等[40]人的研究表明年齡≥35歲不僅是不孕癥的高危因素,也是反復著床失敗的高危因素。分層分析發現對于年齡≥35歲的患者,丈夫年齡、ICSI-2PN率在RIF組和對照組間有顯著差異,因此對于年齡≥35歲的患者不僅要改善卵母細胞質量,也要提高患者的丈夫的精液質量,進而提高患者的2PN率來減少RIF的發生。

對于30≤年齡<35歲組的患者,年齡不再是RIF發生的高危因素,反而是無排卵性不孕(主要為PCOS)、男方因素、2PN率及優質胚胎的數量和比例成為RIF的影響因素。因此針對此人群患者臨床醫生應對PCOS及男性因素在IVF助孕前進行預處理,改善基礎病情,個體化治療來減少RIF的發生。

而年齡<30歲RIF患者的獲卵數、2PN數均高于對照組而內膜厚度低于對照組,考慮常規劑量的促排卵方案對年輕病人可獲取較多數量的卵母細胞,有較高的E2水平進而導致內膜容受性的下降,應采用溫和的卵巢刺激方案獲取適當數量的卵母細胞,降低過高的雌激素對內膜容受性的不良影響,并保證胚胎的質量。此外,本研究的雄激素為雄烯二酮,結果顯示高雄烯二酮水平與RIF發生相關。不同種類的雄激素有不同作用[41],睪酮和脫氫表雄酮可提高卵巢儲備功能下降患者卵巢功能,但其他雄激素(雄烯二酮和脫氫睪酮)可能產生相反作用[42]。目前尚未見到雄激素和反復著床失敗的相關研究,仍需進一步探索。