小麥肽及其與大豆肽、豌豆肽復配肽的體外組合對TNF-α刺激C2C12骨骼肌細胞蛋白表達的影響

程改平,李明亮,劉婧,徐淼,李可,閆九明,任瑋,秦修遠

1(四川大學華西醫院,四川 成都,610041)2(江南大學,糧食發酵與食品生物制造國家工程研究中心,江蘇 無錫,214122) 3(中國食品發酵工業研究院有限公司,北京,100015)4(北京市蛋白功能肽工程技術研究中心,北京,100015)

很多研究已經證實,小分子的食源性低聚肽具有比整蛋白、氨基酸和分子質量較大的多肽更好的吸收特性,且具有一定的生理功能[1]。小麥肽、大豆肽和豌豆肽分別是以小麥蛋白、大豆分離蛋白、豌豆蛋白為原料經過生物酶水解獲得的小分子低聚肽。

不同的實驗證實了小麥肽、大豆肽、豌豆肽在運動營養方面都具有積極作用。金振濤等[2]通過高效液相色譜法測定了小麥肽中谷氨酰胺含量達到了(23.54±0.49)%,而谷氨酰胺已被證實能夠促進在上骨骼肌的肌纖維中肌結蛋白desmin的合成,具有促進運動性肌肉微損傷的修復作用[3]。潘興昌等[4]對過度訓練的散打運動員進行了小麥肽的干預,發現小麥肽能夠通過減輕因運動訓練引起的的血睪酮降低和血皮質醇含量增加,有效減輕握力降低、反應時延長和骨骼肌損傷,促進運動性疲勞的恢復,對于過度訓練的發生有一定預防作用。其中對于骨骼肌的保護作用,ZHENG等[5]從清除自由基的角度也得到了相似的研究結論。FUSHIKI等[6]證明了大豆肽可以輔助大鼠運動過程中肌肉的增長。魏源[7]通過大鼠實驗發現大豆肽能夠抑制離心運動引起的骨骼肌組織葡萄糖-6-磷酸脫氫酶酶含量的升高,且比大豆蛋白能夠更顯著地減輕骨骼肌組織形態學和超微結構的變化[7]。李明亮等[8]也通過小鼠力竭游泳實驗發現了大豆肽和小麥肽的復配能夠協同增效,能夠通過提高小鼠自身的抗氧化能力抑制生物膜的脂質過氧化,來緩解骨骼肌的損傷。豌豆肽是近年來開發的一款新原料肽,在緩解胰島素抵抗[9]、增強免疫力[10]、抑制ACE酶活性[11-12]等方面均已見報道。豌豆肽來源于豌豆蛋白,豌豆蛋白的氨基酸組成均衡,符合聯合國糧農組織和世界衛生組織推薦的標準模式,優于大豆蛋白。因此,豌豆肽對于運動營養理論上也具有積極作用。目前,學界關于豌豆肽對于骨骼肌的作用的研究還鮮見,且多種生物活性肽復合的協同功能也少有研究。

因此,本研究建立TNF-α刺激模型,基于本實驗室前期研究已確立的大豆肽+豌豆肽復配比例,探究小麥肽、大豆肽、豌豆肽三者復合物對小鼠骨骼肌成肌細胞C2C12的影響作用,通過肌源調控因子和相關肌球蛋白、泛素連接酶、雷帕霉素靶蛋白與其相關調控因子的表達,結合Akt/mTOR通路初探作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小鼠骨骼肌成肌細胞C2C12,中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心;高糖培養基(DMEM),Hyclone公司;胎牛血清(fetal bovine serum, FBS),GIBCO公司;雙抗、細胞計數試劑盒(cell counting Kit-8, CCK-8)法檢測試劑盒,碧云天生物技術有限公司;腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor α, TNF-α),Sigma公司;絲氨酸/蘇氨酸激酶(Akt,又稱作蛋白激酶B或protein kinase B)磷酸化Akt(p-Akt),哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)、磷酸化m-TOR (p-mTOR)、成肌分化抗原(MyoGenic differentiation antigen, MyoD)、肌細胞生成素(MyoGenin, MyoG)、含三方基序63(tripartite motif containing 63 Gene, TRIM63),Proteintech公司;肌球蛋白重鏈(myosin heavy chain, MyHC)、肌肉萎縮盒F基因(musle atrophy F-box, MAFbx),Santa Cruz Biotechnology, Inc.。小麥肽、大豆肽、豌豆肽,由北京中食海氏生物技術有限公司饋贈。

1.2 儀器與設備

生物安全柜,新加坡ESCO公司;細胞培養箱,Thermo Fisher Scientific公司;熒光酶標儀,美谷分子儀器(上海)有限公司;流式細胞儀,BD C6公司;SDS-PAGE電泳系統,Bio-Rad公司;熒光及化學發光成像系統,上海勤翔科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養

C2C12細胞培養在含5%(體積分數)CO2的37 ℃恒溫培養箱中,生長培養基采用含10%(體積分數)FBS和1%(體積分數)雙抗的DMEM高糖培養基。細胞融合達80%左右時用0.25%(體積分數)胰酶進行消化傳代,平均2～3 d傳代1次。

1.3.2 實驗分組

本實驗室前期實驗已確定大豆肽和豌豆肽的復配劑量為大豆肽∶豌豆肽=2∶1(質量比,下同)。對數期生長的C2C12細胞的實驗分組情況如下:對照組,模型組,實驗組分為小麥肽組(XM),大豆肽+豌豆肽組(DD+WD),小麥肽∶大豆肽+豌豆肽=1∶1組,小麥肽∶大豆肽+豌豆肽=1∶2組,小麥肽∶大豆肽+豌豆肽=1∶3組,小麥肽∶大豆肽+豌豆肽=3∶1組,小麥肽∶大豆肽+豌豆肽=2∶1組,共9組。

1.3.3 細胞活力檢測

C2C12細胞按照1×105/mL的濃度接種于96孔板中,將1.3.2節所述各實驗組設置的梯度配比設置質量濃度梯度為0、100、200、400、600、800 μg/mL,與細胞共培養24 h,CCK-8法檢測細胞存活率,根據細胞存活率選擇最佳處理濃度。

1.3.4 誘導細胞分化

C2C12細胞按照5×105/mL的濃度接種于6孔板中,同時加入完全培養基培養細胞。待細胞培養1 d貼壁后,棄去DMEM完全培養基,加入分化培養基(含2%馬血清和1%雙抗的DMED高糖培養基),繼續培養。

1.3.5 TNF-α刺激模型建立

對照組的細胞不做任何處理,只加入分化培養基;模型組的細胞在分化培養基中含有終質量濃度為25 ng/mL的TNF-α;實驗組的細胞在分化培養基中含有終質量濃度為25 ng/mL的TNF-α和對應劑量的肽樣品。細胞在上述條件下繼續培養4 d,期間每天更換培養基并保證樣品相應濃度。

1.3.6 Western Blot

收集6孔板細胞,裂解,提取細胞全蛋白用于Western Blot,分別檢測以下蛋白的表達水平:MyHC,MAFbx,TRIM63,MyoD,MyoG,Akt,p-Akt,mTOR,p-mTOR。

1.4 數據處理

采用Origin 2022統計軟件對數據進行處理,實驗結果以均值±標準誤差(Mean±SE)表示。采用Tukey′s Method進行數據分析,各項試驗設置3～6次重復。本文圖中*代表與對照組相比具有顯著性差異(P<0.05),#代表與模型組相比具有顯著性差異(P<0.05);**代表與對照組相比差異極顯著(P<0.01),##代表與模型組相比差異極顯著(P<0.01)。

2 結果與分析

2.1 細胞存活率檢測

用CCK-8法檢測小麥肽、大豆肽和豌豆肽復配物對C2C12細胞的存活率影響,以確定安全劑量范圍。由圖1可知,在肽質量濃度為200 μg/mL和400 μg/mL時,肽處理不會對細胞存活率產生顯著影響;其余各配比處理組在各濃度時都不會對細胞存活率產生顯著影響。本實驗后續采取肽的終質量濃度為200 μg/mL。

2.2 MyoD、MyoG和MyHC蛋白表達檢測

肌球蛋白重鏈(MyHC)是肌球蛋白的基本組成單位。MyoD和MyoG屬于肌源調控因子,MyoD是肌肉譜系的決定性調控因子,MyoG基因表達可以被MyoD激活,促進肌肉干細胞分化。由圖2可知,經TNF-α處理后,C2C12細胞中MyoD、MyoG和MyHC的蛋白表達量相比于對照組出現了不同程度的下降,尤其是肌球蛋白重鏈MyHC的表達水平與對照組相比顯著降低,這與陳靖陽等[13]研究H2O2刺激C2C12細胞產生氧化應激引起的MyoD、MyoG基因表達下降趨勢一致;經過肽樣品處理后,上述3種蛋白的表達量出現不同程度的升高,其中,XM∶DD+WD=1∶3處理組細胞中3種蛋白的表達量相比于模型組升高最為顯著。

a-XM;b-DD+WD;c-XM∶DD+WD=1∶1;d-XM∶DD+WD=1∶2;e-XM∶DD+WD=1∶3;f-XM∶DD+WD=3∶1;g-XM∶DD+WD=2∶1圖1 CCK-8法檢測細胞存活率Fig.1 Cell survival rate measured by CCK-8 assay

a-MyHC;b-MyoD;c-MyoG圖2 MyoD、MyoG和MyHC蛋白條帶及灰度分析Fig.2 Protein band and gray analysis of MyoD、MyoG and MyHC

2.3 TRIM63和MAFbx蛋白表達檢測

泛素-蛋白酶體系統是細胞內蛋白質降解的主要途徑[14]。蛋白質先被泛素標記,然后被蛋白酶體識別和降解。在幾乎所有類型的肌肉萎縮中,2種較重要的E3泛素連接酶:與骨骼肌蛋白降解肌肉相關的MAFbx[15]和參與骨骼肌萎縮的TRIM63(也稱為MuRF1)[16]都被誘導高表達。由圖3可知,在模型組中,2種蛋白的表達量相比于對照組都顯著升高,經過肽樣品處理后,2種蛋白的表達水平開始出現下降。其中,以XM∶DD+WD為1∶3和2∶1兩個處理組細胞中2種蛋白的表達水平相比于模型組降低最為顯著。

2.4 Akt,p-Akt,mTOR,p-mTOR蛋白表達檢測

雷帕霉素靶蛋白mTOR是Akt下游重要底物之一,mTOR主要通過p70 s6k和4E-BP1 2條傳導通路調節蛋白的合成和分解,另外,Akt活化后也能抑制糖原合酶激酶3β(GSK3β)的活性,從而增加蛋白質的合成,Akt-mTOR- P70 s6K和Akt-GSK3β通路是協同作用,共同促進肌細胞的肥大效應[17-18]。由圖4可以看出,模型組中Akt和mTOR的磷酸化水平相比于對照組顯著降低,而經過肽樣品處理后2種蛋白的磷酸化水平出現了不同程度的升高,其中,以XM∶DD+WD=1∶3處理組細胞中2種蛋白的磷酸化水平相比于模型組升高最為顯著。

a-Akt及其磷酸化產物;b-mTOR及其磷酸化產物圖4 Akt、mTOR和其磷酸化蛋白條帶及灰度分析Fig.4 Protein band and gray analysis of Akt、mTOR and their phosphorylated form

3 結論

肌肉組織是不能自身形成新纖維的終末分化結構,C2C12細胞是來源于小鼠骨骼肌C2細胞系的細胞株,具有分化能力,因此通常作為成肌細胞增殖和分化的模型[19]。TNF-α是一種促炎癥細胞因子,多項研究已發現在一些肌肉萎縮、老年肌少癥患者的骨骼肌的表達明顯升高,也常被用做肌肉衰減或關節健康研究模型的刺激因子[20-21]。MyoD、MyoG、MyHC、MAFbx、TRIM63與肌肉生長、分化、降解過程密切相關。肌源調控因子MyoD、MyoG和相關肌球蛋白MyHC是肌肉分化的標志基因表達的蛋白,泛素連接酶MAFbx是蛋白降解的關鍵調節因子,被認為是經典的蛋白降解標志,泛素連接酶TRIM63是TRIM家族蛋白之一,其含量能夠反映骨骼肌蛋白質分解機制的泛素蛋白酶體途徑表達增多的情況[22-23]。

蛋白的表達過程在RNA表達后經過修飾、折疊、磷酸化等步驟形成具有功能的蛋白質,因此RNA表達水平不等于蛋白表達水平,考察蛋白表達水平的變化能夠反應模型及給藥后細胞的真實變化。本研究建立了TNF-α刺激C2C12細胞模型,實驗表明TNF-α能引起C2C12細胞中肌源調控因子MyoD、MyoG和相關肌球蛋白MyHC的蛋白表達水平下降,也能夠引起與肌肉蛋白降解相關的泛素連接酶MAFbx和TRIM63表達升高。小麥肽、大豆肽、豌豆肽均在不同實驗中被證實對于肌肉促進、運動營養健康具有積極作用。本研究中,小麥肽與大豆肽+豌豆肽以1∶3的質量比進行復配在幾種配比中可以最有效地改善由TNF-α造成的C2C12細胞肌蛋白含量降低,提高C2C12細胞中成肌調節因子和肌肉蛋白的表達水平。

合成代謝是肌肉再生、修復與重塑的基礎。影響肌肉健康的關鍵合成代謝通路是絲氨酸蘇氨酸激酶/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(Akt/mTOR)通路,在蛋白翻譯(上調翻譯起始和核糖體生物發生)中作用關鍵。本研究發現MyoD、MyoG、MyHC、MAFbx、TRIM63蛋白表達的變化趨勢與磷酸化的Akt和mTOR的表達趨勢一致,說明小麥肽與大豆肽+豌豆肽改善C2C12細胞肌蛋白表達的作用受到Akt/mTOR通路調節,肽能夠降低細胞中E3泛素連接酶的表達和提高Akt/mTOR的蛋白磷酸化水平,從而降低細胞中蛋白降解和促進蛋白合成。