普魯蘭酶對糯性大黃米淀粉理化性質及其品質特性的影響

張素敏，喬嘉偉，馬 玲

（山西農業大學食品科學與工程學院，山西晉中 030801）

糜子脫殼后稱為黃米，主要生長在我國干旱、半干旱、降雨量少、土壤肥力低的地區，具有良好的抗逆性，生長周期短，品種繁多，是我國北方重要的糧食作物之一，且富含大量淀粉[1-2]。糜子淀粉也分為糯性與粳性2 種類型，糯性糜子淀粉直鏈淀粉含量低，透明度、凍融穩定性、溶解度和膨脹度均優于粳性糜子淀粉，但粳性糜子淀粉的熱糊穩定性要優于糯性糜子淀粉[3]。

黃米中含有豐富的食用纖維，可促進腸道蠕動，縮短糞便通過腸道的時間，減少糞便中細菌所產生的酶及毒素對腸壁的刺激，預防疾病的發生[2]。黃米中各種營養成分完整，總糖和粗蛋白含量較高，其中粗蛋白含量明顯高于大米等，且富含豐富的常量元素和微量元素，尤其鎂的含量較高。因此，長期食用黃米有利于預防冠心病、膽結石等疾病的發生[4-8]。山西省北部盛產糯性大黃米，但是目前針對其研究主要集中在產品開發上[9-11]，對黃米淀粉的開發及利用還未完全展開，從而導致其應用價值尚未被完全發現。

抗性淀粉是指在人體小腸中不能被消化，但可在結腸中被微生物菌群發酵分解產生斷鏈脂肪酸，利于益生菌生長的淀粉，可以有效地穩定人體的餐后血糖濃度、降低血液中膽固醇的含量，所以被廣大學者廣泛關注。目前，我國抗性淀粉的供給大部分來自國外，導致成本偏高，應用受限[12-14]，尤其是山西省北部盛產糯性大黃米，對糯性大黃米抗性淀粉的研究，具有十分重要的實際應用價值。

試驗以糯性大黃米為原料，利用堿法提取淀粉，利用酶解法制備糯性大黃米抗性淀粉，篩選出最佳的制備條件，并分析酶解對糯性大黃米淀粉的理化性質的影響；在此基礎上，用酶法制備的抗性淀粉用于餅干加工中，分析加入抗性淀粉的餅干質構特性及功能特性，為糯性大黃米抗性淀粉的盛產及功能食品開發提供理論基礎，也為糯性大黃米的進一步精深加工提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

糯性大黃米，東方亮公司提供；植物抗性淀粉（rs） 酶聯免疫分析試劑盒，上海將來實業股份有限公司提供；普魯蘭酶（2 000 U/mL），酷爾化學科技（北京） 有限公司提供；NaOH、HCl、Tris-HCl、無水乙醇、KBr、磷酸緩沖液、α- 淀粉酶（3 700 U/g），北京奧博星生物技術有限責任公司提供；NaCl、胃蛋白酶（250 U/mg），合肥千盛生物科技有限公司提供；MgCl2-CaCl2溶液、胰酶（250 U/mg），廣州達暉生物技術股份有限公司提供；淀粉轉葡萄糖苷酶（50 000 U/g），江蘇博立生物制品有限公司提供。

1.2 儀器與設備

WFM-10 型超微粉碎振蕩磨，江陰市祥達機器制造有限公司產品；DZKW-4 型電子恒溫水浴鍋，北京中興偉業儀器有限公司產品；JJ-1 型大功率電動攪拌器，常州國華電器有限公司產品；KDC-1044L 型大容量低速離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司產品；SCIENTZ-30YD/A 型冷凍干燥機，寧波新芝凍干設備股份有限公司產品；Spectra Max i3x型多功能酶標儀，美國Molecular Devices 公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 黃米淀粉的制備

使用超微粉碎振蕩磨將黃米研磨成粉（1 250 mm），配制質量分數為0.3%的NaOH 溶液備用。稱取200 g黃米粉于1 L 的大燒杯中，按照黃米粉與NaOH 溶液1∶4 的配比用璃棒將其混勻。將其放置于45 ℃的恒溫水浴鍋中，使用大功率電動攪拌器攪拌3 h。3 h 后將其取出，倒入離心管中，配平，使用大容量低速離心機以轉速3 500 r/min 離心10～15 min，棄去上清液，摳出淀粉并加入適量蒸餾水溶解，如此重復3～4 次。將黃米淀粉溶液pH 值調至中性，按照上述離心操作進行離心，取出黃米淀粉后，放入45 ℃電熱恒溫鼓風干燥箱中烘干，取出，得到黃米淀粉。

1.3.2 糯性大黃米抗性淀粉的制備

稱取一定質量的黃米淀粉于250 mL 燒杯中，將其配制成10%的黃米淀粉乳，置于沸水中水浴處理30 min，從而使淀粉乳充分糊化。待冷卻至60 ℃左右將其pH 值調至5 左右，向其加入一定量的普魯蘭酶后放入60 ℃電子恒溫水浴鍋中，反應一段時間后取出，置于沸水中15 min，滅酶。待冷卻至室溫后，倒入離心管中，加入2 倍體積無水乙醇，使用大容量低速離心機以轉速3 000 r/min 離心20 min。將得到的沉淀物進行凍干處理，從而得到糯性大黃米抗性淀粉。

1.3.3 抗性淀粉標準曲線的制作及樣品抗性淀粉含量的測定

配制濃度為0.05 mol/L 的Tris HCl 溶液，稱取一定質量樣品，按照質量∶體積= 1∶9（mg∶mL） 的比例加入9 倍體積的Tris HCl 溶液于離心管中，用離心機以轉速3 000 r/min 離心10～15 min（取上清液測定）。使用植物抗性淀粉（RS） 酶聯免疫分析試劑盒，設置標準品孔、空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步驟操作相同） 和待測樣品孔。首先，向標準品孔中加入不同濃度的標準品50 μL，再向待測樣品孔中加入40 μL 樣品稀釋液和10 μL待測樣品，輕微晃動搖勻，向除空白孔外的各孔中加入100 μL 酶標液；封板膜封板；置于37 ℃恒溫箱中溫育1 h。配制20 倍稀釋后的洗滌液；揭去封板膜，棄去液體，使用配置好的洗滌液洗滌5 次；每孔加入顯色劑A 50 μL和顯色劑B 50 μL，輕微晃動搖勻，于37 ℃條件下避光反應15 min。每孔加入終止劑50 μL；使用酶標儀于波長450 nm 處測定各孔吸光度；制作標準曲線和測量各樣品中抗性淀粉含量；確定最適加酶量與最佳酶解時間。

抗性淀粉標準曲線見圖1。

1.3.4 單因素對黃米淀粉中抗性淀粉含量的影響

（1） 普魯蘭酶添加量對黃米淀粉中抗性淀粉含量的影響。稱取一定質量的黃米淀粉于燒杯中，將其配制成10%的黃米淀粉乳，放于沸水中電子恒溫水浴30 min，從而使淀粉乳充分糊化。待冷卻至60 ℃后將其pH 值調至5 左右，放入60 ℃電子恒溫水浴鍋中加入1，3，5，7，9 U/g 的普魯蘭酶，反應3 h后取出，置于沸水中15 min，滅酶。待冷卻至室溫后，倒入離心管中，并加入2 倍體積無水乙醇，使用大容量低速離心機以轉速3 000 r/min 離心20 min。將得到的沉淀物進行凍干處理，從而得到酶處理黃米淀粉。

（2） 普魯蘭酶酶解時間對黃米淀粉中抗性淀粉含量的影響。稱取一定質量的黃米淀粉于燒杯中，將其配制成10%的黃米淀粉乳，置于沸水中水浴30 min，從而使淀粉乳充分糊化。待冷卻至60 ℃后將其pH值調至5 左右，隨后放入60 ℃電子恒溫水浴鍋中加入5 U/g 的普魯蘭酶，反應1，2，3，4，5 h 時間后取出，置于沸水中15 min，滅酶。待冷卻至室溫后，倒入離心管中，并加入2 倍體積無水乙醇，使用大容量低速離心機以轉速3 000 r/min 離心20 min。最后將得到的沉淀物進行凍干處理，從而得到酶處理黃米淀粉。

1.3.5 酶處理前后淀粉理化性質的測定

（1） 酶處理前后淀粉溶解度的測定。稱取一定質量（M） 酶處理前后淀粉樣品并分別配制成1%的淀粉溶液，于40，50，60，70，80 ℃的電子恒溫水浴鍋中水浴30 min 并不斷攪拌，隨后將其倒入離心管中，使用離心機以轉速3 000 r/min 離心20 min。最后將上清液置于恒質量鋁盒中，于105 ℃烘箱中烘干至恒質量，比較酶處理前后淀粉的溶解度。被溶解的淀粉質量為A，S（溶解度） =(A/M)×100%。

（2） 酶處理前后淀粉透光率的測定。稱取一定質量酶處理前后淀粉樣品并分別配制成1%的淀粉溶液，將其置于沸水中水浴30 min，從而使淀粉充分糊化。待淀粉糊冷卻至室溫后，將其倒入比色皿中，以蒸餾水作為空白對照，于波長620 nm 處測定其透光率T。

1.3.6 酶解對糯性大黃米淀粉品質特性的影響

（1） 酶處理后黃米淀粉餅干的制作?；A配方：低筋面粉100 g，黃油15 g，白砂糖8 g，水20 mL，全蛋液30 g，食鹽1 g，膨松劑1 g。在此配方的基礎上加入酶處理后的黃米淀粉各0，50，100 g，將黃油隔水融化后加入白砂糖、膨松劑、食鹽、全蛋液，攪拌均勻并加入低筋面粉中，分次加水攪拌形成面團。隨后將面團放置于容器中，使用保鮮膜密封，靜置30 min，搟平，使用模具按壓成型，表面扎孔，放置于烤箱中，設置為上火160 ℃，下火180 ℃，時間7～10 min。

（2） 添加酶處理后黃米淀粉對餅干的質構分析。采用三點彎曲測試黃米餅干質構。程序選擇三點彎曲（100 N 力量感應元）；當探頭移動至2 個支撐點下2 cm 時給予探頭一個阻力，從而使探頭停止運動，完成位移零點設置；設置回程距離為30 mm；放置樣品進行檢驗，重復測定3 次，取平均值。

（3） 葡萄糖標準曲線的制作。取6 支試管，按照斐林試劑法配制標準溶液。配制完成后，混勻，置于沸水中水浴10 min，冷卻至室溫，以轉速1 500 r/min離心5 min，取上清液，以蒸餾水作為空白對照，于波長590 nm 處測定吸光度。

葡萄糖標準曲線見圖2。

圖2 葡萄糖標準曲線

（4） 酶處理后黃米淀粉餅干GI 值的測定。根據閆晨苗[15]的研究方法，稱取全面粉餅干，添加25%酶處理后黃米淀粉餅干和添加50%酶處理后黃米淀粉餅干各1 g，置于150 mL 錐形瓶中，加入磷酸緩沖液（0.1 mol/mL，pH 值6.9） 3 mL 和提前于37 ℃條件下水浴一段時間后的α - 淀粉酶溶液1 mL，搖勻，加入磷酸緩沖液（0.1 mol/mL，pH 值6.9） 10 mL、NaCl 溶液（0.4 g/L） 6 mL 和胃蛋白酶0.05 g，使用2 mol/mL 的HCl 溶液調至pH 值為1.5（記錄用量），于37 ℃下攪拌30 min，加入磷酸緩沖液（0.1 mol/mL，pH 值6.9） 10 mL，使用質量分數為50%的NaOH溶液調至pH 值為6.9（記錄用量），隨后加入MgCl2-CaCl2溶液0.2 mL、胰酶溶液0.2 mL、淀粉轉葡萄糖苷酶溶液0.4 mL，補蒸餾水至50 mL，于37 ℃搖床中，以轉速170 r/min 搖床振蕩反應，取水解樣液1 mL，置于沸水中5 min，滅酶，冷卻至室溫，取上清液進行后續試驗。

取菲林試劑4 mL 和蒸餾水6 mL，混勻，作為空白試劑，測定溶液于波長590 nm 處的吸光度。

取水解液1 mL 于試管中，加入淀粉轉葡萄糖苷酶溶液0.1 mL 和蒸餾水3.9 mL，混勻。取2 mL 混合后的溶液，加入斐林試劑4 mL 和蒸餾水3 mL，混勻。測定溶液于波長590 nm 處的吸光度。帶入標準曲線中，計算得出葡萄糖的含量，得到淀粉水解率，并繪制水解率與時間的關系曲線。

以淀粉水解率為縱坐標，時間為橫坐標，繪制淀粉水解率曲線，計算曲線下面積（AUC） 進而計算得出HI：

試驗以白面包（或葡萄糖） 作為對照，進而計算得出GI：

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 普魯蘭酶用量對黃米淀粉中抗性淀粉含量的影響

普魯蘭酶用量對黃米淀粉中抗性淀粉含量的影響見圖3。

圖3 普魯蘭酶用量對黃米淀粉中抗性淀粉含量的影響

由圖3 可知，隨著普魯蘭酶用量的增加，黃米淀粉中抗性淀粉含量呈現先升高后降低的趨勢。由圖3 可知，當普魯蘭酶用量為7 U/g 時，黃米淀粉中抗性淀粉的含量達到最高，為27.31%。出現此類情況的原因是由于隨著普魯蘭酶用量的增加，普魯蘭酶作用于α-1,6- 糖苷鍵，從而使黃米淀粉過度分解，產生過多短的淀粉鏈，不利于雙螺旋結構的形成，故抗性淀粉含量有所下降[16]。

2.1.2 普魯蘭酶酶解時間對黃米淀粉中抗性淀粉含量的影響

普魯蘭酶酶解時間對黃米淀粉中抗性淀粉含量的影響見圖4。

圖4 普魯蘭酶酶解時間對黃米淀粉中抗性淀粉含量的影響

由圖4 可知，隨著普魯蘭酶酶解時間的增加，黃米淀粉中抗性淀粉含量呈現先升高后降低的趨勢。由圖4 可知，當普魯蘭酶酶解時間為3 h 時，黃米淀粉中抗性淀粉的含量達到最高，為20.11%。出現此類情況的原因是由于普魯蘭酶專一性作用于α-1,6-糖苷鍵，經過普魯蘭酶的脫支作用后，產生大量的線性淀粉鏈，而線性淀粉鏈具有良好的移動性，易于形成有序的雙螺旋結構，促進抗性淀粉的產生，但隨著酶解時間的增加，黃米淀粉過度分解，產生過多短的淀粉鏈，不利于雙螺旋結構的形成，故抗性淀粉含量有所下降[16]。

綜合2 個因素可知，普魯蘭酶酶解黃米淀粉的最適酶用量為7 U/g，最佳酶解時間為3 h。

2.2 酶處理前后黃米淀粉理化性質的分析

2.2.1 溶解度分析

黃米淀粉在不同溫度下的溶解度對比見圖5。

圖5 黃米淀粉在不同溫度下的溶解度對比

由圖5 可知，隨著溫度的增加，原黃米淀粉與酶處理后黃米淀粉的溶解度均呈現上升趨勢，這是由于高溫破環了淀粉之間的相互作用，而使淀粉與水分子之間的相互作用增強，故隨著溫度的上升溶解度上升。在40～60 ℃時原黃米淀粉與酶處理后黃米淀粉的溶解度相差不大，酶處理后黃米淀粉的溶解度略低；在60～80 ℃時，酶處理后黃米淀粉相較于原黃米淀粉出現明顯下降，說明酶處理后黃米淀粉的鍵結合力增強。

2.2.2 透光率分析

酶解前后黃米淀粉透光率的對比見表1。

表1 酶解前后黃米淀粉透光率的對比/%

經過3 次重復試驗，結果由表1 可知，酶處理后黃米淀粉相較于原黃米淀粉透光率發生明顯下降。由于普魯蘭酶處理黃米淀粉后，酶處理后黃米淀粉中的直鏈淀粉含量相較于原黃米淀粉明顯升高，淀粉的凝沉性增強，對光的投射能力減弱，即透明度降低，當酶處理后，黃米淀粉的透光率出現明顯的降低。

2.3 酶解對糯性大黃米淀粉品質特性的影響

2.3.1 質構特性分析

餅干質構特性對比見表2。

表2 餅干質構特性對比/N

經過3 次重復試驗，結果由表2 可知，添加酶處理后黃米淀粉制作餅干，剪切力明顯上升，餅干硬度增大。這可能是由于酶處理黃米淀粉后產生部分抗性淀粉，而隨著添加酶處理后黃米淀粉的比例增大，從而導致餅干面團中的抗性淀粉含量升高，抗性淀粉對面筋網絡的形成造成了影響。因此，剪切力升高，餅干硬度增大。

2.3.2 餅干GI 值分析

添加酶處理后黃米淀粉對餅干GI 值的影響見表3。

表3 添加酶處理后黃米淀粉對餅干GI 值的影響

由表3 可知，全面粉餅干的GI 值高達78.73，為高GI 值食品（GI＞70）；酶處理后黃米淀粉餅干的GI 值明顯下降，成為中GI 值食品（50≤GI≤70）。餅干GI 值的下降，是由于酶處理后黃米淀粉中抗性淀粉的含量增加，隨著添加到面團中的酶處理后黃米淀粉的比例不斷升高，餅干中的抗性淀粉含量升高，淀粉消化減緩，故GI 值降低。

3 結論

通過使用普魯蘭酶酶解黃米淀粉，根據酶處理后黃米淀粉中的抗性淀粉含量作為指標，確定了最適酶用量為7 U/g，最佳酶處理時間為3 h。經過普魯蘭酶酶處理后的黃米淀粉的溶解度與透光率均發生不同程度的降低，說明酶處理后黃米淀粉的鍵結合力增強，直鏈淀粉含量相較于原黃米淀粉明顯升高，淀粉的凝沉性增強。通過添加酶處理后的糯性大黃米淀粉制作餅干，經過測試后發現，添加過酶處理后黃米淀粉的餅干，硬度略微增大，剪切力上升，說明抗性淀粉對面筋網絡的形成造成了影響；GI 值也出現明顯降低，由高GI 值食品降為中等GI值食品。