Rhizopus stolonifer幾丁質脫乙酰酶的異源表達及其與幾丁質酶的協同作用研究

張巧,李永成

1(食品科學與工程學院(海南大學),海南 ?？?570228) 2(食品科學與工程技術研究院(賀州學院),廣西 賀州,542899)

幾丁質是自然界含量僅次于纖維素的大分子可再生生物質資源,年產量達到1011t以上[1]。然而,幾丁質具有高度的晶體結構且排列緊密,不溶于水、稀酸或稀堿溶液中,目前仍然是一種難以被開發利用的多糖化合物。與幾丁質相比,殼聚糖具有較好的溶解度和生物活性。例如,殼聚糖可用來制備生物膜,應用于食品保鮮和醫療等方面[2]。一般來說,殼聚糖的生物活性主要取決于其理化參數,包括聚合度、脫乙酰度和乙?；Ｊ?。

目前,殼聚糖通常采用化學法制備,即采用濃堿對幾丁質進行脫乙酰作用。然而,化學法制備殼聚糖會產生大量的高堿度廢水,而且獲得的殼聚糖具有隨機的乙?；Ｊ?影響其理化性質。采用幾丁質脫乙酰酶(chitin deacetylase, CDA)也可以制備殼聚糖,具有環保的優點,并且生產的殼聚糖是非隨機的乙?；Ｊ絒3]。CDA主要在一些真菌中發現,如Saccharomycescerevisiae[4]、Colletotrichumlindemuthianum[5]、Podosporaanserina[6]、Coprinopsiscinerea[7]、Aspergillusnidulan[8]、Mucorrouxii[9]和Pestalotiopsissp.[10]。迄今為止,已報道的CDA數量較少,且酶活性較低。這是因為,CDA在幾丁質上的作用位點僅在N-乙?；砻?而不是幾丁質內部[11]。因此,探索新型高效的CDA,或開發其他應用技術以提高幾丁質向殼聚糖的生物轉化效率,具有重要的研究意義。

幾丁質的高效降解需要多種酶的協同作用。來源于Vibrioharveyi的2種幾丁質酶在降解幾丁質方面表現出較好的協同作用[12]。裂解性多糖單加氧酶(lytic polysaccharide monooxygenase, LPMO)與幾丁質酶協同作用,從而促進幾丁質降解[13]。CDA與幾丁質酶的協同作用也可能促進幾丁質的水解。這是因為,幾丁質經過脫乙?；?其水溶性提高,這樣有利于幾丁質的降解[14];當幾丁質的糖苷鍵斷裂時,結晶幾丁質變得更加疏松,底物可及性增加,從而增強了CDA對幾丁質的脫乙酰作用[15]。因此,與單獨使用CDA或幾丁質酶水解幾丁質相比,CDA和幾丁質酶的協同水解可能對幾丁質的脫乙酰和降解更有效。此外,CDA和幾丁質酶對幾丁質的協同作用產生殼寡糖和幾丁寡糖,其可能比幾丁質酶產生的單一幾丁寡糖具有更廣泛的生物活性和應用。在本研究中,對來源于Rhizopusstolonifer的CDA (RsCDA1)進行了基因克隆、異源表達、酶學特性的研究。另外,還考察了RsCDA1與來源于V.harveyi的幾丁質酶(VhChit2)對幾丁質脫乙酰和降解的協同作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

幾丁質和殼聚糖(脫乙酰度:90%),上海源葉生物科技有限公司;N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAc和幾丁寡糖(GlcNAc)2-6,青島博智匯力生物科技有限公司;表達載體pPIC9K和PichiapastorisGS115感受態細胞,北京華越洋生物科技有限公司;克隆宿主EscherichiacoliDH5α和E.coliBL21(DE3),Novagen公司;限制性內切酶EcoR I、NotI、T4連接酶,ThermoFisher Scientific公司;乙酸檢測試劑盒(K-ACET),愛爾蘭Megazyme公司;VhChit2為本實驗室制備,其對幾丁質的活力約為17 U/mg。

MD培養基:3.4 g酵母氮源(無硫酸銨)、10 g硫酸銨、20 g葡萄糖、30 g瓊脂粉、1 L蒸餾水,115 ℃滅菌30 min,再加入0.4 mg已過濾除菌的生物素。

BMMG培養基:3.4 g酵母氮源(無硫酸銨)、10 g硫酸銨、10 g酵母粉、20 g蛋白胨、100 mL磷酸鉀緩沖液(1 mmol/L, pH 6.0)、10 g甘油、1 L蒸餾水,115 ℃滅菌30 min, 再加入0.4 mg過濾除菌的生物素。

BMMY培養基:3.4 g酵母氮源(無硫酸銨)、10 g硫酸銨、10 g酵母粉、20 g蛋白胨、100 mL磷酸鉀緩沖液(1 mmol/L, pH 6.0)、1 L蒸餾水,115 ℃滅菌30 min,再加入0.4 mg過濾除菌的生物素。

膠體幾丁質:5 g幾丁質粉,加入100 mL濃HCl攪拌均勻, 4 ℃下靜置1 d,再加入500 mL的50%預冷乙醇,4 ℃下靜置1 d,離心(6 000×g,10 min),沉淀水洗至pH中性。

1.2 儀器與設備

2510電轉化儀,德國Eppendorf公司;Ultraflextreme基質輔助激光解析電離串聯飛行時間質譜儀,德國Bruker公司;isoprime precisION穩定同位素比質譜儀,德國Elementar公司。

1.3 實驗方法

1.3.1RsCDA1基因的克隆

從R.stolonifer的菌絲體中提取總RNA,然后再合成cDNA。從NCBI搜索RsCDA1的氨基酸序列(GenBank:RCI04983.1),設計引物RsCDA1-F(5′-CCGGAATTCCATGACAAAAAAGAAGCAAAACCAG-3′)和RsCDA1-R(5′-ATAAGAATGCGGCCGCCAGCAATAGCCAACCCGAG-3′)。將限制性內切酶(EcoRI和NotI)酶解后的PCR產物連接至pPIC9K載體并轉化至E.coliDH5α。將重組質粒通過電轉化(1 500 V,5 ms,2 mm電轉化杯)至P.pastorisGS115中,再涂布于MD培養基中,30 ℃倒置培養2 d。

1.3.2RsCDA1的誘導表達

將重組菌P.pastoris接種至50 mL的BMGY培養基中,28 ℃、250 rpm振蕩培養至OD600值達到5.0。離心(3 000×g,5 min),將菌體轉移至50 mL的BMMY培養基中,使BMMY培養基的初始OD600值達到2.0,28 ℃、250 r/min振蕩培養7 d,每天補充0.5%～2.0%甲醇,對RsCDA1進行誘導表達。每天收集發酵液,4 ℃離心(8 000×g,15 min),上清液通過0.45 μmol/L濾膜過濾,使用組氨酸標簽純化試劑盒對RsCDA1進行純化,并保存于50 mmol/L、pH 7.0的磷酸鈉緩沖液中。采用福林酚法測定RsCDA1的蛋白濃度,采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析RsCDA1的純度。

1.3.3RsCDA1的活力及酶學性質

1.3.3.1 CDA活力的測定

在800 μL的膠體幾丁質懸浮液(20 mg/mL,pH 6.5)中,加入200 μL的酶液,反應體系在45 ℃下攪拌反應2 h,沸水中加熱10 min使酶失活,離心(8 000×g,5 min)。使用乙酸檢測試劑盒測定反應上清液中產生的乙酸含量。1單位CDA活力(U)定義為45 ℃、pH 6.5條件下1 h從膠體幾丁質中釋放1 μmol/L乙酸所需的酶量。

1.3.3.2 最適溫度和最適pH

分別考察RsCDA1在30～70 ℃ 和pH 6～9(pH 6～8,50 mmol/L磷酸鈉緩沖液;pH 8～9,50 mmol/L Tris-HCl)下的活力,從而確定RsCDA1的最適溫度和最適pH。

1.3.3.3 熱穩定性和pH穩定性

將RsCDA1分別置于30～50 ℃下保溫0.5、1.0、1.5和2.0 h,測定殘余活力。將RsCDA1置于pH 6～9 環境中,25 ℃下保溫2 h,測定殘余活力。

1.3.3.4 金屬離子和底物對RsCDA1活力的影響

在酶反應體系中分別添加1 mmol/L的Ca2+(CaCl2)、Mn2+(MnCl2)、Mg2+(MgCl2)、Fe2+(FeSO4)、Zn2+(ZnSO4)、Ni2+(NiSO4)、Cu2+(CuCl2)、Ba2+(BaCl2)和Co2+(CoCl2)等,探究金屬離子對RsCDA1活力的影響;分別以20 mg/mL的幾丁質酚、蝦殼粉、(GlcNAc)1-6代替膠體幾丁質,測定RsCDA1的底物特異性。

1.3.4 脫乙酰模式分析

使用5 U/mL的RsCDA1對20 mg/mL的(GlcNAc)4進行酶解。45 ℃、pH 6.5下分別酶解0.5、2、6和24 h,然后沸水中加熱10 min,離心(12 000×g,10 min),使用MALDI-TOF-MS分析RsCDA1酶解(GlcNAc)4的脫乙?；a物。在酶解后的上清液中加入0.5 mg/mL的 NaCl,取1 μL酶解上清液和1 μL 2,5-二羥基苯甲酸溶液(15 mg/mL)先后點樣于MALDI 板上進行檢測[16]。

1.3.5RsCDA1與VhChit2的協同作用

將RsCDA1與0.5 U/mL的VhChit2以摩爾濃度比10∶1的比例混合,混合酶或單酶分別對20 mg/mL幾丁質粉進行水解,在50 ℃、pH 7.0(50 mmol/L磷酸鈉緩沖液)下攪拌反應 2 h。采用3,5-二硝基水楊酸法測定產生的還原糖含量[17],使用乙酸檢測試劑盒測定釋放的乙酸含量。對幾丁質酶的協同作用定義為聯合使用RsCDA1與VhChit2產生的還原糖含量與單獨使用VhChit2產生的還原糖含量的比值。對CDA的協同作用定義為聯合使用RsCDA1與VhChit2產生的乙酸含量與單獨使用RsCDA1產生的乙酸含量的比值。

分別考察了反應溫度(40～55 ℃)、pH(6～8)、摩爾濃度比(RsCDA1∶VhChit2=1∶1、5∶1、10∶1、20∶1、40∶1)和反應時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h)對RsCDA1與VhChit2協同作用的影響。

1.3.6 幾丁質脫乙酰度的測定

采用元素分析法測定幾丁質的脫乙酰度。通過穩定同位素比質譜儀測定幾丁質樣品的碳氮比(C/N),參照公式(1)計算幾丁質樣品的脫乙酰度[18]:

(1)

2 結果與分析

2.1 RsCDA1的表達與純化

如圖1所示,使用不同添加量的甲醇對RsCDA1進行誘導,CDA活力在前5 d迅速升高,然后趨于穩定水平,但20 g/L甲醇誘導的RsCDA1在5 d后開始緩慢下降。RsCDA1誘導表達的最佳甲醇添加量是10 g/L,過量或少量的甲醇都會抑制該酶的表達(圖1-a)。在甲醇質量濃度為10 g/L的條件下,誘導5 d的RsCDA1活力達到13.5 U/mL。通過Ni2+親和層析,對RsCDA1發酵上清液進行純化,結果如圖1-b所示。純化后的RsCDA1蛋白電泳上有單條帶,分子質量約為35 kDa,與其理論預測值35.1 kDa較符合。RsCDA1的分子質量與此前報道的PaCDA[6]和NaCDA[19]的分子質量(35.5 kDa和36 kDa)較接近。RsCDA1純酶液的比活力為5.2 U/mg。與PaCDA相比,RsCDA1能夠從幾丁質中脫除更多的乙?；?說明RsCDA1具有更高的脫乙?；盍?。據報道,CDA活性可以通過測定乙酸鹽[6]、4-硝基苯胺[19]和3-甲基-2-苯并噻唑啉腙[20]的含量。其中,從幾丁質中釋放的乙酸鹽含量是CDA活性的最佳反映。

泳道M-標準蛋白Marker;泳道1-RsCDA1發酵上清液; 泳道2-RsCDA1純酶液 a-不同甲醇濃度和時間誘導的CDA活力;b-RsCDA1的SDS-PAGE圖圖1 RsCDA1的表達和純化Fig.1 Expression and purification of RsCDA1

2.2 溫度與pH對RsCDA1活力和穩定性的影響

RsCDA1在45 ℃時的活力最高,40 ℃和50 ℃時的活力分別為最高活力的78.7%和93.9%,在70 ℃下反應幾乎無活性(圖2-a)。RsCDA1的最適pH值為6.5,在pH值6.0～7.0時的相對活性超過80%。然而,當pH值為9.0時,RsCDA1的相對活性僅為58.2%(圖2-b)。RsCDA1在30 ℃和35 ℃下的酶活性較穩定,保溫2 h后仍分別保留了75.4%和65.9%的初始活力,而45 ℃和50 ℃下的酶穩定性較差,保溫2 h后的殘余活力分別為20.7%和4.1%(圖2-c)。RsCDA1在pH 6.5～8.0具有良好的穩定性,此范圍pH條件下25 ℃保溫2 h的殘余活力均保持在70%以上(圖2-d)。很多CDAs在pH 7.0～8.0時表現出較高活性,在堿性條件下表現出較高的pH穩定性[21]。然而,以乙二醇幾丁質為底物時,來源于C.lindemuthianum的ClCDA在pH 11.5～12.0時仍有較高活力[22],而來源于M.rouxii的MrCDA能夠耐受pH 4.5的酸性條件[9]。

a-最適溫度;b-最適pH;c-熱穩定性;d-pH穩定性圖2 溫度和pH對RsCDA1活力和穩定性的影響Fig.2 Effect of temperatures and pH on the activity and stability of RsCDA1

2.3 金屬離子與底物對RsCDA1活力的影響

如表1所示,1 mmol/L的Ca2+、Mn2+、Mg2+、Zn2+、Ba2+和Co2+顯著提高了RsCDA1活力,相對活力分別提高到105.3%、109.8%、121.9%、114.0%、111.6%和118.2%(P<0.05);而1 mmol/L的Ni2+和Cu2+則顯著抑制RsCDA1活力,相對活力分別下降到90.5%、37.1%和65.8%(P<0.05);Fe2+對RsCDA1活力無顯著影響(P>0.05)。有研究表明,部分CDAs如ClCDA和AnCDA,需要Co2+的參與才表現出活性[7, 15]。與膠體幾丁質相比,RsCDA1對幾丁質粉的相對活力僅為25.6%。此外,該酶不能水解蝦殼粉釋放乙酸,對底物GlcNAc也沒有活力。隨著底物幾丁寡糖聚合度(n=1～6)的增加,RsCDA1的活力增強。以(GlcNAc)6為底物時,RsCDA1的相對活力達到159.1%。這可能是因為RsCDA1更傾向于去除中間乙?；皇悄┒艘阴；鵞23]。TOKUYASU等[22]也報道,利用聚合度高的幾丁質低聚物作為底物時,可以增強ClCDA的活性。

2.4 RsCDA1的脫乙酰模式

研究RsCDA1對(GlcNAc)4的脫乙?；a物,揭示其脫乙酰模式,如圖3所示。在反應開始后的0.5 h,從一些(GlcNAc)4(A4)中去除一個乙?；?形成部分脫乙?；a物(A3D1)。隨著反應時間的延長,逐漸產生脫乙酰度較高的A2D2、A1D3、D4。因此,RsCDA1在有足夠的酶量和反應時間的前提下,水解幾丁寡糖使其完全脫乙酰。有研究表明,使用0.15 μg/μL來源于C.cinerea的CDA3水解2.5 mmol/L的(GlcNAc)4時,無法檢測到完全脫乙酰的產物D4,而當酶量增加到0.45 μg/μL時,可以檢測到完全脫乙酰的產物D4。此外,CDA3去除幾丁質寡糖末端的最后一個乙?；a生完全去乙?；a物需要較長的時間,且隨著底物幾丁寡糖聚合度的增加,完全去乙?；a物的形成變慢[24]。RsCDA1對幾丁寡糖的完全去乙?；Ｊ脚cAnCDA相似[15]。

表1 金屬離子與底物對RsCDA1活力的影響Table 1 Effect of metal ions and substrates on the activity of RsCDA1

a- 水解0.5 h;b- 水解2 h;c- 水解6 h;d- 水解24 h圖3 RsCDA1水解產物的MALDI-TOF-MS分析Fig.3 MALDI-TOF-MS analysis of hydrolysis products by RsCDA1注:A4、A3D1、A2D2、A1D3和D4分別表示乙?；鶠?、3、2、1和0的四糖。

2.5 RsCDA1與VhChit2對幾丁質的協同水解作用

為了提高VhChit2與RsCDA1對幾丁質的協同作用,研究了反應溫度、pH、摩爾比和反應時間對協同度的影響,結果如圖4所示。RsCDA1在45 ℃、pH 6.5條件下的CDA活力最高(圖2);在前期研究中發現,VhChit2在50 ℃、pH 7.0條件下的幾丁質酶活力最高[12],RsCDA1與VhChit2最適反應條件的微小差異為它們協同水解幾丁質提供了可能。結果表明,RsCDA1與VhChit2協同水解幾丁質的最適溫度是50 ℃(圖4-a),最適pH值是6.5(圖4-b)。RsCDA1與VhChit2的摩爾濃度比為10∶1時,幾丁質釋放出來的還原糖和乙酸含量較高(圖4-c)。隨著酶解時間的延長,兩酶聯合使用時對幾丁質酶和CDA的協同度均呈現先上升后下降的趨勢,最佳的酶解時間是2 h(圖4-d)。因此,當聯合使用RsCDA1與VhChit2(摩爾濃度比為10∶1)水解幾丁質時,在50 ℃、pH 6.5條件下攪拌反應2 h時,對幾丁質酶和CDA的協同度分別達到120.3%和175.6%。RsCDA1與VhChit2對幾丁質的降解和脫乙酰具有協同作用。

a-不同反應溫度的協同度;b-不同反應pH的協同度;c-不同摩爾濃度比的協同度;d-不同反應時間的協同度圖4 反應溫度、pH、摩爾濃度比(RsCDA1:VhChit2)和反應時間對RsCDA1與VhChit2協同度的影響Fig.4 Effect of reaction temperature, pH, molar concentration ratio (RsCDA1:VhChit2), and time on the degree of synergy of RsCDA1 and VhChit2注:同一指標中字母完全不同的數值之間有顯著性差異(P<0.05)。

2.6 RsCDA1與VhChit2協同水解幾丁質的脫乙酰度

分別使用VhChit2、RsCDA1及其組合水解幾丁質粉,幾丁質的脫乙酰度如圖5所示。單獨使用VhChit2水解,幾丁質的脫乙酰度僅為7.2%,而單獨使用RsCDA1及聯合使用RsCDA1與VhChit2,幾丁質的脫乙酰度得到顯著提高,分別達到27.5%和35.3%。一般來說,較高的脫乙酰度可以提高幾丁質的水溶解性,有助于CHI對幾丁質的進一步降解[14]。因此,RsCDA1水解幾丁質后脫乙酰度的增加可能是RsCDA1與VhChit2協同降解幾丁質的原因之一。

3 結論

本研究報道了一種來源于R.stolonifer的CDA(RsCDA1),酶活力達到5.2 U/mg。RsCDA1在45 ℃ 和pH 6.5的條件下表現出最高活性。在溫度低于40 ℃、pH 6.5～8.0范圍內保持相對穩定。1 mmol/L Ca2+、Mn2+、Mg2+、Zn2+、Ba2+和Co2+可以提高RsCDA1的活性,但1 mmol/L的Ni2+和Cu2+對RsCDA1活性有抑制作用。底物特異性結果表明,RsCDA1對(GlcNAc)4-6的脫乙?；钚愿哂?GlcNAc)1-3。RsCDA1對幾丁四糖表現出完全脫乙酰模式。

此外,RsCDA1與幾丁質酶VhChit2在幾丁質的降解和脫乙?；矫姹憩F出良好的協同作用。經優化后,兩酶協同水解時對幾丁質酶和CDA的協同度分別達到120.3%和175.6%。與單獨使用RsCDA1水解幾丁質(27.5%)相比,RsCDA1與VhChit2的聯合使用顯著增加了幾丁質的脫乙酰度(35.3%)。RsCDA1與VhChit2對幾丁質降解的協同作用可能是由于RsCDA1對幾丁質的脫乙酰作用。綜述所述,這種CDA具有將幾丁質綠色、高效轉化為殼聚糖的潛力。