不同來源胰蛋白酶的基因挖掘、在Komagataella phaffii GS115的 異源表達及其酶學性質分析

何林曼,鈕成拓,劉國正,鄭飛云,劉春鳳,王金晶,李崎*

1(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122) 2(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)

胰蛋白酶(EC 3.4.21.4)屬于絲氨酸蛋白酶家族,在水解蛋白質肽鏈中精氨酸或賴氨酸殘基的羧基末端的肽或酰胺鍵方面具有高度選擇性和特異性[1-2]。胰蛋白酶被廣泛用于制革、食品加工、制藥、生化檢測和洗滌劑等多種行業[3-4]。在制革工業中,胰蛋白酶用于局部鞣革及皮革脫灰軟化,這一步可以起到清除裸皮中的皮垢、纖維基質,疏松膠原調節皮革松緊度的作用,從而使皮革的柔軟度更豐滿、皮面更光滑富彈性[5-6],也可以利用胰蛋白酶提取具有良好生物相容性和生物降解性的膠原蛋白[7]。在制藥工業中,胰蛋白酶可用于水解變性蛋白質,或將蛋白質水解成低分子質量的肽和氨基酸[8],以達到脫敏的目的[5]。在食品工業中,胰蛋白酶的應用集中于水解價值較高的動植物性蛋白、脂肪和淀粉等。

胰蛋白酶最初在牛的胰腺中被發現[9]。如今,胰蛋白酶已從各種來源中被分離出來,比如哺乳動物[7](人、牛、豬和狗)和無脊椎動物。近年來,微生物來源胰蛋白酶也被發現,比如Streptomycesgriseus[8]和Bacilluslicheniformis[10]。過去胰蛋白酶的商業化生產主要依賴?；蚱渌溉閯游锏囊认俳M織提取[9],然而這種方法存在生產成本高、與結構和功能特性相似的蛋白酶α-糜蛋白酶有污染、穩定性低、純度低、污染性強等缺點,阻礙了其深入應用[11]。將胰蛋白酶在微生物中進行異源表達可以短時間內產生大量的活性胰蛋白酶[12],并通過改造和發酵優化可以提高表達量和改善催化性質等,為其在醫療、皮革行業中的應用等提供了更多可能性。

如今,人、牛[13]、魚[14]和蝦[15-16]來源的胰蛋白酶已經成功在大腸桿菌中表達。然而,大腸桿菌的成熟胰蛋白酶產量很低,且通常以包涵體的形式出現[17]。與大腸桿菌表達系統相比,法夫駒形氏酵母表達系統更適合重組蛋白的表達,尤其適合表達一些需要進行糖基化或二硫鍵形成的蛋白[18]。胰蛋白酶原可以在K.phaffii中以可溶性形式表達[19],但其激活依賴于用腸激酶或者胰蛋白酶消化,且產量低、后續沒有很多關于酶學性質的報道。目前有研究報道的微生物源胰蛋白酶主要為灰色鏈霉菌胰蛋白酶(Streptomycesgriseustrypsin, SGT),其以胰蛋白酶形式在K.phaffiiGS115、大腸桿菌、變鉛青鏈霉菌、枯草芽孢桿菌中均成功實現了異源表達。弗氏鏈霉菌胰蛋白酶(Streptomycesfradiaetrypsin, SFT)和SGT的氨基酸同源性高達85%,但是SFT的異源表達目前只在變鉛青鏈霉菌和大腸桿菌中有過報道,且酶活僅為22～29 mU/mL,具有較大的優化潛力。

本研究通過基因挖掘策略獲得了4種不同來源的胰蛋白酶基因,并成功在K.phaffiiGS115中異源表達。進分析了重組酶的酶學性質,為后續重組酶的分子改造及應用奠定基礎。本文為首次報道弗氏鏈霉菌來源胰蛋白酶在法夫駒形氏酵母中異源表達。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株與質粒

EscherichiacoliJM109、K.phaffiiGS115和質粒pPIC9k均保藏于本實驗室。

1.1.2 主要試劑

DNA maker、感受態細胞制備試劑盒、DNA限制性內切酶,大連TaKaRa公司;硫酸卡那鏈霉素, Sigma公司;質粒提取劑盒、Cycle Pure試劑盒,OMEGA Bio-tek公司;底物BAPNA,上海源葉生物公司;NI-NT純化樹脂預裝柱、改良型Bradford法蛋白濃度試劑盒、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、腸激酶(100 IU),生物工程(上海)有限公司;NaCl、甘油、胰蛋白胨、瓊脂粉,國藥集團有限公司。

1.1.3 培養基

LB培養基(g/L)(氯化鈉10、蛋白胨10、酵母提取物10)用于培養E.coliJM109,根據需要加入50 μg/mL 硫酸卡那鏈霉素。YPD培養基(g/L)(酵母提取物10、蛋白胨20、葡萄糖20)用于培養K.phaffiiGS115。固體培養基按照15 g/L添加瓊脂。緩沖甘油復合培養基(buffered minimal glycerol medium, BMGY)(g/L)(酵母提取物10、胰蛋白胨20、甘油10、磷酸二氫鉀100 mmol/L、YNB 13.4,pH6.0)作為培養基用于誘導前的菌體生長。緩沖甲醇復合培養基(buffered methanol-complex medium, BMMY)(g/L)(酵母提取物10、胰蛋白胨20、磷酸二氫鉀100 mmol/L、YNB 13.4,pH 6.0)作為發酵培養基用于重組菌產酶。

1.2 儀器與設備

SPX-250生化培養箱,上海躍進醫療器械廠;全自動高壓蒸汽滅菌鍋,日本HIRAYAMA株式會社;PL2002電子天平,METTLER TOLEDO公司;電子數顯pH計,德國Mettler Toledo公司;10 μL-1 mL各種不同型號的移液槍,德國Eppendorf公司;紫外-可見分光光度計,上海MAPADA儀器有限公司;T100 Thermal Cycle PCR儀,美國Bio-Rad公司;GelDoc-ItTM 凝膠成像系統;美國UVP公司;Powerpac Basic蛋白電泳儀,美國Bio-Rad公司;MICROL 17臺式高速離心機,美國Thermo Scientific公司;恒溫水浴鍋,金壇市宏華儀器廠;KTA蛋白純化系統,美國GE HealthCare公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 基因挖掘和胰蛋白酶基因序列分析

通過NCBI數據庫的BLAST對胰蛋白酶基因進行挖掘,使用來自Streptomycesgriseus(Genbank No.M64471.1)和Bovine(Genbank No.X54703.1)的胰蛋白酶序列作為模板。選取與模板氨基酸序列同源性大于60%的潛在胰蛋白酶基因,用MEGA6軟件搭建胰蛋白酶進化樹,同時采用BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和Clustal W軟件對得到的胰蛋白酶氨基酸序列進行比對,以確保相應序列中存在保守的催化區域。

1.3.2 重組菌株的構建

從基因組挖掘中獲得的胰蛋白酶編碼基因送至金唯智(蘇州)經過密碼子優化后合成,并連接到質粒pPIC9k。將重組質粒轉化到E.coliJM109,于含有50 μg/mL硫酸卡那霉素的LB平板上,在37 ℃培養12 h,從平板上挑出單個菌落,通過菌落PCR進行驗證。將陽性轉化體轉移到含有50 μg/mL硫酸卡那霉素的LB液體培養基中,在37 ℃、180 r/min培養12 h收集菌體提取質粒。提取的質粒用SalI限制性酶進行線性化處理后通過Cycle Pure Kit(OMEGA Bio-tek,美國)回收。將線性化載體通過電擊轉化至K.phaffiiGS115感受態細胞。使用pPIC9k通用引物(α-factor)進行PCR驗證,將驗證正確的轉化子用于后續誘導培養。

1.3.3 重組胰蛋白酶的表達和純化

將陽性轉化子接種到BMGY培養基中,在30 ℃、180 r/min培養至OD600值達到2.0～6.0時,將溶液轉移到50 mL無菌離心管中,以4 000 r/min離心5 min以去除上清液后。將收集的細胞與5 mL無菌生理鹽水混合,在4 000 r/min離心5 min洗滌菌液。上述洗滌過程重復2次之后,用BMMY培養基重新懸浮清洗過的酵母細胞,直到OD600值為1.0,并在30 ℃、180 r/min培養。在培養過程中,每24 h加入甲醇,最終質量濃度為10 g/L,以誘導外源蛋白的表達。

重組胰蛋白酶通過Ni-NTA重力柱純化,使用20～500 mmol/L線性梯度的咪唑溶液。為了防止重力柱的堵塞,粗酶液在純化前通過0.45 μm的濾膜進行過濾。梯度洗脫緩沖液被設定為20、50、350、500 mmol/L,目標蛋白在350 mmol/L咪唑濃度下被洗脫。用截留分子質量為10 kDa的蛋白質超濾管(PALL,美國)濃縮洗脫液,用PD-10脫鹽柱(GE healthcare,美國)進行脫鹽。收集樣品用于后續SDS-PAGE的分析。蛋白濃度用Bradford蛋白濃度測定試劑盒(上海生工)進行測定。

1.3.4 重組胰蛋白酶的活化

經過誘導表達和純化,得到的胰蛋白酶以酶原形式存在。為獲得活性胰蛋白酶,將90 μL重組胰蛋白酶原與0.4 μL牛腸激酶(100 IU,S10204,中國源葉)混合,在25 ℃孵育16 h。

1.3.5 重組胰蛋白酶的酶活性測定

將43.5 mgN-苯甲?；?DL-精氨酰-4-硝基苯胺鹽酸鹽(N-Benzoyl-DL-arginine-4-nitroanilidehydrochloride,BAPNA)溶解于1 mL二甲基亞砜中,之后再將該混合體系溶解于含有10 mmol/L CaCl2的pH 8.0,50 mmol/L Tris-HCL緩沖液。在25 ℃下,測定200 μL粗酶液同3 mL BAPNA底物溶液在光徑1 cm的比色皿中,在410 nm下10 min內的吸光值變化。在25 ℃和pH 8.0條件下,ΔA410/min增加0.001被定義為胰蛋白酶的一個酰胺酶水解單位。酶活計算如公式(1)所示:

(1)

式中:BAPNA unit,酰胺酶酶活,U/mL;0.2,加入酶液體積,mL。

1.3.6 酶學性質測定

通過測量不同溫度(20、30、40、50、60、70、80 ℃)和不同pH值(4、5、6、7、8、9、10)下胰蛋白酶的活性,繪制胰蛋白酶在不同溫度或pH下的酶活曲線。最高的胰蛋白酶活性被記錄為100%,而其他酶以酶活性的相對百分比表示。通過將胰蛋白酶在BR緩沖液(pH 4～5.5,pH 8.5～10)和磷酸鹽緩沖液(pH 6～8)中孵育1 h后測定酶活性評估胰蛋白酶的pH穩定性。用處理后測定的酶活性除以未處理測得的酶活性,計算出殘余活性的相對百分比。在最適條件下,測量胰蛋白酶在不同濃度(0.01～0.1 mmol/L)底物BAPNA下的反應速率,由雙倒數法來計算Km和Vmax值。Vmax除以對應的蛋白摩爾數即為轉化數kcat值。

1.3.7 生物信息學和統計分析

胰蛋白酶結構的同源模型是通過SWISS-MODEL在線服務器(https://swissmodel.expasy.org/)完成,通過pymol軟件實現酶三維結構的可視化分析。由Invitrogen Vector NTI Advance 11.5軟件完成序列比對和核苷酸序列比對分析。由ExPASy Prot Param軟件分析酶的理論蛋白質分子質量和理論等電點,由SignalP4.0軟件預測胰蛋白酶基因的信號肽。由Prism 9軟件進行數理統計分析。

2 結果與分析

2.1 胰蛋白酶基因挖掘

基于BLAST分析,以灰色鏈霉菌胰蛋白酶基因(Genbank No.M64471.1)和牛胰蛋白酶基因(Genbank No.X54703.1)為模板,共獲得194個胰蛋白酶基因,并構建了進化樹。如圖1-A所示,挖掘得到的胰蛋白酶基因可分為真核生物來源酶、細菌來源酶和古細菌來源酶三大類?；诓溉閯游镌?、甲殼動物源、微生物源胰蛋白酶在法夫駒形氏酵母中表達情況的不同,本文選擇了4個不同來源胰蛋白酶基因進行進一步分析,包括來自Homo spanies(GenBank No.AAA61232.1)、Bos taurus(GenBank No.CAA38513.1)、Penaeus vannamei(GenBank No.AEZ67461.1)和S.fradiaeATCC14544(GenBank No.BAA04089.1)的胰蛋白酶基因,其詳細信息如表1所示。通過酶氨基酸序列比對,發現4個來源胰蛋白酶基因中均具有絲氨酸蛋白酶保守的組氨酸H57,天門冬氨酸D102和絲氨酸S195催化三聯體(圖1-B)[20]。進一步通過在線同源建模4個不同來源胰蛋白酶的三維結構,發現這4種胰蛋白酶具有相似的晶體結構,主要由2個雙平行且相互間有一定的角度的b-疏水桶狀結構域組成(圖1-C)。

表1 通過基因挖掘篩選出的胰蛋白酶基因的信息Table 1 Information of trypsin genes screened by genome mining

A-胰蛋白酶進化樹;B-催化保守區域序列比對;C-三維結構圖1 基因挖掘與生物信息學分析Fig.1 Gene mining and bioinformatics analysis

2.2 胰蛋白酶在K.phaffii GS115中的異源表達和純化

由于K.phaffii表達系統具有生長速度快、易于操作、表達穩定和產量大等特點,因此是更適于胰蛋白酶的異源表達[21]。質粒pPIC9k是一種帶有AOX1啟動子的分泌型表達載體,廣泛用于K.phaffii表達系統。經密碼子優化后,將人源胰蛋白酶(homo spanies trypsin, HST)、牛源胰蛋白酶(bos taurus trypsin, BTT)、蝦源胰蛋白酶(penaeus vannamei trypsin, PVT)和弗氏鏈霉菌源胰蛋白酶基因通過E.coliJM109連接到pPIC9k質粒中,得到pPIC9k-hst、pPIC9k-btt、pPIC9k-pvt和pPIC9k-sft重組質粒,并成功轉化到K.phaffiiGS115。在BMGY培養基中測定了攜帶異源胰蛋白酶基因的重組K.phaffiiGS115的生長曲線。如圖2所示,攜帶pPIC9k-sft的重組K.phaffii菌株的生長曲線與野生型菌株相似,且其生長速度優于攜帶其他3種胰蛋白酶基因的重組菌株。攜帶pPIC9k-sft的重組K.phaffii菌株在穩定期的平均OD600值達到12.4,顯著高于攜帶pPIC9k-hst(8.2)、pPIC9k-btt(3.3)和pPIC9k-pvt(9.4)的重組菌(P<0.05)。此外,攜帶pPIC9k-sft的重組K.phaffii菌株的遲滯期時間也較短。因此,來自微生物的胰蛋白酶可能具有在K.phaffii中表達的潛在價值。

圖2 重組K.phaffii菌株生長曲線Fig.2 Growth curves of recombinant K.phaffii strain

為了進一步評估4種胰蛋白酶的酶學特性,將重組K.phaffii菌株的粗酶液進行濃縮并通過SDS-PAGE進行分析。如圖3-A所示,HST、BTT、PVT和SFT的上清粗酶液中均觀察到了對應蛋白條帶,4種胰蛋白酶的蛋白分子質量分別為40、43、55、27 kDa,與理論分子質量一致。上述結果表明4種來源的胰蛋白酶在K.phaffii中均被成功表達。在此基礎上,通過Ni2+親和色譜法純化重組胰蛋白酶。如圖3-B所示,4種胰蛋白酶被成功純化。此外,在SDS-PAGE膠上還觀察到一些小分子質量的蛋白肽段,這些可能是由胰蛋白酶降解自身序列中的精氨酸和賴氨酸從而產生的自降解條帶[22-23]。

M-Maker;H-Homo spanies trypsin;B-Bos taurus trypsin; P-Penaeus vannamei trypsin;S-S.fradiae trypsin A-異源表達結果;B-蛋白純化結果圖3 不同來源胰蛋白酶的表達與純化Fig.3 Expression and purification of trypsin from different sources

2.3 不同來源胰蛋白酶的酶學特性分析

測定了4種不同來源胰蛋白酶的酶學特性。如圖4-A所示,HST、BTT、PVT和SFT的最適溫度分別為20、35、40、45 ℃。由于皮革加工的最佳溫度為30～45 ℃[24],因此,HST不適合應用于皮革加工。如圖4-B所示,HST、BTT、PVT和SFT的最佳pH值分別為9、8.5、8.5、9。其中HST和SFT在pH 8～10能保持至少80%的酶活性,所以他們在堿性環境中具有更強的耐受能力。為了分析胰蛋白酶在堿性環境中的穩定性,將這4種胰蛋白酶在pH 6～11的緩沖液中處理1 h后,在最適條件下測量其剩余活性。如圖4-C所示,4個來源的胰蛋白酶在pH 7～9的緩沖液處理后都能保持大于80%的活性。其中,SFT的耐堿性最強,其在pH 9～10緩沖液處理后殘留的酶活性至少保持90%以上的酶活,而其他3種胰蛋白酶的剩余酶活均不足70%。進一步測定了重組胰蛋白酶的酶活和比酶活。如圖4-D所示,經100 IU腸激酶激活后,HST、BTT、PVT和SFT上清液的酶活性分別為(18.6±1.1)、(12.3±1.7)、(44.7±0.5)、(13.8±2.7)BAPNA U/mL,而這4種胰蛋白酶的比酶活分別為37.2、23.3、43.3、12.3 U/mg。由此可見,SFT在相對較高的溫度和堿性條件下具有較高的穩定性,然而其催化性質相對略低。因此,SFT在堿性工業條件下可能具有較好的應用價值,但仍需通過酶工程改造提升其催化性質。

A-最適溫度;B-最適pH;C-pH穩定性;D-催化性質圖4 不同來源胰蛋白酶的酶學性質Fig.4 Enzymatic properties of trypsin from different sources

3 結論

本研究通過基因挖掘從數據庫中篩選得到了4種分別來源于Homospanies、Bostaurus、Penaeusvannamei和S.fradiaeATCC14544的胰蛋白酶基因,并在K.phaffiiGS115中成功實現了異源表達。通過對4株K.phaffii重組菌株的生長情況以及酶學性質比較,發現含有S.fradiae來源胰蛋白酶基因的重組K.phaffii具有較好的生長能力,且該酶具有較好的溫度和堿性環境耐受能力。然而,由于該酶的催化性質低于其他來源胰蛋白酶,因此后續將進一步通過酶工程改造手段提高其催化活性。