Expi293F表達重組鱟C因子用于熒光法內毒素檢測

柯文鋒,李詩潔,鄭夢林,白仲虎,楊艷坤*

1(江南大學,工業生物技術教育部重點實驗室,江蘇 無錫,214122) 2(江南大學,糧食發酵與食品生物制造國家工程研究中心,江蘇 無錫,214122) 3(江蘇省生物活性制品加工工程技術研究中心,江蘇 無錫,214122)

細菌內毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁裂解后釋放的毒素,又稱之為“熱原”,其主要成分為脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),極微量(1～5 ng/kg體重)進入人體內后可導致炎癥、休克、敗血癥、多器官功能衰竭甚至死亡[1]。因其普遍存在環境中且難以滅活[2],所以高靈敏度的內毒素檢測方法是開發生物制藥產品的關鍵。自20世紀80年代初以來,鱟試劑已廣泛用于制藥工業中細菌內毒素的檢測。它的檢測原理是鱟試劑中的C因子與內毒素特異性結合,啟動級聯反應,最終導致凝固素凝膠的形成,通過光度測定法檢測[3]。鱟試劑具有簡單、快速、靈敏度高等特點[4]。但鱟試劑只能通過收集鱟血淋巴生產,以及近年來的海洋環境惡化、人類肆意捕食[5],導致鱟資源急劇減少,直接從鱟活體分離鱟試劑已經受到了很大的限制[6]。

于是人們開發出不依靠鱟淋巴的新一代檢測內毒素的試劑盒——基因重組熒光法[7],采用基因重組技術,在真核細胞表達重組C因子(recombinant factor C,rfc)。C因子是一種絲氨酸蛋白酶原,具有雙鏈結構(圖1),內毒素與其重鏈結合,使輕鏈發生自剪切[8],從而特異性切割熒光底物。與內毒素結合之后由無活性的蛋白酶原轉變成具有生物活性的蛋白酶[9],識別并催化下游熒光底物產生熒光信號,熒光信號的強度和內毒素濃度成正相關,從而定量檢測內毒素[10]?；蚬こ讨苽渚哂辛己玫那熬?。但由于表達過程中非常容易引入外源LPS,而鱟C因子又對環境中的內毒素極其敏感,這就大大降低了表達出的天然C因子的活性?？刂票磉_環節的內毒素難度大,成本高,導致目前市面上商業化售賣的重組熒光法試劑盒價格非常昂貴,因此構建有效的rfc重組表達體系十分必要。

圖1 C因子的結構Fig.1 Structure of factor C

因此本課題組克隆了來源于東方鱟(Tachypleustridentatus)中C因子的全基因序列[11],首次在人胚胎腎臟細胞Expi293F中進行了重組表達。經檢測,rfc在胞外可溶分泌表達,大小與預測一致,初始純度為48%,經鎳柱純化后的rfc純度達到98%,得率為56%,相比于SF9細胞,蛋白表達量(19.81 mg/L)提高了113%,大大降低了表達成本。具有與內毒素結合并切割熒光底物的生物學活性。這一表達體系將為重組法試劑盒的開發提供一條嶄新的途徑,為內毒素檢測做出貢獻。

1 材料與方法

1.1 菌株、細胞及質粒

大腸桿菌(Escherichiacoli) JM108、Expi293F,ThermoFisher;pcDNA3.4為實驗室保存。

1.1.1 主要試劑

無內毒素質粒提取試劑盒、瓊脂糖純化試劑盒,康為世紀公司;DNA限制性內切酶、Primer STAR Max DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶,Takara公司;MultiF Seamless Assembly Mix,ABclonal公司;蛋白上樣緩沖液Loading Buffer、蛋白電泳緩沖液、轉膜緩沖液、蛋白Marker、蛋白膠試劑盒、HRP顯色液,翌生生物公司;HRP標記6×His標簽的單克隆抗體、Flag(DYDKKKK)標簽的多克隆抗體、HRP標記的羊抗兔二抗,三鷹生物;蛋白純化柱(HisTrap excel),cytiva公司;超濾管,Millipore公司;BCA蛋白濃度檢測試劑盒,碧云天生物公司;重組C因子內毒素檢測試劑盒,Lonza公司;內毒素標準品、無內毒素檢查用水,廈門鱟試劑實驗廠有限公司;Expifectamine 293轉染試劑、Expi293TM表達培養基、補料培養基Expifectamine Transfection Enhancer 1和Transfection Enhancer 2、Opti-Mem無血清培養基,ThermoFisher公司;其余常見試劑均購自國藥集團。

1.1.2 培養基

2×YT液體培養基(g/L):蛋白胨16,酵母提取物10,NaCl 5,自然pH;

2×YT固體培養基(g/L):蛋白胨16,酵母提取物10,NaCl 5,瓊脂粉15,自然pH。

1.2 實驗方法

1.2.1 rfc基因的克隆與載體的構建

根據Uniprot網站(https://beta.uniprot.org/uniprotkb/P28175/entry)注釋的rfc的信號肽氨基酸序列,為rfc的前25個氨基酸(MVLASFLVSGLVLGILAQQMRPVQS),猜測此信號肽會影響C因子在Expi293F細胞中的分泌,故使用實驗室保存的信號肽序列替換掉原始信號肽。使用表1中的引物rfcF和rfcR,以合成的人源密碼子優化后的質粒pTT5-rfc為模板,用高保真DNA聚合酶Primer STAR進行PCR擴增。擴增程序為:98 ℃預變性5 min;98 ℃變性10 s,56 ℃退火15 s,72 ℃延伸30 s,循環35次;72 ℃延伸5 min,擴增后的產物通過瓊脂糖核酸電泳檢測,并通過膠回收試劑盒純化回收,獲得不帶信號肽的rfc片段;以實驗室保存的pcDNA3.4載體(含信號肽序列:MGWSCIILFLVATATGVHS)為模板,rfcXF和rfcXR為引物,進行PCR擴增,延伸時間為1 min,其他程序與上述程序一致,擴增后的產物通過瓊脂糖核酸電泳檢測,并通過膠回收試劑盒純化回收,獲得具有與rfc片段兩端有共同20 bp的同源臂的線性化載體。將rfc片段與線性化的載體pcDNA3.4用同源重組酶重組,重組體系為:3 μL片段+2 μL載體+5 μL ABI克隆酶,50 ℃保溫40 min。將重組產物全部轉化至JM108感受態細胞中,涂板至含有氨芐青霉素的2×YT固體平板,挑取6個轉化子為模板,以rfcJF和rfcJR為引物,用TaqDNA聚合酶進行菌落PCR初步驗證,挑選2個核酸電泳檢測為陽性的轉化子,送金唯智公司進行測序,測序正確的菌株轉接到2×YT液體培養基(含有氨芐青霉素)過夜培養,按照無內毒素質粒提取說明書提取質粒,得到重組質粒pcDNA3.4-rfc。

表1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in the study

1.2.2 細胞轉染表達rfc

傳代培養并擴增Expi293F細胞,直至細胞密度達到約3～5×106個活細胞/mL,然后轉染前1 d將Expi293F細胞接種至2.5～3×106個活細胞每毫升的最終密度,讓細胞過夜培養。轉染當天測定活細胞密度和存活率,活細胞密度和活細胞百分比應分別為4.5～5.5×106個和≥95%。然后進行轉染,將37 ℃溫育后的Opti-MEM培養基分別稀釋質粒DNA(1.0 μg/mL細胞體積)與轉染試劑Expifectamine 293,室溫孵育5 min,向稀釋后的質粒DNA中加入稀釋后的Expifectamine 293試劑,然后通過旋轉或倒置混合,室溫下孵育復合物10～20 min,將復合物緩慢轉移到細胞中,在添加過程中輕輕旋轉培養瓶,然后放入培養箱培養,8% CO2,120 r/min,37 ℃,轉染18～22 h后添加Transfection Enhancer 1和Transfection Enhancer 2,繼續培養5 d。

1.2.3 重組rfc的鑒定與純化

發酵7 d后將細胞培養液以2 000 r/min,4 ℃離心10 min,取上清液分別進行還原條件下和非還原條件下的SDS-PAGE,然后做Western Blot(WB)檢測,重鏈檢測一抗為抗Flag標簽(DYKDDDK)兔單克隆抗體,二抗為HRP標記的羊抗兔抗體,輕鏈檢測為HRP標記的抗6×His標簽多克隆抗體。純化采用鎳離子親和層析柱,先用平衡緩沖液平衡5個柱體積(column volume,CV),樣品過柱后,用含有20 mmol/L咪唑的洗雜緩沖液沖洗3 CV的雜蛋白,然后用含有500 mmol/L咪唑的洗脫緩沖液洗脫目的蛋白。最后用粒徑為30 kDa的超濾管除鹽,用不含咪唑的平衡緩沖液反復稀釋離心,直至咪唑終濃度小于5 mmol/L。

1.2.4 蛋白含量的測定

蛋白濃度采用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行測定,按照說明書步驟配好工作液,加入不同濃度的牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)標準品,37 ℃放置30 min,在A562nm下測定吸光值,繪制標準曲線,根據標準曲線計算出純化后的蛋白濃度。

1.2.5 去除內毒素

按照內毒素去除柱說明書步驟操作,1%(質量分數)的脫氧膽酸鈉溶液清洗5個柱體積后,用無內毒素檢查用水清洗3個柱體積后,將樣品過柱,待流出一個柱體積的液體后,收集蛋白,-20 ℃保存蛋白。

1.2.6 熒光法檢測rfc活性

利用動態熒光法檢測rfc的活性。首先按照細菌內毒素標準品說明書,將內毒素稀釋為1 EU/mL,在96孔板中每孔加入100 μL內毒素(0.5 EU/mL)、50 μL試劑盒中的熒光底物,3個復孔,再分別加入50 μL純化后的rfc、50 μL試劑盒中的C因子(陽性對照),50 μL Expi293F細胞培養上清液(陰性對照)。設置熒光酶標儀孵育溫度37 ℃,激發波長360 nm,發射波長460 nm,分別記錄初始時的熒光值與1 h后的熒光值,并計算相對熒光差值(relative fluorescence units,ΔRFU)。

1.2.7 熒光法檢測rfc結合內毒素

將內毒素標準品配制為0.25、0.5、1、2、4、10 EU/mL,在96孔板中每孔加入內毒素標準品100 μL(每個濃度3個復孔)、50 μL純化后的rfc、50 μL熒光底物,陰性對照孔為100 μL的無熱原水,按照上述程序記錄初始與1 h后的熒光值并計算ΔRFU。

2 結果與分析

2.1 Expi293F細胞表達載體的構建

pcDNA-3.4-rfc質粒經雙酶切鑒定正確后(圖2),轉化至大腸桿菌JM108感受態細胞中,挑取陽性菌落進行菌落PCR驗證以及測序正確后,接種到液體培養基2×YT中,37 ℃過夜培養,按照無內毒素質粒提取試劑盒說明書步驟抽提質粒。

a-pcDNA3.4-rfc質粒雙酶切瓊脂糖凝膠電泳分析; b-pcDNA3.4-rfc載體圖譜圖2 rfc基因的克隆與載體的構建Fig.2 Cloning and vector construction of rfc

2.2 rfc的表達與純化

將抽提的質粒pcDNA-3.4-rfc利用脂質體轉染法轉染至50 mL懸浮細胞Expi293F中,7 d后離心收獲培養上清液,WB檢測蛋白表達情況。WB結果如圖3 所示,培養上清液中的rfc在非還原性條件下,大小為預測全長128 kDa,在還原條件下,rfc因其蛋白結構內含鏈間二硫鍵而斷開,蛋白重鏈帶Flag標簽,WB檢測與預測大小80 kDa一致(圖3-a),蛋白輕鏈帶6×His標簽,WB檢測與預測大小48 kDa一致(圖3-b),故Expi293F成功表達出結構正確、大小一致的可溶性雙鏈C因子。

SDS-PAGE分析重組表達的rfc上清原液,如圖4-a所示,條帶用Image J軟件進行灰度值分析,原液純度約為48%。將離心后的上清溶液利用鎳柱親和層析法純化rfc,SDS-PAGE分析純化后的蛋白。結果顯示如圖4-b,得到1 mL純度大于98%的rfc,純化得率約為56%。利用BCA蛋白濃度測定試劑盒法測得蛋白質量濃度為959 μg/mL,即在每L Expi293F細胞培養液中可得到重組蛋白rfc 19.18 mg。

a-細胞培養上清液的Western Blot檢測(Flag標簽); b-細胞培養上清液的Western Blot檢測(His標簽)圖3 Expi293F細胞中rfc的Western Blot檢測Fig.3 Western Blot detection of rfc expression in Expi293F cells注:M-蛋白標準分子質量Marker;1-非還原性loading buffer處理的 細胞培養上清液;2-還原性loading buffer處理的細胞培養上清液; 3-非還原性loading buffer處理的細胞培養上清液; 4-還原性loading buffer處理的細胞培養上清液。

2.3 rfc結合內毒素及切割熒光底物活性

用表達純化后的rfc替代重組熒光檢測內毒素試劑盒中的C因子,在外加0.5 EU/mL內毒素以及熒光底物后,37 ℃孵育1 h,激發360 nm,發射460 nm檢測初始熒光與結束熒光值,計算相對熒光差值。結果如圖5所示,Expi293F重組表達的rfc被內毒素激活,與熒光底物反應,1 h后的相對熒光差值比Lonza試劑盒中的rfc高了4倍以上。

但與不同濃度內毒素(0.25、0.5、1、2、4、10 EU/mL)反應時,結果卻顯示熒光差值不與內毒素濃度成線性關系(圖6),在不外加內毒素的情況下,仍與熒光底物反應,推測是表達過程和純化過程引入的內毒素使得rfc全部被提前激活,而不存在酶原形式的rfc。將純化后的rfc經過內毒素去除柱后,蛋白經檢測全部掛在柱子上,流穿液中無rfc蛋白(數據未顯示)。因內毒素去除柱的原理是利用介質多聚賴氨酸吸附內毒素,而不直接吸附蛋白,但rfc被吸附在去除柱上則證明內毒素與rfc以特異性親和力連接著,一旦結合,后期極難分開,故后續需在GMP條件或者GLP下進行rfc的表達與純化制備。

a-細胞培養上清液的SDS-PAGE檢測;b-純化后的SDS-PAGE檢測圖4 rfc的表達與純化Fig.4 Expression and purification of rfc注:M-蛋白標準分子質量Marker;1-非還原性loading buffer處理的 細胞培養上清液;2-非還原性loading buffer處理純化后的rfc。

圖5 rfc結合內毒素切割熒光底物Fig.5 rfc combined with endotoxin to cut fluorescent substrate注:*代表差異顯著(P<0.05)(下同)。

圖6 rfc外加不同濃度內毒素的熒光反應Fig.6 Fluorescence reaction of rfc with different concentrations of endotoxin注:ns代表差異不顯著。

3 結論與討論

細菌內毒素能引起人體許多疾病,甚至死亡。開發靈敏度高、特異性強的內毒素檢測試劑盒對制藥行業至關重要。傳統鱟試劑法依賴鱟血淋巴細胞,而因為環境的惡化以及人類的肆意捕食,導致鱟的數量急劇下降[12]。2021年2月5日,中國鱟及圓尾鱟正式被列為國家二級保護動物,所以鱟試劑來源將會受到極大限制。其次鱟試劑法中的G因子會受到(1-3)β-D-葡聚糖激活從而干擾原級聯反應[13],導致假陽性的可能。于是人們開發出重組熒光法,利用分子生物學工具克隆出了C因子,重組表達的rfc以高親和力結合內毒素,激活后的rfc特異性切割熒光底物,根據標準曲線計算內毒素濃度,該方法具有更少的假陽性、靈敏度更高、檢測范圍更廣等特點[14]。但重組C因子法的應用卻進展緩慢,2020年重組 C因子法才被載入歐洲藥典、日本藥典、美國藥典及中國藥典,研究人員自1995年以來,已嘗試在哺乳動物細胞[15]、酵母[16]、昆蟲[17-18]等多種表達系統中表達,一直未獲得具有高表達量和完整功能的rfc。目前只有瑞士制藥公司Lonza以及國內蘇州瑞安公司開發出重組表達rfc體系,但其價格昂貴,因為鱟C因子對痕量內毒素非常敏感,所以在表達過程以及純化過程中內毒素的控制至關重要,此外鱟C因子結合內毒素后自剪切機制尚不清楚[19-20],這也是后續研究需要注意的地方。在此之前本團隊也曾在大腸桿菌BL21(DE3)、畢赤酵母GS115、谷氨酸棒桿菌BZH001中重組表達東方鱟來源的C因子,但遺憾的是,鱟C因子未在大腸桿菌、畢赤酵母、谷氨酸棒桿菌中進行表達,猜測是由于鱟C因子是具有雙鏈結構[21]、多個糖基化位點的大分子蛋白,所以在原核生物以及低等真核生物中無法表達。

本研究首次在人胚胎腎臟細胞Expi293F中成功重組表達rfc,結構與蛋白結構模型一致,具有與內毒素結合并切割熒光底物的生物學活性,比Lonza試劑盒中的rfc具有更高的切割熒光底物的能力。且相比于DING在昆蟲細胞SF9中的表達量(9 mg/L)[16],此表達體系的蛋白表達量(19.81 mg/L)提高了113%。本研究所用細胞為Expi293F,相比于未改造馴化的HEK293來說,表現出更快速的細胞生長、更高的培養存活率以及較高的蛋白表達水平。本研究中的表達純化體系在實驗室階段的成本粗略計算約平均每個檢測成本為6.25元(主要為合成培養基價格非常昂貴,工業規模成本則會更低),遠低于Lonza試劑盒(單個檢測成本41.6元)以及瑞安試劑盒(單個檢測成本10.4元)的成本。由于其本底內毒素含量過高,導致大部分rfc提前激活,而表現為相對熒光差值與外加內毒素含量不成線性關系,在蛋白經過內毒素去除柱后,內毒素與吸附柱上的多黏菌素B結合,而又因為絕大部分的rfc與內毒素緊緊結合,導致大部分蛋白也結合在吸附柱上。所以rfc與LPS結合是不可逆的,一旦結合,后期無法去除,因此在生產的過程中需要完全避開內毒素。此方法對于后續開發低成本rfc重組表達體系以及內毒素檢測試劑盒具有重要指導意義。