美極梅奇酵母與釀酒酵母混合發酵對藍莓酒品質的影響

湯楚琦,顧秋亞,周劍麗,黎帥近一,李炫辰,丁合霞,楊國華,余曉斌*

1(江南大學,工業生物技術教育部重點實驗室,江蘇 無錫,214122) 2(貴州大學 釀酒與食品工程學院,貴州 貴陽,550025)3(貴州省輕工業科學研究所,貴州 貴陽,550007)

藍莓富含花青素、多酚等生物活性成分,具有抗氧化、抗癌等健康益處[1-2],可增強免疫系統,并能夠預防心血管疾病等。由于藍莓鮮果不易貯存,經常被加工成果汁及藍莓酒[3]。藍莓酒生產中的酒精發酵通常是由釀酒酵母進行的,然而由于對具有特定特征的藍莓酒的需求不斷增加,對其他酵母菌和非釀酒酵母的研究越來越多[4]。藍莓酒的顏色會受到酵母在發酵過程中產生的乙烯基酚類代謝物的影響,并可能與單體花青素反應,形成高度穩定的吡喃花青素,乙烯基酚吡喃花青素化合物也表現出極大的顏色穩定性[5-6]。

美極梅奇酵母(Metschnikowiapulcherrima)是一種具有優良釀造特性的非釀酒酵母,具有較強的產酯酶及產β-葡萄糖苷酶等的能力[7],有助于風味物質的釋放,豐富果酒香氣。已有研究表明,與釀酒酵母混合發酵時,還能降低發酵果酒中的乙醇含量[8],影響揮發酸的產生量[9],從而用于低度酒的發酵生產。同時美極梅奇酵母在酒精發酵前期,還表現出天然的抗菌作用,能夠控制腐敗微生物的生長,提高果酒品質。非釀酒酵母在釀酒過程中能起到積極的作用,并提升果酒花香和果香等感官特性,然而,大多非釀酒酵母無法單獨完成酒精發酵,需要釀酒酵母的協同作用[10-11],因此,通過研究美極梅奇酵母與釀酒酵母協同發酵對藍莓酒的影響,有助于提升藍莓酒的風味品質。

本研究以藍莓汁為原料,選用一株商業釀酒酵母K1與一株美極梅奇酵母進行了小型藍莓酒發酵試驗,分別在不同的發酵條件下,探究美極梅奇酵母的參與對藍莓酒色澤、生物活性成分、抗氧化能力及揮發性成分等的影響。本研究對美極梅奇酵母的菌種選擇提供新思路,為混菌發酵在藍莓酒生產中的應用提供參考,有助于獲得高品質藍莓酒。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

藍莓濃縮汁,貴州茅臺(集團)生態農業產業發展有限公司;美極梅奇酵母,篩選于藍莓果皮表面,現保藏于實驗室菌種保藏庫;釀酒酵母K1,法國拉曼集團;酵母粉,蛋白胨,無水葡萄糖,瓊脂,無水乙醇,甲酸,甲醇(HPLC),國藥集團化學試劑有限公司;YPD培養基(g/L):葡萄糖20,蛋白胨20,酵母浸粉10,115 ℃高壓蒸汽滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

超高速冷凍離心機、Trace1310-ISQ L氣相色譜-質譜聯用儀,賽默飛世爾科技有限公司;SPX-250B-Z恒溫培養箱,上海躍進醫療器械廠;UltraScan Pro 1166 高精度分光測色儀,美國Hunterlab公司;ΜV-1600 紫外可見光分光光度計,上海精密科學儀器有限公司;

1.3 實驗方法

1.3.1 發酵實驗

藍莓濃縮汁以1∶4的體積比加水稀釋,分裝于三角瓶中,65 ℃滅菌15 min。將美極梅奇酵母Mp、釀酒酵母K1分別接種于YPD液體培養基中,30 ℃活化培養24 h,再重復活化1次,培養至指數期。將活化好的菌株6 000 r/min離心5 min后收集菌體,經0.9%的生理鹽水洗滌2次后接入三角瓶中。美極梅奇酵母的接種量為107CFU/mL,釀酒酵母的接種量為106CFU/mL,接種方式分別為順序接種與同時接種,順序接種即先接種非釀酒酵母,48 h后再接種釀酒酵母。稀釋后的藍莓果汁為空白對照組(用CK表示)。以美極梅奇酵母和釀酒酵母單獨發酵為對照 (其中Sq-Mix表示美極梅奇酵母與釀酒酵母順序混合發酵,Mix表示美極梅奇酵母與釀酒酵母同時混合發酵,Sc、Mp分別表示釀酒酵母、美極梅奇酵母單獨發酵),于20 ℃條件下靜置發酵,通過每天測定CO2質量損失監測發酵進程,若連續2 d的質量變化<0.2 g,則認為發酵結束。發酵結束后將酒樣10 000 r/min離心10 min,上清液用于后續分析,每個試驗重復3次?？偺呛途凭雀鶕礼B/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測定。

1.3.2 色差分析

使用高精度分光測色儀對藍莓果汁及果酒的各顏色指標進行測定,設置透射模式,讀數以色度值L*、a*值和b*值表示,L*代表亮度,越大代表樣品越亮;a*值代表綠紅顏色的飽和度,負值越小表示越綠,正值越大表示越紅;b*值代表藍黃顏色的飽和度,負值越小表示越藍,正值越大表示越黃。根據公式(1)計算樣品的總色差值ΔE,ΔE數值越大,說明色差越大。

(1)

1.3.3 總花青素及總酚的測定

總花青素的測定參考王行等[12],采用pH示差法?？偡拥臏y定使用福林酚顯色法[13]。在96孔板中依次吸取50 μL稀釋到適當濃度的待測液,100 μL Folin-Ciocalteu試劑(稀釋10倍),隨后在30 s至8 min內加入100 μL 87.56 g/L Na2CO3溶液,混合均勻后放置1 h,于750 nm下測定吸光值。以1 mL藍莓酒樣中所含沒食子酸毫克數來表示所含總酚的量。標準曲線如圖1所示。

圖1 沒食子酸標準曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

1.3.4 體外抗氧化能力測定

1.3.4.1 ABTS陽離子自由基清除率的測定

將88.0 μL K2S2O8(140 mmol/L)溶液和5.0 mL ABTS溶液(7 mmol/L)混合后反應24 h,生成ABTS陽離子自由基,并用無水乙醇稀釋至其在734 nm處的吸光值為0.70±0.02。取0.5 mL樣品于離心管中,加入4.5 mL ABTS陽離子自由基稀釋液,搖勻后在30 ℃下水浴反應6 min,避光,在734 nm處測定吸光度。藍莓果酒樣品的測定值為A1。將無水乙醇代替樣品測定值為A0。

根據公式(2)計算ABTS陽離子自由基清除率:

(2)

1.3.4.2 DPPH自由基清除率的測定

取2 mL待測的藍莓酒樣品,加入2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液,搖勻后靜置20 min。使用無水乙醇調零后,在517 nm處測定吸光度。樣品組A1,對照組A2為樣品與無水乙醇1∶1(體積比)混合液的吸光度,空白組A0為DPPH溶液與無水乙醇混合液的吸光度。

根據公式(3)計算DPPH自由基清除率:

(3)

1.3.4.3 羥自由基清除能力的測定

參照王燕新等[14]的方法,按順序分別加入2 mL的硫酸亞鐵(6 mmol/L)、水楊酸(6 mmol/L)、藍莓酒待測樣品及,再加入過氧化氫溶液(6 mmol/L),在37 ℃下水浴反應1 h,在510 nm處測定其吸光度為A1, 用純水代替樣品且不加過氧化氫溶液,測得底物的吸光度為A2;測定純水的吸光值為空白對照A0。

根據公式(4)計算羥自由基清除率:

(4)

1.3.5 揮發性成分的測定

參照嚴紅光等[15]的方法,采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術對藍莓酒香氣成分進行檢測。樣品處理:分別取藍莓果汁及發酵后的樣品8 mL 置于15 mL頂空瓶中,加入5 μL的2-辛醇內標溶液,使終質量濃度為100 mg/L。揮發性化合物的半定量以各組分相對于內標物2-辛醇的含量計算。GC條件:毛細管柱為DB-WAX UI (30 m×0.25 mm,0.25 μm),載氣為氦氣,流速為1.2 mL/min。溫度由50 ℃在2 min后以3 ℃/min升至145 ℃,在230 ℃保持10 min。MS條件:EI源,離子源溫度為260 ℃,MS傳輸線溫度為230 ℃,掃描質量范圍為33m/z至450m/z。電壓70 eV。

1.4 數據處理

在本實驗中,所有指標測定均重復3次。柱狀圖、折線圖及聚類熱圖使用Origin 2021分析繪制。

2 結果與分析

2.1 發酵能力研究

由圖2可知,美極梅奇酵母單獨發酵組(Mp)發酵速度較慢,且在第10天停止發酵,耗糖量僅49.30 g,釋放了5.20 g CO2,說明其發酵能力較弱,不能單獨完成酒精發酵。釀酒酵母單獨發酵組(Sc)的起酵速度最快,在第9天完成發酵,共釋放16.54 g CO2。與Mix組相比,Sq-Mix組的發酵速度減慢,延長了2 d的發酵時間,并減少了2.1 g的CO2釋放量,同時降低了0.3%(體積分數)的乙醇含量。已有研究表明[16-17],順序發酵試驗顯示出較低的發酵動力學,這是由于美極梅奇酵母具有較低的糖醇轉化率導致的,Sq-Mix組中美極梅奇酵母的存在使CO2釋放速度較Mix慢少并消耗了部分糖,而釀酒酵母的延遲接種會促進乙醇的進一步減少。發酵結束后,與Sc組相比,Mp組、Mix組及Sq-Mix組的乙醇含量分別降低了5.17%、0.5%、0.8%(均為體積分數),該結果表明,在混合接種方式下能夠降低藍莓酒中的乙醇含量,證實了美極梅奇酵母在降低乙醇含量方面的作用。

a-發酵動力學曲線;b-總糖含量的變化;c-酒精含量圖2 不同發酵組的發酵能力表征Fig.2 Characterization of fermentation capacity of different fermentation groups

2.2 顏色參數分析

不同發酵組的藍莓酒顏色的結果如表1所示。Mp組、Sq-Mix組和Mix的色差值與Sc組相比,分別增加了51.09%、18.78%和10.48%,表明添加美極梅奇酵母發酵能夠對藍莓酒的顏色產生積極作用。其中,Mp組的L*值和a*值相比于Sc組分別增加了0.32和2.07,且數值最大,表示Mp組在4個酒樣中最亮、顏色最紅。一方面,在釀酒過程中,美極梅奇酵母的代謝產物(乙烯基苯酚、丙酮酸、羥基肉桂酸和乙醛)能與花青素相互結合成穩定的色素,從而抵抗色素物質的降解,阻止果酒褐變[18-19]。另一方面,非釀酒酵母在發酵期間能產生較高的乳酸,導致酒樣pH值降低[20],增加果酒的紅色色調[21]。有研究發現,與釀酒酵母相比,非釀酒酵母參與的混合發酵通?？墒构频念伾珡姸仍黾覽22],這與本試驗結果一致。

表1 不同發酵方式藍莓酒色度Table 1 Chroma of blueberry wine with different fermentation systems

2.3 生物活性成分分析

果酒的顏色取決于其含有的花青素及其衍生產物含量和它們在果酒中的穩定性,4種不同的發酵方式在總酚和總花青素成分間的差異如圖3所示。Sc組的總花青素含量及總酚含量分別為(297.80±8.92) mg/L和(4 552.34±30.13) mg/L。而使用美極梅奇酵母單獨發酵的Mp組較Sc組的總花青素含量降低了21.64%,總酚含量升高了2.21%。Mp組中總花青素的含量顯著低于Sc組,僅為(233.34±7.57) mg/L,總花青素的損失可能是由于該株美極梅奇酵母的細胞壁能夠吸附藍莓中的單體花青素,并隨著發酵結束后的離心過程而沉降,從而降低了藍莓酒中的總花青素。而在發酵過程中,非釀酒酵母較釀酒酵母能產生更多的β-葡萄糖苷酶,該酶能促進酚類化合物的釋放[19,23],提高總酚含量。

圖3 不同發酵方式藍莓酒的生物活性成分Fig.3 Phytochemical composition in blueberry wine with different fermentation methods

2.4 抗氧化能力分析

由圖4可知,藍莓果汁及藍莓酒都表現出較強的抗氧化能力,有研究表明,花青素、總酚等含量與自由基的清除能力有關[24]。由圖4-a中可以看出,Sc組對ABTS陽離子自由基的清除能力最高,較藍莓果汁提高了10.64%,而相比于Mp組無顯著差異。同時,混合發酵組Sp-Mix組及Mix組對ABTS陽離子自由基的清除能力相比于單獨發酵組,降低了約4.80%。

DPPH被廣泛應用于測定自由基的清除能力。如圖4-b所示,Sp-Mix組對DPPH的自由基清除率最低,為50.27%,與Mix組相比,降低了14.22%,表明同時接種混合發酵對藍莓酒的DPPH自由基清除能力影響較大。而Sc組對DPPH自由基的清除能力最高,為60.72%。從對羥自由基清除能力來說,如圖4-c所示,Mix組最好,為56.72%,但與Sq-Mix組合Sc組無顯著差異。

綜上所述,利用該株美極梅奇酵母單獨發酵藍莓酒時,在ABTS陽離子自由基、DPPH自由基及羥自由基清除能力方面均不如釀酒酵母K1單獨發酵,而利用混合發酵方式能夠提高DPPH及羥自由基清除能力。

2.5 香氣成分分析

揮發性香氣成分與藍莓酒的品質密切相關。通過不同發酵方式發酵后的藍莓酒香氣成分如表2所示。共檢測出45種香氣物質,分別為22種酯類物質、19種除乙醇外的醇類物質、2種酸類物質、1種醛類物質和1種酮類物質。酯類物質能夠為藍莓酒貢獻果香香氣。經美極梅奇酵母單獨發酵的Mp組中,總酯的相對含量最高,達362.95 mg/L,與Sc組相比,提高了134.63%,并能夠顯著提高異戊酸乙酯、乙酸乙酯和乙酸異戊酯的含量,分別為藍莓酒增添水果香和香蕉香味等。同時,Mix組相比于Sc組,產生了較高含量十六烷酸乙酯,達28.50 mg/L,能夠為藍莓酒帶來果香及奶油香氣,豐富藍莓酒的香氣成分。Mix組與Sc組中的苯乙醇含量較高,分別為51.81 mg/L和53.02 mg/L,分別占其總醇含量的16.54%和24.09%,可為藍莓酒增添蜂蜜、玫瑰等香氣。因此,美極梅奇酵母的參與能夠顯著改變藍莓酒的香氣成分組成,增加藍莓酒香氣的豐富性及愉悅性。

a-ABTS陽離子自由基清除率;b-DPPH自由基清除率;c-羥自由基清除率圖4 不同發酵方式藍莓酒的抗氧化能力Fig.4 Antioxidant capacity in blueberry wine with different fermentation methods

如圖5所示,為研究不同發酵方式下藍莓酒中主要香氣成分間的差異,利用Origin軟件對5個樣品中的香氣成分進行熱圖聚類分析。由美極梅奇酵母單獨發酵后主要產生了異戊醇、異戊酸乙酯、乙酸乙酯等物質,這些香氣成分主要表現為花香與果香,使藍莓酒香氣更加豐富。而利用商業釀酒酵母單獨發酵及混合發酵能夠顯著增加苯乙醇的含量,能夠為藍莓酒帶來丁香花、蜂蜜及玫瑰香氣。在同時接種發酵方式下,辛酸乙酯的含量相比于其他組最高,為藍莓酒增添濃郁的果香。綜上,美極梅奇酵母的參與能夠改變藍莓酒的香氣成分組成,且在混合發酵時也能夠增加更多的果香香氣。

表2 不同發酵組藍莓酒香氣成分Table 2 Aroma components of blueberry wine from different fermentation groups

圖5 不同發酵組藍莓酒香氣成分聚類分析熱圖Fig.5 Clustering analysis heat map of aroma components of blueberry wine in different fermentation group

3 結論

本實驗通過比較美極梅奇酵母及商業釀酒酵母以不同接種方式發酵對藍莓酒的顏色參數、香氣成分、抗氧化活性等的影響,發現美極梅奇酵母單獨發酵、順序接種混合發酵及同時接種混合發酵與釀酒酵母單獨發酵相比,使藍莓酒中的乙醇含量分別降低了5.17%、0.8%、0.5%(均為體積分數)。美極梅奇酵母的參與增強了藍莓酒的顏色強度,并增加了2.21%的總酚含量,同時,提高了134.63%的總酯含量,其中顯著提高了異戊酸乙酯、乙酸乙酯和乙酸異戊酯的含量,使藍莓酒的果香及花香香氣更加濃郁。綜上,美極梅奇酵母在改善藍莓酒品質方面具有較好的應用潛力,為生產優質藍莓酒提供新思路。