溫度對豆瓣醬發酵過程理化指標、風味物質和微生物群落的影響

李曉陽,汪溢恒,鈕成拓,鄭飛云,王金晶,劉春風,李崎*

1(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122)2(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)

豆瓣醬是中國傳統發酵調味品,因其獨特風味深受消費者喜愛[1]。豆瓣醬的生產方式仍大多采用傳統“日曬夜露”發酵工藝,包括霉菌制曲和開放式自然發酵2個步驟,這也是豆瓣醬獨特風味形成的關鍵[2]。然而,這種開放式自然發酵方式依賴當地氣候和生產者經驗,使得產品質量穩定性較差,且在不同季節釀造得到的豆瓣醬品質之間存在巨大差異[3]。冬季氣溫較低,微生物的生長和酶水解進程很慢,導致發酵周期較長且風味相對較差;在夏季較高的溫度下,豆瓣醬發酵過程中微生物的代謝活動較為旺盛,生產周期更短且產品具有更好的品質,但是卻存在易腐敗、生物胺含量偏高等問題[4]。由此可見,控制合適的溫度對豆瓣醬發酵有重要意義。

近年來研究表明,不同季節豆瓣醬的風味和微生物群落組成存在顯著差異[5]。夏季發酵豆瓣醬的揮發性風味物質種類和含量較為豐富,而冬季發酵醬醅的氨基酸態氮含量較高。夏季發酵豆瓣醬中的微生物群落多樣性顯著高于其他季節,且溫度是導致豆瓣醬微生物群落結構與功能季節性差異化分布的關鍵因素之一[6]。對其他發酵食品而言,以溫度為代表的環境因素會塑造其微生物群落結構與功能,進一步影響其產品品質[7]。例如,白酒低溫大曲和中溫大曲的淀粉酶活性高于高溫大曲,且發酵過程中溫度的升高降低了與碳水化合物代謝相關的基因表達[8]。在酸菜發酵過程中,發酵溫度升高能增加揮發性風味化合物的種類,其中明串珠菌和魏斯氏菌以及乳球菌分別在10～15 ℃和20～25 ℃占主導地位[9]。因此,探究溫度對豆瓣醬發酵的影響可進一步明晰豆瓣醬發酵背后的科學機理,可為豆瓣醬現代化發酵過程溫度的選擇提供參考。

本文設置了2組30 ℃和40 ℃恒溫發酵的豆瓣醬樣品,跟蹤測定了其發酵過程中的理化指標、風味物質、生物胺和微生物群落組成,并與自然發酵樣品進行比較,揭示了不同溫度下豆瓣醬發酵過程中品質的變化規律。論文結果為豆瓣醬發酵工藝的改良提供了理論和實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株與材料

米曲霉(Aspergillusoryzae)3.042,保藏于本實驗室;蠶豆瓣、面粉、食鹽,無錫當地超市;NaOH、鹽酸、甲醛、硫酸銅、酒石酸鈉、三氯乙酸等試劑均為分析純,上海國藥集團;NucleoSpin試劑盒,基因生物技術國際貿易(上海)有限公司。

1.2 儀器與設備

電子天平、pH計,METTLER TOLEDO公司;恒溫恒濕培養箱,上海新苗醫療器械制造有限公司;安捷倫1260高效液相色譜質譜聯用儀(headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometer,HS-SPME-GC-MS),美國安捷倫科技有限公司;磁力攪拌器,上海司樂儀器有限公司;Qubit熒光儀,賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 豆瓣醬發酵樣品的設計與制備

將洗凈蠶豆瓣與溫水浸泡6～8 h,于115 ℃高壓處理15 min。冷卻后的蠶豆與小麥粉按3∶1(質量比)混合,接種米曲霉3.042孢子懸液,接種量為1×107CFU/g,在30 ℃、相對濕度90%的培養箱中培養48 h得到成曲。將成曲與鹽水按1∶1混合均勻后,平均分裝到9個透明塑料小桶(3 L)。將小桶按每組3個分成3個小組,分別命名為自然溫度發酵組、30 ℃恒溫發酵組和40 ℃恒溫發酵組(下稱自然發酵組、30 ℃發酵組和40 ℃發酵組)。自然發酵組的發酵條件參照傳統發酵,而30 ℃發酵組和40 ℃發酵組分別在30 ℃和40 ℃培養箱中進行。在發酵前7 d每天進行翻醬,而之后每隔7 d進行翻醬,并收集樣品以備后續分析。

1.3.2 醬醅理化指標的測定

總酸含量參照GB 12456—2021《食品中總酸的測定pH計電位滴定法》。氨基酸態氮含量參照GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態氮的測定 酸度計法》。還原糖含量參照GB 5009.7—2016《食品中還原糖的測定 直接滴定法》。氨基酸含量參照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》。生物胺含量參照GB 5009.208—2016《食品中生物胺的測定 液相色譜法》。

1.3.3 醬醅揮發性風味物質測定

稱取2 g研磨均勻的豆瓣醬樣品與2 g NaCl和8 mL去離子水混合,并轉移到15 mL固相萃取瓶中,同時加入5 μL 2-辛醇溶液作為內標。用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用法(headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometer,HS-SPME-GC-MS)測定發酵第49天后的豆瓣醬樣品的揮發性風味物質。樣品在55 ℃水浴預熱30 min后用SPME纖維吸附揮發物40 min,濃縮的揮發物通過氣相色譜儀在250 ℃解吸3 min。揮發性物質的分離在DB-WAX毛細管柱上進行,具體條件如下[10]:

色譜條件:毛細管色譜柱型號DB-WAX(30 mm×0.25 mm,0.25 μm),色譜柱首先在50 ℃保持2 min,然后升溫至230 ℃保持12 min,升溫速度為5 ℃/min。載氣為氦氣,流速為1.2 mL/min。

質譜條件:電離源EI,發射流200 μA,驅電壓0.5 V,電子能量70 eV,離子能量1.8 eV,離子源溫度260 ℃,接口溫度250 ℃,探測器電壓350 V,掃描范圍25～500 amu。

數據處理:未知化合物在NIST和Willey譜庫中檢索匹配,僅采用匹配度>700的鑒定結果,其相對含量采用面積歸一化法進行定量分析[11]。

1.3.4 醬醅微生物群落的擴增子測序

使用NucleoSpin試劑盒提取豆瓣醬醬醅中微生物群落的總DNA,用Qubit熒光儀對DNA進行定量并在1%瓊脂糖凝膠上運行一個等分試樣檢查質量。采用引物341F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)/806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)和ITS1(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)/ITS2(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)分別擴增細菌16S rRNA基因的V3～V4區域和真菌ITS1區域序列[12]。PCR產物經純化和標記后完成DNA文庫構建,然后應用于Illumina Hiseq 2500平臺進行測序。DNA文庫的測序由武漢華大醫學檢驗所有限公司完成。使用QIIME軟件將有效序列聚類為相似度為97%的操作分類單元(operational taxon unit,OTU)[13]。使用Greengenes細菌數據庫和UNITE真菌數據庫對代表性的OTU序列進行注釋。在QIIME中計算出α多樣性。

1.4 數據分析

數據統計分析和圖形繪制采用Excel軟件和Origin 95軟件。相關性分析通過R語言中Hmisc和Corrplot包提供的函數計算,結果以圖片形式呈現。

2 結果與分析

2.1 溫度對豆瓣醬發酵過程理化指標的影響

氨基酸態氮、還原糖含量和總酸含量被認為是評價豆瓣醬品質的主要指標[14]。如圖1-A所示,自然發酵組和30 ℃發酵組醬醅的氨基酸氮含量在發酵初期逐漸增加,然后分別穩定在約0.95、0.92 g/100 g。40 ℃發酵組的氨基酸態氮含量在發酵第35天達到最高(1.02 g/100 g),然后下降到約0.80 g/100 g。如圖1-B所示,3組醬醅的還原糖含量在發酵過程中均持續上升,最終分別達到11.70、12.10、12.07 g/100 g。如圖1-C所示,3組豆瓣醬樣品中的總酸含量在發酵過程中持續上升40 ℃發酵組醬醅的總酸濃度(3.36 g/100 g)顯著高于30 ℃發酵組(2.46 g/100 g)和自然溫度發酵(2.06 g/100 g)。此外,3組醬醅樣品的pH值持續下降,其中40 ℃發酵組的pH值最低(圖1-D)。氨基酸態氮含量越高標志著豆瓣醬的品質越好,而還原糖在發酵過程中能促進微生物的生長代謝,同時作為美拉德反應底物促進豆瓣醬的色澤和風味化合物形成[15]?？偹釢舛雀叩头磻水a酸微生物在發酵過程中的數量以及是否存在雜菌污染等情況[16]?？偹釢舛冗^高說明微生物群落組成可能失衡,進而導致產品質量不達標[17]。由此可見,相對較高溫度有利于豆瓣醬中氨基酸態氮和還原糖在發酵前中期的積累,但同時會顯著提高醬醅總酸含量。

A-氨基酸態氮;B-還原糖;C-總酸;D-pH值圖1 不同溫度豆瓣醬發酵過程中氨基酸態氮、還原糖、總酸和pH值的變化Fig.1 Changes of amino acid nitrogen, reducing sugar, total acid and pH values during broad bean paste fermentation at different temperatures

2.2 溫度對豆瓣醬發酵過程中風味物質的影響

2.2.1 溫度對醬醅游離氨基酸含量的影響

游離氨基酸是豆瓣醬滋味的重要貢獻物質[18]。根據理化指標檢測結果,在發酵第7、35、49天豆瓣醬的氨基酸態氮含量有顯著變化,因此分析檢測了上述豆瓣醬樣品的游離氨基酸含量。如圖2所示,在發酵過程中自然發酵組和30 ℃發酵組的總游離氨基酸含量均呈現增加趨勢,而40 ℃發酵組的游離氨基酸含量先增加后減少,與氨基酸態氮含量變化趨勢一致。盡管在發酵前期恒溫發酵組的氨基酸總量高于自然發酵組,在發酵結束后自然發酵組的游離氨基酸含量(6.54 g/100 g)高于30 ℃發酵組(5.68 g/100 g)和40 ℃發酵組(4.86 g/100 g)。醬醅氨基酸主要來源于微生物分泌蛋白酶對底物蛋白質的降解,而在發酵過程中其會同時作為氮源和風味前體物質被微生物利用[19]。3種不同發酵溫度會導致發酵過程中微生物群落產酶及代謝特征發生變化,最終導致了醬醅中游離氨基酸含量的差異。

圖2 不同溫度豆瓣醬發酵過程中游離氨基酸的變化Fig.2 Changes of free amino acids during broad bean paste fermentation at different temperatures

2.2.2 溫度對醬醅揮發性風味物質種類及含量的影響

測定了自然發酵組、30 ℃發酵組和40 ℃發酵組所得醬醅的風味物質種類及含量。如圖3-A所示,在40 ℃發酵組醬醅中共檢出57種揮發性風味物質,略多于自然發酵組(55種)和30 ℃發酵組(56種)。其中,恒溫發酵組的酯類和醛類物質多于自然發酵組,而醇類種類更少。如圖3-B所示,40 ℃發酵組醬醅的揮發性風味物質含量為25.65 mg/kg,顯著高于自然發酵組(16.74 mg/kg)和30 ℃發酵組(20.14 mg/kg)。其中,40 ℃發酵組(9.68、7.34、2.60 mg/kg)和30 ℃發酵組(10.47、3.10、1.79 mg/kg)的醇類、醛類和酯類物質含量顯著高于自然發酵組(8.73、0.78、0.69 mg/kg),而其酮類物質(1.03、1.39 mg/kg)含量低于自然發酵組(2.68 mg/kg)。醇類通常呈現出宜人的香氣和甜味,是酯化反應的前體且可進一步氧化成醛類和酸類等[20],而酯類不僅可以賦予產品特殊的酯味,還可以掩蓋游離氨基脂肪酸所引起的不愉悅味道[21]。恒溫發酵過程中,醬醅所處溫度較高,其微生物代謝活動較為旺盛,因此產生了更多的揮發性風味物質[22]。

2.2.3 醬醅風味品評

對自然發酵組、30 ℃發酵組和40 ℃發酵組所得醬醅進行風味品評。如圖3-C所示,40 ℃發酵組有強烈的醬香(7分)和焙烤香(8分),顯著高于自然發酵組(3分、1分)和30 ℃發酵組(4.5分、4分)。30 ℃發酵組的果香和醇香評分(7分和6分)最高,然而其同時具有較高的刺激性氣味。上述結果表明,溫度對豆瓣醬風味形成有顯著影響。恒溫發酵能有效提升豆瓣醬中果香、醇香和醬香,賦予豆瓣醬一定的焙烤香氣,但是同時會提升刺激性氣味的形成。

2.3 溫度對豆瓣醬發酵過程中生物胺含量的影響

生物胺是微生物以氨基酸為前體合成的含氮低分子量有機堿,是一種機體必須的內源性組分。但是,過量生物胺的攝入也會造成食物中毒[23]。因此,考察了溫度對豆瓣醬生物胺含量的影響。如圖4所示,在3組豆瓣醬樣品中共檢測出8種生物胺(腐胺、苯乙胺、組胺、酪胺、精胺、亞精胺、色胺和尸胺),其中腐胺和苯乙胺含量顯著高于其他6種生物胺(P<0.01)。40 ℃發酵組總生物胺濃度在第28天達到最高(76.91 mg/100 g),顯著高于自然發酵組和30 ℃發酵組樣品總胺最高含量(53.09、55.41 mg/100 g)。發酵結束后,40 ℃發酵組樣品的總生物胺濃度為54.10 mg/100 g,依舊高于其他2組(45.22、43.52 mg/100 g)。除尸胺、精胺和亞精胺外,2個恒溫發酵組樣品的生物胺含量均高于自然發酵組。上述結果表明,溫度的提升促進了醬醅中生物胺的形成。

2.4 溫度對豆瓣醬發酵過程中微生物群落結構的影響

通過擴增子測序揭示了不同溫度對豆瓣醬發酵過程中細菌和真菌群落多樣性及其組成的影響。如圖5-A所示,豆瓣醬中細菌群落的豐富度Chao1指數在自然發酵組和40 ℃發酵組中先降后升,在30 ℃發酵組中先升后降。細菌群落的Shannon指數在3個發酵組中均呈下降趨勢。恒溫發酵組的細菌群落豐富度和多樣性均低于自然發酵組,可能是由于恒溫條件無法滿足各種細菌的溫度要求,對細菌生長有較大影響。3個發酵組的真菌群落豐富度和多樣性無明顯差別,且在發酵過程中無明顯變化,表明溫度對豆瓣醬真菌群落多樣性影響較小。

進一步從屬水平分析了3個發酵組中微生物群落結構組成。圖6為3個發酵組中相對豐度>0.5%的細菌和真菌群落組成。在所有樣品細菌群落中,Bacillus屬和Staphylococcus屬均占據優勢地位。除自然發酵組發酵第7天樣品外,其余醬醅樣品中Bacillus屬和Staphylococcus屬占細菌總數的相對豐度均>80%,且隨發酵溫度的升高持續上升。在40 ℃發酵組第49天樣品中上述兩屬的相對豐度綜合高達97.10%。40 ℃發酵組在發酵過程中Bacillus屬的相對豐度從35.88%上升到89.80%,而Staphylococcus屬的相對豐度從51.35%下降到7.30%。30 ℃發酵組中Bacillus屬的相對豐度先升后降,而Staphylococcus屬的相對豐度先降后升。與恒溫發酵組相比,自然發酵組中Staphylococcus屬的相對豐度始終低于Bacillus屬,可能是由于在30 ℃下Bacillus屬比Staphylococcus屬有更好的生長能力。此外,在3個組中均發現了Klebsiella屬和Salmonella屬微生物,但是其相對豐度隨發酵溫度的升高明顯降低。由于Klebsiella屬和Salmonella屬均為食源性致病菌,提高溫度進行發酵能有效抑制上述微生物屬在豆瓣醬中的生長,因此更有利于食品安全。分析了3個組的真菌群落結構,發現所有樣品中主導真菌均為Aspergillus屬,其余真菌屬所占相對豐度極低。

A-細菌Chao1;B-細菌Shannon;C-真菌Chao1;D-真菌Shannon圖5 不同溫度發酵過程中細菌和真菌的豐富度和多樣性變化Fig.5 Changes in the evenness and diversity of bacteria and fungi during fermentation at different temperatures

A-細菌;B-真菌群落圖6 不同溫度發酵過程中細菌和真菌群落的相對豐度變化Fig.6 Changes of the relative abundance of bacterial and fungal communities during fermentation at different temperatures

2.5 豆瓣醬微生物與理化指標和風味物質之間的相關性分析

為揭示豆瓣醬微生物群落對醬醅理化指標和風味物質形成的影響,分析了豆瓣醬主要微生物屬與相應物質間的相關性。如圖7所示,Pantoea屬與所有物質間呈顯著負相關,而Aspergillus屬與總酸、揮發性風味物質和生物胺含量呈負相關。Bacillus屬與總酸、揮發性風味物質和生物胺含量呈正相關,而Staphylococcus屬與氨基酸態氮、還原糖、總酸、游離氨基酸和生物胺含量均呈正相關。Bacillus屬在豆瓣醬發酵過程中促進游離氨基酸和揮發性風味物質的形成,也是生物胺累積的主要微生物[24],而Staphylococcus屬能促進氨基酸和酸性物質的產生[25]。溫度升高使得豆瓣醬中Bacillus屬和Staphylococcus屬的相對豐度大幅提高,使得恒溫發酵組中總酸、生物胺和揮發性風味物質的含量高于自然發酵組。

圖7 豆瓣醬中重要微生物屬與理化指標和風味 物質之間的相關性分析Fig.7 Correlation analysis between key microbial genera and physicochemical parameters and flavor compounds in broad bean paste

3 結論

和自然發酵組相比,30 ℃發酵組和40 ℃發酵組有利于發酵前中期的氨基酸態氮和還原糖的積累,同時會促進酸性物質的形成。此外,更高的發酵溫度會產生更高濃度的游離氨基酸和揮發性風味物質,但同時會積累更多生物胺。溫度的升高對細菌群落結構影響較大,而對真菌群落結構的影響較小。上述結果說明提高發酵溫度可以加快豆瓣醬發酵進程,但是同樣也導致部分不利結果,因此后續需進一步考察溫度的變化對豆瓣醬發酵的影響。