磷脂添加量對口腔釋放型益生菌香口丸化口性及菌活穩定性的影響

張奎,祝菁瑤,蔡繼寶,馬曉娟,劉偉,鄒立強,謝有發,*

1(南昌大學 食品學院,食品科學與技術國家重點實驗室,江西 南昌,330047) 2(江西中煙工業有限責任公司,江西 南昌,330000)3(江中藥業股份有限公司,江西 南昌,330041)

大量研究顯示,作為攝入后對宿主具有有益生理效應的活性微生物[1],益生菌主要通過調節腸道菌群,調節脂肪貯存、調節免疫系統、降低血清膽固醇以及延緩腸道衰老的方式發揮其健康益處[2]。國際乳業聯合會建議,為保障其健康效益,益生菌產品中活菌的數量應≥106CFU/g[3]。因此,如何克服食品生產和貯存過程中高溫、低pH以及氧氣等多種不利因素對益生菌活性的破壞[4-5],是當前益生菌領域研究的熱點問題。近年來,科研工作者嘗試采用無縫滴丸技術,制備以明膠為外殼的負載益生菌無縫膠囊[6-7],避免菌粉直接暴露于氧氣與潮濕環境,使益生菌盡可能保持在休眠狀態中,能一定程度提高產品菌活,延長貯藏時間[8]。無縫膠囊滴制、干燥的過程中,由于菌粉的親水性,芯材中的益生菌會與膠皮中的水分結合而活化,使益生菌在加工和貯藏中的活菌數顯著降低。

磷脂包埋是實現益生菌保護的有效手段[9]。磷脂分子能夠在自身兩親性作用下,形成親水頭部朝向水相,疏水尾部相互靠近的膜層結構[10],為益生菌提供疏水環境,能夠有效避免益生菌失活。有研究將嗜酸乳桿菌和乳酸雙歧桿菌包埋于半固體大豆卵磷脂油凝膠乳劑中,發現可以提高其存活率并延遲氧化反應[11]。無縫膠囊的芯液相主要成分為脂質,膠皮相中含有超過80%的水分,采用磷脂在膠皮與芯液之間構筑一層保護膜,有望進一步提高對益生菌活性的保護。此外,本研究前期采用高精同心滴丸技術,成功制備了以椰子油、代可可脂等固態脂質作為芯液基質,實現益生菌與薄荷香精共負載的口腔環境改善型香口丸,但同時也面臨固態脂質在口腔的中停留時間長,油膩味重,香口丸口感不佳等缺點。磷脂是具有良好乳化、分散和滲透性能的天然表面活性劑[12],能夠加速芯液相中的脂質乳化從而獲得更佳的化口感,解決香口丸口感油膩的缺陷。

本研究選用明膠作為壁材相,椰子油作為芯材相,添加不同比例的磷脂作為脂質保護層來制備益生菌香口丸。分析不同磷脂添加量對香口丸外觀、直徑、質構特性等理化性質的影響;通過對比不同磷脂添加量的樣品在加工和貯藏過程中益生菌菌活差異,探究磷脂的加入對益生菌穩定性的影響;通過口腔消化實驗,比較磷脂比例對香口丸化口性和菌活穩定性的提升能力,為制備兼具加工貯藏穩定性和優良風味口感的新型益生菌食品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌P9,江中藥業股份有限公司;椰子油,廣州中宏生物科技有限公司;甘油,南京科之昕生物科技有限公司;磷脂,愛康精細化工有限公司;明膠,江西福美泰生物技術有限公司;MRS瓊脂培養基,北京索萊寶科技有限公司;黏膜蛋白,美國Sigma試劑公司;氯化鈉、氯化鉀、碳酸氫鈉等均為分析級,購自阿拉丁。

1.2 儀器與設備

高精度同心滴丸機,煙臺百藥泰中藥科技有限公司;分散機T18 digita,德國IKA公司;厭氧培養箱YQX-T,美國SHELLAB公司;立式壓力蒸汽滅菌鍋ZDX-35BI,上海申安醫療器械廠;渦旋振蕩器Q-861,美國;數顯恒溫磁力攪拌水浴鍋HH-4,金壇市城西曉陽電子儀器廠;臺式pH計827pH,瑞士Metrohm公司。

1.3 益生菌香口丸的制備

1.3.1 膠皮相、芯液相的制備

將一定比例的明膠、甘油溶于去離子水中,于70 ℃水浴鍋中加熱攪拌2 h至完全溶解,使用超聲除泡機除去其中的氣泡,制成膠液待用。

將磷脂按照不同質量分數(0%、0.5%、1%、1.5%)分散于椰子油中,于40 ℃水浴下加熱攪拌至完全溶解,冷卻至37 ℃左右后加入1% (質量分數)的植物乳桿菌菌粉,經分散機5 000 r/min分散2 min,制備成均勻的液態菌油相保溫備用。

1.3.2 益生菌香口丸的制備

將膠皮相置于高精同心滴丸設備的儲料罐中靜置,融化后保溫的芯液菌油分批次置于保溫物料罐中攪拌保溫,調節設備參數:膠液罐溫度70～75 ℃,物料罐溫度38～40 ℃,滴頭溫度為55～60 ℃,制冷溫度為5～7 ℃,物料經過滴頭流出后由脈沖裝置快速切割成圓形無縫滴丸,再通過5～7 ℃冷卻循環系統對其進行進一步的冷卻定型,得到濕丸,將濕丸置于20～25 ℃、相對濕度30%～40%的恒溫恒濕環境中干燥5～6 h,最終得到4種磷脂質量分數分別為0%(L0)、0.5%(L1)、1%(L2)、1.5%(L3)的植物乳桿菌香口丸樣品。

1.4 理化性質表征

1.4.1 外觀

拍照記錄干燥前后的益生菌香口丸的外觀形態變化。

1.4.2 直徑

使用游標卡尺測量隨機挑選的50個益生菌香口丸樣品的平均直徑。

1.4.3 質構特性

使用質構分析儀和P/2圓柱探頭(直徑2.0 mm)從4種益生菌香口丸的樣品中隨機選取50顆珠子作為樣本,對每顆珠子測試其硬度和彈性。測試前速度為1.5 mm/s,測試中速度1 mm/s,測試后速度為10.0 mm/s,應變量為40%,觸發力為2.0 g。

1.5 加工穩定性

益生菌在香口丸滴制的過程中,受環境和設備高溫以及膠皮中的水分等不良因素的影響其活性會降低。為了探究磷脂在加工過程中對于益生菌活性的保護作用,以未經過滴頭的添加有植物乳桿菌的初始油相作為對照組,分別從4種磷脂質量分數分別為0%、0.5%、1%、1.5%的樣品益生菌香口丸中取其芯液油相,使用含5%吐溫-80的生理鹽水對其進行梯度稀釋,接種于MRS瓊脂培養基,在37 ℃厭氧培養箱中培養48 h后計算菌落總數。

1.6 貯藏穩定性

分別將4種磷脂質量分數為0%(L0)、0.5%(L1)、1%(L2)、1.5%(L3)的樣品益生菌香口丸使用鋁箔紙袋密封并放入干燥劑,脫氧劑,置于4 ℃冰箱和模擬室溫條件(25 ℃)下貯存12個月,每隔3個月對4種樣品分別取樣培養,計算樣品在貯藏過程中的菌活變化。

1.7 口腔消化特性

1.7.1 模擬口腔消化液(SSF)的配制

分別將氯化鈉(1.594 g/L)、硝酸銨(0.328 g/L)、氯化鉀(0.202 g/L)、檸檬酸鉀(0.308 g/L)、磷酸二氫鉀(0.636 g/L)、尿酸二氫鈉(0.021 g/L)、尿素(0.198 g/L)、乳酸鈉(0.146 g/L)、黏膜蛋白(3 g/L)分別按照添加量要求加入去離子水中,攪拌至完全溶解[13]。

1.7.2 固態脂質層在口腔環境融化情況

將4種磷脂添加量分別為0%(L0)、0.5%(L1)、1%(L2)、1.5%(L3)的益生菌香口丸在進行滴制前單獨稱取0.5 g芯液相固態脂質,將其分別置于消化瓶中加入20 g口腔消化液中混合并調節pH值至6.8,放入振蕩水浴鍋中37 ℃條件下100 r/min振蕩,分別在0、15 s和完全融化時拍照記錄,并記錄固態脂質完全融化于口腔消化液中的時長。

1.7.3 模擬口腔消化

分別將4種磷脂質量分數為0%(L0)、0.5%(L1)、1%(L2)、1.5%(L3)的樣品益生菌香口丸各取3 g置于消化瓶中,加入20 ml口腔消化液中混合并調節pH值至6.8,放入振蕩水浴鍋中37 ℃條件下100 r/min消化,至樣品完全融化于口腔消化液中。

1.7.4 益生菌香口丸在口腔環境的穩定性

從4種益生菌香口丸消化后對應的消化液中取樣,進行梯度稀釋后,使用MRS瓊脂培養基在37 ℃恒溫培養箱中培養48 h后計算菌落總數,根據計算公式計算樣品菌活保留率如公式(1)所示:

(1)

1.8 數據統計與分析

每個實驗重復3次,各組數據用SPSS 26軟件進行分析,以P<0.05作為差異作為著性判斷標準,結果以“平均值±標準差”表示,圖表用Origin 2021繪制。

2 結果與分析

2.1 益生菌香口丸的理化性質表征

4種香口丸脂質芯材外觀如圖1-a所示,隨磷脂添加含量的增加,香口丸固態脂質層顏色由白色轉變為橙黃色。使用L3芯液滴制的益生菌香口丸樣品濕丸和干燥后干丸外觀分別如圖1-b和圖1-c所示,濕丸為外層膠皮包裹內層固態脂質的球狀結構,丸體大小均一,顏色均勻干燥后膠皮相透明度提高,丸體結構完整,表面無凹坑。

a-固態紙質層;b-濕丸;c-干丸圖1 不同磷脂添加量的脂質芯材及L3的濕丸和 干丸圖像Fig.1 Images of lipid core material with different phospholipid content, L3 wet pills and dry pills

實驗測量并記錄了每組樣品隨機選取的50個香口丸樣本的直徑以及硬度、彈性,結果如表1所示,4種益生菌香口丸樣品的平均直徑均為6.0 mm,硬度和彈性分別為458.1～488.6 g和42.1%～43.8%,且均無顯著性差異(P<0.05)。表明不同含量的磷脂添加,均未對香口丸的尺寸和質構特性產生明顯影響,這可能與磷脂在整個體系中所占比例較低有關。

表1 不同磷脂添加量的益生菌香口丸的直徑與質構特性Table 1 The diameter and texture characteristics of probiotic mouth incense pills with different phospholipid content

2.2 益生菌在加工過程中的穩定性

在加工過程中,芯材經滴頭被膠液包裹,再被剪切冷卻分割成獨立的濕丸,然后在濕度35%環境,溫度23 ℃條件下干燥得到成品香口丸。在此過程中,由于益生菌的親水性,益生菌可能會與膠皮相中的水分結合,并在長時間的干燥過程中導致益生菌失活。而磷脂是具有兩親性極性脂質,能夠將益生菌與膠皮相中的水分間隔,一定程度上可以阻止益生菌與膠皮相中的水分直接接觸,減少干燥過程中除水對益生菌細胞結構完整性的影響,對益生菌在加工過程中的穩定性起到保護作用[5]。

加工過程中的菌活變化如圖2所示,加工之前的各組菌活均為9.34 lg CFU/g左右。經加工(滴制與干燥)后,未添加磷脂組香口丸(L0)平均活菌數降低至8.84 lg CFU/g,菌活損失率超50%。加入磷脂后,香口丸菌活均有不同程度提高,0.5%(質量分數)磷脂組(L1)菌活為9.19 lg CFU/g,1%(質量分數)磷脂組(L2)為9.26 lg CFU/g,1.5%(質量分數)磷脂組(L3)為9.29 lg CFU/g保留率均在60%以上。說明磷脂形成的隔離層有效阻止了膠皮水分與益生菌接觸,對香口丸的益生菌加工穩定性具有積極意義。此外,隨著磷脂含量的提高,菌活保留率呈先增大后平緩的趨勢,說明一定量的磷脂添加對所形成的隔離層致密性與水分隔絕能力具有提升作用,進一步增加磷脂含量,隔離性能則不再變化[14]。

2.3 益生菌香口丸的儲藏穩定性

將4種益生菌香口丸樣品分別置于4 ℃和常溫(25 ℃)下貯藏12個月,每隔3個月測定香口丸的活菌數,其結果如圖3、圖4所示。

圖2 不同磷脂添加量的益生菌香口丸在加工后 平均活菌數量和菌活保留率Fig.2 The average number and the retention rate of viable bacteria in probiotic mouth incense pills with different phospholipids added after processing注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),下同。

在4 ℃貯藏12個月后,當磷脂的質量分數分別為0.5%、1%、1.5%時,平均活菌數分別為9.04 lg CFU/g、9.07 lg CFU/g和9.07 lg CFU/g,未添加磷脂的樣品為8.70 lg CFU/g, 在4 ℃環境貯藏時由于溫度較低抑制了益生菌基礎代謝和活化速度[15],從而抑制了益生菌儲藏活性的降低,提高了益生菌香口丸的貯藏穩定性,與前人的研究結果一致[16]。

在25 ℃貯藏12個月后,磷脂質量分數分別為0.5%、1%、1.5%的平均活菌數和菌活保留率分別為8.54 lg CFU/g和20.4%、8.67 lg CFU/g和23.4%、8.67 lg CFU/g和23.1%,而不添加磷脂的香口丸樣品其活菌數與保留率為8.12 lg CFU/g和16.9%。因此磷脂的添加有利于提高益生菌在25 ℃時的貯藏穩定性。除此之外,磷脂添加量由0.5%提高至1%,益生菌的保留率有明顯提高,而磷脂添加量為1%和1.5%的樣品菌活保留率差別不大,這可能是由于1%的磷脂已經足夠阻隔菌與膠皮接觸,此時再增加磷脂的含量作用較小。

在2種貯藏溫度下,均可看出磷脂對于益生菌香口丸的貯藏穩定性的保護作用,磷脂的加入可以減緩益生菌活性的降低。之前的研究發現,磷脂培養的益生菌其細胞表面的疏水性會增強[17],磷脂的添加能夠有效降低貯藏時“水分”等環境不良因素對益生菌活性的影響,提高益生菌香口丸的貯藏穩定性[18]。

a-活菌數;b-菌活保留率圖3 不同磷脂添加量的益生菌香口丸在25 ℃貯藏 過程中的活菌數量變化和12個月后的活菌保留率Fig.3 Changes in the number of viable bacteria during storage at 25 ℃ and the retention rate of viable bacteria after 12 months of probiotic mouth incense pills with different phospholipid addition levels

a-活菌數;b-活菌保留率圖4 不同磷脂添加量的益生菌香口丸在4 ℃貯藏過程中的 活菌數量變化和12個月后的活菌保留率Fig.4 Changes in the number of viable bacteria during storage at 4 ℃ and the retention rate of viable bacteria after 12 months of probiotic mouth incense pills with different phospholipid addition levels

2.4 口腔消化特性

為模擬香口丸外層膠皮咬破后,內部芯材在口腔中的化口過程。將對應的含有不同磷脂含量的固態脂質置于口腔消化液中模擬益生菌香口丸在口腔環境的融化情況。如圖5所示,添加磷脂的樣品固態脂質芯液融于口腔消化液時,完全融化的溶液呈現乳白色,而未添加磷脂的樣品溶液表面存在明顯油滴漂浮,說明磷脂的乳化性能夠有效減輕固態脂質在口腔中的黏膩口感。圖6記錄了脂質完全融化所需時間,隨著磷脂含量的增加,固態脂質層在口腔環境的融化速度越快,完全融化所需的時間越短,磷脂質量分數為1.5%的樣品融化速度最快(<35 s)。推測可能是高含量磷脂的脂質在融化后快速乳化擴散離開,避免了融化油滴對固體脂質融化的阻滯過程,有效提高了脂質的融化速率。更快的融化速率還有利于香精和清涼因子快速擴散,起到更好的香口提神效用。

圖5 不同磷脂添加量的益生菌香口丸芯材在口腔 消化液中的融化情況Fig.5 The melting of probiotic mouth incense pills core material with different phospholipid content in oral digestive fluid

圖6 不同磷脂添加量的益生菌香口丸芯材在模擬 口腔消化時完全融化時間Fig.6 The complete melting time of the core materials of probiotic mouth incense pills with different phospholipid addition amounts during simulated oral digestion

圖7 不同磷脂添加量的益生菌香口丸芯材模擬 口腔消化后的活菌保留率Fig.7 Bacterial retention rate of probiotic mouth incense pills core material with different phospholipids added in simulated oral digestion

3 結論

本研究實驗結果顯示,磷脂的添加對益生菌香口丸的外觀、直徑、硬度和彈性幾乎未造成影響,有效提高了益生菌在益生菌香口丸加工過程和貯藏階段的活性和穩定性,同時,磷脂含量越高對益生菌活性的保護效果越明顯。除此之外,添加磷脂可以提高固態脂質層在口腔中的融化速度,這可能使益生菌香口丸中的功效因子(益生菌、香味物質及清涼因子等)在口腔中的釋放速度加快,且添加磷脂對益生菌在口腔中的菌活保留不會造成不利影響。綜上,向益生菌香口丸的芯材中添加磷脂能為改善市面上的益生菌類產品的口感和提高益生菌穩定性的問題提供新的思路。