蕁麻多糖提取及其對HepG2細胞的降糖作用研究

楊文娟,帥召瑞,龔頻,姚文博,李楠,張嘉園,程世蕊

(陜西科技大學 食品科學與工程學院,陜西 西安,710021)

蕁麻(UrticafissaE.pritz.)屬蕁麻科一年生草本植物,具有廣泛的藥用和食用價值。蕁麻在82個國家都有作為食物的悠久歷史[1],其中含有豐富的營養物質,如蛋白質、脂肪、灰分、膳食纖維等[2]。同時蕁麻中含有豐富的微量元素,例如鈣、鉀、鍶、鐵、錳、鋅、鈉、銅等元素[3]。蕁麻也被用于很多食譜中,如蕁麻與白乳酪、土豆、蜂蜜調味肉豆蔻用來制作蕁麻美食。同時蕁麻也具有抗氧化、抗炎[4]、抗菌[5]、降血糖[6-7]等作用。大量研究表明蕁麻提取物具有一定的降糖活性,可用于治療胰島素抵抗及其糖尿病相關并發癥。如麻葉蕁麻乙醇提取物可緩解糖尿病小鼠的高血糖癥狀[8];蕁麻葉提取物通過改善記憶功能來逆轉糖尿病介導的海馬毒堿膽堿能系統的改變[9],也將其用于生產ZnO納米顆粒,進而提高ZnO的降糖作用[10]。建立3T3-L1細胞模型分析蕁麻葉提取物對胰島素刺激下神經酰胺的積累和 Akt 磷酸化的調節作用[11],通過增強Akt 磷酸化來減少神經酰胺的積累和胰島素敏感性,從而達到降糖作用。多糖是蕁麻主要活性成分之一,具有降糖、抗炎等多種藥理活性。目前,提取蕁麻多糖(polysaccharides fromUrticafissa, PUF)的方法主要有超聲輔助酶解法、回流提取、半仿生提取等方法[12]。但回流提取生產周期長,導致原料損耗大,多糖得率較低;超聲輔助酶解法由于設備因素影響,目前在產業化的利用較少。而半仿生提取法可以模仿口服藥物在胃腸道的轉運過程,采用選定pH值的酸性水和堿性水,依次連續提取得到含指標成分高的活性混合物。由于該提取溶劑更接近胃腸道的提取環境,因此可盡量多地保留有效成分,確保得到最佳有效成分[13]。

α-葡萄糖苷酶可以在低聚糖的非還原端切割α-1,4糖苷鍵釋放葡萄糖,而葡萄糖經小腸吸收進入血液,導致血糖水平上升。隨著血糖濃度的逐漸升高,胰島素與胰高血糖素的動態平衡被打破[14],從而使得胰島素促進葡萄糖攝取和利用的效率下降,從而出現胰島素抵抗。有研究表明,雞血藤水提物通過抑制α-淀粉酶,改善胰島素抵抗,起到降糖作用[15]。桔梗醇提物對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶有較強的抑制作用,同時提高IR-HepG2細胞的葡萄糖消耗量[16]。

本文以蕁麻為研究對象,采用半仿生提取法對蕁麻多糖的提取進行優化,確立最佳提取工藝。通過建立IR-HepG2模型,測定甘油三酯(triglyceride,TG)、己糖激酶(hexokinase,HK)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)、糖原含量,來評價蕁麻多糖的降糖活性與降糖機制,為蕁麻多糖在食品開發等應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蕁麻,2018年8月采自陜西旬陽;HepG2(人肝臟胚胎腫瘤細胞),購買于中國科學院上海生命科學研究院細胞庫;DMEM 高糖培養基,生工生物工程(上海)股份有限公司;胎牛血清,浙江天杭生物科技股份有限公司;細胞增殖與毒性檢測試劑盒(CCK-8),美國APExBIO生物科技有限公司;胰酶-EDTA,美國Gibco公司;重組人胰島素、葡萄糖檢測試劑盒,上海源葉生物科技有限公司;甘油三酯(TG)檢測試劑盒、丙酮酸激酶(PK)檢測試劑盒、己糖激酶(HK)檢測試劑盒、糖原檢測試劑盒,南京建成生物工程研究所;DEAE纖維素、間羥基聯苯、D-(+)-半乳糖醛酸、考馬斯亮藍 G-250、牛血清白蛋白(bovine albumin,BSA)、D-無水葡萄糖、普通透析袋、Tris、α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、DNS 試劑、4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)、阿卡波糖,上海源葉生物科技有限公司;鐵氰化鉀、硫酸亞鐵,天津市天力化學試劑公司;水楊酸、30%雙氧水,天津市紅巖化學試劑廠;氨基磺酸,天津市科密歐化學試劑有限公司;其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

TDL-40B型電子天平,上海精密科學儀器有限公司;FD-1F-50型真空冷凍干燥機,上海比郎儀器制造有限公司;BS-100A型自動部份收集器、WH-3 渦旋混合器,上海滬西分析儀器廠有限公司;Nikon Eclipse TI 倒置式生物顯微鏡,日本尼康;Varioskan flash 全波長掃描多功能讀數儀,賽默飛世爾科技有限公司(芬蘭)。

1.3 實驗方法

1.3.1 蕁麻多糖提取工藝優化

1.3.1.1 蕁麻多糖提取

取干燥蕁麻葉粉碎,過40目篩,蕁麻葉粗粉石油醚脫脂,采用半仿生提取法[17-18]提取蕁麻多糖。稱取蕁麻葉粗粉2 g,先以適量酸液進行提取(調節pH1),再以適量堿液進行提取(調節pH2),合并提取液,減壓濃縮至1/4體積后,醇沉24 h,去掉乙醇,離心10 min(8 000 r/mim),雙蒸水復溶后減壓濃縮,得到蕁麻粗多糖水溶液。Sevag法除蛋白[19],振蕩10 min后靜置,離心取上清液,減壓濃縮。在-80 ℃ 預冷凍,-56 ℃ 凍干48 h,得到蕁麻粗多糖(polysaccharides fromUrticafissa,PUF)。

1.3.1.2 蕁麻多糖提取單因素試驗

(a)pH1對多糖得率的影響

固定pH1為8、料液比為1∶20(g∶mL)、提取溫度為80 ℃、提取時間為65 min,考察pH1為1、2、3、4、5 時對多糖得率的影響。

(b)pH2對多糖得率的影響

固定pH1為3、料液比為1∶20(g∶mL)、提取溫度為 80 ℃ 提取時間為65 min,考察pH2為 7、8、9、10、11時對多糖得率的影響。

(c)料液比對多糖得率的影響

固定pH1為3、pH2為8、提取溫度為80 ℃、提取時間為65 min,考察料液比為1∶10(g∶mL)、1∶15(g∶mL)、1∶20(g∶mL)、1∶25(g∶mL)、1∶30(g∶mL)時對多糖得率的影響。

(d)提取溫度對多糖得率的影響

固定pH1為3、pH2為8、料液比為1∶15(g∶mL)、提取時間為65 min,考察取溫度為55、65、75、85、95 ℃時對多糖得率的影響。

(e)提取時間對多糖得率的影響

固定pH1為3、pH2為8、料液比為1∶15(g∶mL)、提取溫度為80 ℃,考察提取時間為 45、55、65、75、85 min時對多糖得率的影響。

1.3.1.3 響應面優化分析

選取pH1、pH2、料液比、提取溫度、提取時間作為實驗因素,采用響應面優化分析[20]建立數學回歸模型,以多糖得率為指標進行PUF提取工藝優化。

表1 響應面因素水平表Table 1 Response surface factor level table

1.3.2 蕁麻粗多糖各組分含量測定

1.3.2.1 總糖含量測定

本實驗采用苯酚硫酸法[21]測定總糖含量,于490 nm處測定吸光度,通過葡萄糖標準曲線計算PUF總糖含量。

1.3.2.2 蛋白質含量測定

本實驗采用Bradford法[22],以牛血清白蛋白(BSA)為標準品,于595 nm處進行吸光度測定,從而繪制BSA標準曲線,計算PUF蛋白質含量。

1.3.2.3 糖醛酸含量測定

本實驗采用間羥基聯苯[23]測定糖醛酸的含量,以半乳糖醛酸標準曲線為基礎,計算PUF的糖醛酸含量。

1.3.3 蕁麻多糖的純化

采用DEAE離子交換柱層析法[24]對蕁麻粗多糖進行分離純化,具體方法如下:稱取4 g PUF干燥粉末,用雙蒸水充分溶解后緩慢倒入層析柱內,依次用0、0.1、0.3、0.5 mol/L的NaCl溶液洗脫,流速為1.5 min 每管。當洗脫組分收集完全無殘留時,繪制洗脫曲線。減壓濃縮透析48 h 除去鹽及小分子物質,冷凍干燥得4份純化蕁麻多糖。

1.3.4 各純化蕁麻多糖體外降糖作用的比較

測定蕁麻多糖對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制能力,分別配制不同質量濃度的蕁麻多糖和阿卡波糖溶液(2、4、8、12、16、20 mg/mL),在α-葡萄糖苷酶抑制能力的實驗中[25],依據已有方法,其中阿卡波糖為陽性對照,于405 nm 處測定吸光度值,比較4份純化蕁麻多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率。

在α-淀粉酶抑制能力測定中[26],分別取不同濃度的蕁麻多糖和阿卡波糖加入試管中,加入α-淀粉酶溶液,37 ℃ 孵育10 min。加入1%淀粉溶液振蕩混勻,37 ℃ 孵育10 min,冷卻后加入DNS試劑終止反應。沸水浴5 min 后冷卻至室溫,用雙蒸水定容至10 mL。以阿卡波糖為陽性對照,于 540 nm 處測定吸光度值,比較4份純化蕁麻多糖對α-淀粉酶的抑制率。

1.3.5 純化蕁麻多糖 PUF3分子質量測定及單糖組成分析

1.3.5.1 分子質量測定

根據文獻[26],采用離子色譜儀分析PUF3(0.3 mol/L NaCl 洗脫組分)的分子質量。測定條件為:BRT105-104-102串聯凝膠色譜柱(8 mm×300 mm);流動相為0.05 mol/L NaCl 溶液;流速0.6 mL/min;柱溫為40 ℃;進樣量為20 μL;示差檢測器RI-10A。

1.3.5.2 單糖組成分析

參考文獻[27]方法分析樣品的單糖組成。條件為:色譜柱為SHISEIDO C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相:A:0.1 mol/L KH2PO4(pH 6.8);B:乙腈,V(A)∶V(B)=82∶18;流速為1.0 mL/min;柱溫為25 ℃;進樣量為10 μL;波長為245 nm。

1.3.6 細胞實驗

1.3.6.1 HepG2細胞的培養

HepG2細胞復蘇后培養于DMEM高糖培養基(含10% 胎牛血清,1% 青霉素-鏈霉素混合液),置于37 ℃,5% CO2培養[27]。

1.3.6.2 胰島素濃度對細胞活力的影響

以5×104cells/ mL的密度將細胞接種于96孔板培養,每孔100 μL,設置空白組、對照組、胰島素組。待細胞貼壁后,棄去舊培養基,加入無血清培養基饑餓10 h。之后分別加入含有10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L 胰島素的無血清培養基,每孔10 μL,每個濃度6個復孔。將96孔板在培養箱中孵育適當的時間長度之后向板的每個孔中加入10 μL CCK-8溶液,孵育 4 h。輕輕搖勻,在450 nm處測定吸光度值[28]。細胞活力檢測計算如公式(1)所示:

(1)

式中:A1為胰島素組吸光度;A2為空白組吸光度;A3為對照組吸光度;

1.3.6.3 IR-HepG2細胞模型的構建

以2×105cells/ mL 的密度將細胞接種于96 孔板中培養,每孔200 μL。設置空白組、模型組,每組6個復孔。模型組分別加入含有 10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L 胰島素的培養基,空白組不加胰島素。分別誘導24、48、72 h,按照葡萄糖測定試劑盒說明書的方法,測定葡萄糖含量,計算不同胰島素濃度在不同作用時間下的葡萄糖消耗量,構建IR-HepG2細胞模型。

1.3.6.4 PUF3對細胞增殖的影響

以2×105cells/ mL的密度將細胞接種于96孔板中培養,每孔200 μL。設置空白組、多糖組?？瞻捉M為不含細胞的培養基組,多糖組分別加入PUF3不同劑量62.5,250,1 000 μg/mL的完全培養液。通過細胞增殖檢測,考察PUF3高、中、低劑量對細胞增殖的影響。

1.3.6.5 PUF3對IR-HepG2細胞葡萄糖消耗量的影響

以2×105cells/ mL的密度將細胞接種于96孔板中培養。設置空白組、模型組、陽性對照組、PUF3 高中低劑量組,每組6個復孔,除空白組外所有孔加入含10-7mol/L胰島素的無血清培養基孵育48 h?？瞻捉M、模型組加入無血清培養基,陽性對照組加入含有1 000 μg/mL 二甲雙胍的無血清培養基,PUF3高中低劑量組分別加入含有62.5、250、1 000 μg/mL PUF3 的無血清培養液。試劑盒測定葡萄糖含量,計算PUF3對IR-HepG2細胞葡萄糖消耗量的影響。

1.3.6.6 PUF3對IR-HepG2細胞HK、PK、TG的影響

細胞分組及處理方式同1.3.6.5節,處理結束后,收集細胞,清洗1～2次。離心棄上清,加入1 mL PBS 重懸,冰水浴超聲破碎(功率:60 W,3～5 s 1次,間隔30 s)。參照HK、PK、TG 試劑盒說明書進行操作。

1.3.6.7 PUF3對IR-HepG2細胞糖原合成的影響

細胞分組及處理方式同1.3.6.5節,處理結束后,收集細胞。PBS 清洗1～2次。離心棄上清液,加入堿溶液 0.225 mL,沸水浴 20 min,加雙蒸水 0.225 mL,為糖原檢測液?；靹蚝蠓兴?5 min,冷卻后于 620 nm 測定吸光度。

1.4 數據分析

Design-Expert 8.0.6分析響應面實驗結果,實驗數據以平均值±標準偏差來表示,采用Origin 9.8.0進行繪圖。P<0.05表示差異顯著,P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

由圖1-a可知,隨著提取液pH1的升高,蕁麻多糖的得率先升高后降低,pH1為3時,蕁麻多糖提取率最高為6.20%。當pH1超過3時,多糖提取率出現降低的趨勢。這可能是由于在一定范圍內,酸性提取液有利于細胞纖維水解,促進多糖類成分的溶出;但酸性過強時,多糖結構中糖苷鍵被破壞,使得多糖水解。因此,最優的pH1值為3。

由圖1-b可知,隨著提取液pH2的升高,多糖得率先升高后降低,pH2為8時,多糖提取率最高為6.77%。當pH2超過8時,多糖提取率出現降低的趨勢。這可能是由于在堿性條件下,蕁麻細胞壁發生破裂,從而促進多糖的溶出;但隨著堿性的增強,多糖的糖苷鍵被破壞,多糖構象發生改變,使得多糖水解,從而降低多糖得率。因此,最優的pH2值為8。

由圖1-c可知,隨著料液比的增加,蕁麻多糖得率先升高后降低,料液比1∶15(g∶mL)時提取率最高為6.47%。當料液比超過1∶15(g∶mL)時,多糖提取率出現降低的趨勢。這可能是由于隨著溶劑體積的增大,蕁麻粉末與溶劑充分接觸,有利于溶劑進入植物細胞,從而增加多糖的釋放;當溶出達到平衡后,會導致其他物質的溶出,而降低多糖得率。因此,較佳料液比為1∶15(g∶mL)。

a-pH1;b-pH2;c-料液比;d-提取時間;e-提取溫度圖1 提取條件對蕁麻多糖得率的影響Fig.1 Effect of extraction conditions on extraction yield of the Urtica fissa polysaccharide

由圖1-d可知,隨著提取時間延長,多糖得率逐漸升高,提取時間為75 min 時,多糖得率達到6.27%。提取時間繼續延長,則多糖得率出現降低的趨勢。這可能是由于提取到一定時間,多糖溶出達到平衡,繼續提取會使其他物質溶出增多,從而降低多糖得率。且延長提取時間會增大提取成本,因此,較佳的提取時間為75 min。

由圖1-e可知,溫度在55～65 ℃ 時,提取率呈上升趨勢,65 ℃ 時提取率最高為6.47%。當溫度>65 ℃時,提取率開始下降。這可能是由于溫度過高,多糖結構被破壞,使得多糖得率降低。因此選取65 ℃為較佳的提取溫度。

2.2 響應面優化試驗結果

以pH1(A)、pH2(B)、料液比(C)、提取時間(D)、提取溫度(E)5個因素為自變量,多糖得率(Y)為響應值,進行響應面試驗設計,結果見表1。采用 Box-Behnken 中心復合設計建立數學回歸模型,得出回歸方程如下:

Y=7.33+0.088A+0.032B+0.047C+0.022D-1.875E-0.03E+0.047AB+0.028AC+0.001AD-0.011AE-0.048BC-0.013BD+0.029BE+0.015CD+0.030CE+0.023DE-0.28A2-0.11B2-0.11C2-0.069D2-0.055E2

根據表2響應面方差分析和顯著性分析可知,該模型的P<0.000 1,具有極顯著行,失擬項不顯著(P>0.000 1),R2=0.977 5,說明該模型可靠,通過F值得到蕁麻多糖得率五大因素的影響大小依次為:A>C>B>D>E。且模型中AB和BC的交互作用均為極顯著(P<0.01),AC、AD、AE、BD、BE、CD、CE、DE的交互作用不顯著。

通過分析各種交叉因素,做出響應面圖,如圖2所示。響應面的曲線變化越大,表明因素交叉的因素越明顯。由圖2可以看出,響應面的彎曲程度的大小為:AC>AB>BC>CE>BE,即pH1和料液比的響應面最為陡峭,其對多糖提取率的影響最為顯著。

表2 響應面法回歸模型方差分析Table 2 Variance analysis of response surface method regression model

應用Design-Expert V8.0.6 軟件,求解所得回歸方程,得出提取蕁麻多糖最優工藝條件:pH1為3.29、pH2為8.31、料液比為1∶15.86(g∶mL)、提取時間為76.59 min、提取溫度為65.44 ℃,預測多糖提取率為7.12%。之后對該參數進行驗證,結合實際條件調整提取參數為pH1為3、pH2為8、料液比為1∶16(g∶mL)、提取時間為77 min、提取溫度為 65 ℃,多糖提取率為 7.04%,與單因素預測值差異較小,說明方法可行。

2.3 蕁麻多糖各組分含量

由圖3可知,通過苯酚-硫酸法測定得到蕁麻多糖的總糖含量為78.48%;考馬斯亮藍法測定蛋白含量,得出蕁麻多糖的蛋白含量為5.34%;間羥基聯苯法測定糖醛酸含量,得到蕁麻多糖的糖醛酸含量為16.12%。

a-葡萄糖含量;b-BSA含量;c-糖醛酸含量圖3 蕁麻多糖各組分含量標準曲線Fig.3 Standard curve of each component content of Urtica fissa polysaccharide

2.4 蕁麻多糖分離純化結果

采用DEAE-纖維素離子層析柱對蕁麻粗多糖進行分離和純化,其洗脫曲線如圖4所示。由圖4可知,經過DEAE 纖維素柱層析出現4個較為明顯的洗脫峰。透析、冷凍干燥得4種純化蕁麻多糖分別為:PUF1(0 mol/L NaCl 洗脫組分)、PUF2(0.1 mol/L NaCl 洗脫組分)、PUF3(0.3 mol/L NaCl洗脫組分)、PUBZ(0.5 mol/L NaCl 洗脫組分)。

圖4 DEAE纖維素柱層析洗脫曲線Fig.4 DEAE fiber column elution curve

2.5 各純化蕁麻多糖體外降糖作用的比較結果

蕁麻多糖的體外降糖活性結果見圖5。如圖5-a所示,各純化蕁麻多糖均具有較好的α-葡萄糖苷酶抑制能力,且蕁麻多糖對α-葡萄糖苷酶抑制率隨著濃度的增加而增強,當多糖質量濃度為20 mg/mL,各純化蕁麻多糖的α-葡萄糖苷酶的抑制率均達到最高。其中PUF3對α-葡萄糖苷酶的抑制能力最強,其抑制率為69.48%。各純化蕁麻多糖對α-淀粉酶抑制能力測定的結果見圖5-b所示,4種純化蕁麻多糖均具有α-淀粉酶抑制能力,且當多糖質量濃度為20 mg/mL 時,4種純化蕁麻多糖的α-淀粉酶抑制率均最高,其中PUF3對α-淀粉酶的抑制能力最強,其為89.45%。表明本研究提取純化的蕁麻多糖能夠通過抑制α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶而表現為降糖作用,其中降糖作用最強的是PUF3。

a-α-葡萄糖苷酶;b-α-淀粉酶圖5 蕁麻多糖各組分對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制能力Fig.5 α-Glucosidase inhibition test and α-amylase inhibition test of Urtica fissa polysaccharide component

2.6 純化蕁麻多糖 PUF3分子質量測定及單糖組成分析

2.6.1 分子質量測定

如圖6所示,根據葡聚糖的相對分子質量及譜圖分析,其存在時間為 35.333 min,通過方程換算得到:蕁麻多糖PUF3的Mw為3.07×105Da,Mn為1.65×105Da,Mp為2.26×105Da。

2.6.2 單糖組成分析

由圖7可知,PUF3中含有甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖以及巖藻糖,摩爾比1.32∶0.65∶14.76∶2.49∶5.20∶3.13∶27.13∶20.90∶1.16,表明PUF3 是一種雜多糖,半乳糖和阿拉伯糖是其主要單糖組分。

2.7 胰島素濃度對細胞活力的影響

由圖8可知,胰島素濃度為10-9～10-5mol/L,均對細胞存活率無顯著影響,存活率都在90%以上,可作為建模安全濃度范圍。

a-葡聚糖相對分子質量;b-蕁麻多糖 PUF3 的分子質量分布圖6 蕁麻多糖 PUF3 的分子質量分布圖Fig.6 Urtica fiss polysaccharide PUF3 molecular weight distribution

2.8 IR-HepG2細胞模型的構建

如圖9所示,加入濃度為10-9～10-5mol/L的胰島素,IR-HepG2細胞葡萄糖消耗量均顯著降低(P<0.05,P<0.001)。與空白組(Control)相比,10-7mol/L的胰島素葡萄糖消耗量最小。因此,將此濃度作為 HepG2細胞胰島素抵抗模型的最佳濃度。在10-7mol/L最佳胰島素濃度的作用下,分別處理細胞24、48、72 h,發現在48 h時,與Control組相比,葡萄糖消耗量下降53.44%。因此,選擇胰島素的濃度為10-7mol/L,作用時間48 h 可以成功構建IR-HepG2細胞模型。

1-甘露糖;2-核糖;3-鼠李糖;4-葡萄糖醛酸;5-半乳糖醛酸; 6-葡萄糖;7-半乳糖;8-木糖;9-阿拉伯糖;10-巖藻糖 a-混合標準單糖;b-蕁麻多糖 PUF3圖7 標準品及PUF3 的液相色譜圖Fig.7 Liquid chromatogram of PUF3 and standards

圖8 胰島素濃度對 HepG2 細胞活力的影響Fig.8 The effect of insulin concentration on the viability of HepG2 cells

2.9 PUF3對細胞增殖的影響

由圖10可以看出,PUF3不影響 HepG2細胞增殖,3個劑量作用下的細胞存活率均高于90%,表明PUF3基本無細胞毒性。

2.10 PUF3 對 IR-HepG2細胞葡萄糖消耗量的影響

由圖11可知,與Control相比,PUF3低、中、高濃度均能促進IR-HepG2細胞對葡萄糖的吸收,具有統計學差異(P<0.05,P<0.01)。并且葡萄糖的消耗量隨PUF3濃度的增加而增加。研究發現,在3T3-L1細胞中,葡萄糖消耗顯著增加可以促進胰島素的作用強度,進而達到降糖作用[29]。由此可知,PUF3可能通過增加葡萄糖消耗量而表現為降糖作用。

a-胰島素濃度;b-胰島素作用時間圖9 HepG2 細胞葡萄糖消耗量Fig.9 Glucose consumption in HepG2 cells注:與Control相比,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001。

圖10 多糖 PUF3 對 IR-HepG2 細胞存活率的影響Fig.10 Effect of polysaccharide PUF3 on the survival rate of IR-HepG2 cells

圖11 多糖 PUF3 對 IR-HepG2 細胞內葡萄糖消耗量的影響Fig.11 Effect of polysaccharide PUF3 on intracellular glucose consumption of IR-HepG2注:與Control組相比,###P<0.001;與IR組相比,*P<0.05, **P<0.01,***P<0.001。

2.11 PUF3對IR-HepG2細胞中HK、PK、TG的影響

PUF3對IR-HepG2細胞中HK、PK、TG含量測定結果如圖12所示。由圖12-a、圖12-b可知,與Control相比PUF3低、中、高濃度均能上調IR-HepG2細胞的HK、PK活力,PK含量隨PUF3濃度的增加而上升(P<0.05,P<0.01),而在PUF3-M濃度處理下,HK活力最高。已知調節HK、PK活性是促進葡萄糖代謝的作用環節之一[30]。因此PUF3可能通過增加IR-HepG2細胞內HK、PK活性而促進糖代謝,進而發揮降糖作用。

由圖12-c可知,PUF3 低、中、高濃度均能降低IR-HepG2細胞的TG含量,具有統計學差異(P<0.05)。并且TG含量隨 PUF3 濃度的增加而降低,呈濃度依賴性。已知可以通過抑制細胞的TG積累來改善IR[31]。由此可知,PUF3可通過降低IR-HepG2細胞內TG,從而達到降糖作用。

a-HK;b-PK;c-TG圖12 PUF3 對 IR-HepG2細胞內HK、PK、TG 含量的影響Fig.12 Effect of PUF3 on HK、PK、TG in IR-HepG2 cells注:與Control 組相比,###P <0.001;與 IR 組相比,*P<0.05,**P<0.01,*** P<0.001。

2.12 PUF3對IR-HepG2細胞糖原合成的影響

機體存在胰島素抵抗,對胰島素敏感性降低,繼而降低了胰島素刺激的肝糖原合成。如圖13所示,與空白組(Control)相比,PUF3 低、中、高濃度均能上調IR-HepG2細胞的糖原含量,并且糖PUF3原含量隨 PUF3 濃度的增加而增加。其中 PUF3-H 影響顯著(P<0.05)。PUF3 低、中、高濃度的糖原含量與 IR 組相比分別上升了3.89%、5.20%、7.88%。

CAO等[32]通過研究發現馬尾藻多糖能促進糖原合成,從而降低葡萄糖含量。由此可知,PUF3可通過增加IR-HepG2細胞內糖原含量,促進糖代謝,從而達到降糖作用。

圖13 PUF3 對 IR-HepG2 細胞內糖原含量的影響Fig.13 Effect of UF3 on the glycogen content in IR-HepG2 cells注:與Control 組相比,###P<0.001;與 IR 組相比, *P <0.05,***P <0.001。

3 結論與討論

有效成分經口服進入人體后,其消化與吸收受到胃腸道pH環境的影響,采用半仿生提取法符合人體對藥物的吸收特性,能使藥效物質最大限度地提取出來,能保持其原有的功效。

因此,本次實驗采用半仿生提取法提取多糖,通過單因素實驗分析pH1、pH2、料液比、提取溫度、提取時間各因素對蕁麻多糖得率的影響,利用響應面優化蕁麻多糖提取工藝,得到最佳提取工藝條件為:pH1為3、pH2為8、料液比為1∶16(g∶mL)、提取溫度為65 ℃、提取時間為77 min,蕁麻多糖得率為7.04%,基本與響應面模型的理論預測值相符。試驗提取條件和因素水平設置合理,證明此模型預測結果準確,可用于蕁麻多糖提取的工藝優化。多糖的構型十分復雜,需要多種分析方法進行測定,本文通過測定分子質量、單糖組成,初步表征PUF3結構表明,PUF3Mw為3.07×105Da,Mn為 1.65×105Da,Mp為 2.26×105Da,主要由甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、巖藻糖構成,摩爾比為 1.32∶0.65∶14.76∶2.49∶5.20∶3.13∶27.13∶20.90∶1.16, 說明PUF3是一種雜多糖。

胰島素抵抗為Ⅱ型糖尿病的主要發病機制之一,可通過有效成分干預從而改善胰島素抵抗狀態,有助于改善糖尿病。本研究表明在PUF3高濃度作用下,IR-HepG2細胞的葡萄糖消耗量最高,為IR 組的1.85倍。同時,PUF3 能顯著增加 IR-HepG2細胞內 PK、HK 活力及糖原含量,促進糖代謝,進而實現降糖作用, 為蕁麻多糖在食品開發等應用提供理論基礎。