干腌牛肉活性肽的分離與抗氧化性能研究

張迎陽,陳文濤,鄒平,徐瑩

(常州大學 食品學院,江蘇 常州,213164)

肉類食品是人類飲食的重要組成部分,也是世界上最大的食物消費之一。我國的肉制品加工產量早在2016年就達到1億t,占世界總產量的30%,是世界上最大的肉類加工國之一?，F在年消費量穩步上升[1]。同時,我國是與美國和巴西同時排行第一的肉制品消費國,肉類總消費量達8 500萬t,占世界肉類消費總量的30%。

中國食肉的歷史源遠流長,方式多種多樣,但大多采用傳統腌制方式保存。傳統腌制肉制品是指將畜禽的生肉加入鹽(或鹵水)和香料腌制,并在適當的溫度條件下經過風干、熟化等工序,最終形成獨特的腌制風味。我國加工品種較多,代表產品有金華火腿、宣威火腿、廣式臘腸、臘肉等[2]。與此同時,隨著經濟的發展,人們對于健康也越來越關注,傳統肉制品的安全性也開始被越來越多地提及。

生物活性肽是由大約2～20個通過肽鍵連接的氨基酸組成的短聚合物。在食物中,它們是無活性的,是前體蛋白的一部分。但由于其是食品加工(發酵、老化、酶促加工)或消化過程而釋放的,活性肽可以影響身體的許多生理功能,如抗氧化劑、抗菌、抗癌、抗血栓、抗糖尿病、免疫調節和益生菌[3]。近些年的研究發現,在傳統腌制火腿中存在很多活性肽,胡亞亞等[4]證實金華火腿粗肽中的400～1 000 Da的粗肽,具有很強的抗氧化能力;左慶翔[5]通過體內與體外實驗證實了金華火腿的NLLPP、DEP、DAVLPA這3條活性肽具有降血壓效果;鄭錦曉等[6]通過體外實驗發現宣威火腿中QYYNGEEHVRFDSDVGEYR具有抗菌的效果;吳寶森等[7]也通過體外實驗證實了諾鄧火腿具有一定的抗氧化能力。

通過測定不同時期干腌牛肉粗肽的DPPH自由基清除率、羥自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率和ABTS陽離子自由基清除率來評定干腌牛肉中生物活性肽的抗氧化活性能力。測試了粗肽對于大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的抑菌能力。并分離出了抗氧化能力較強的短肽。腌制肉制品是我國傳統特色食品之一,該文研究了干腌牛肉加工過程中肽類物質的釋放及其抗氧化、抑菌活性,對于科學認識干腌肉制品加工工藝的科學內涵具有一定的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料:牛腱子,市售,購自永輝超市;食鹽,購自永輝超市,淮鹽牌。

試劑選擇:ABTS、DPPH、1,10-菲咯啉,Sigma-Aldrich(上海)貿易有限公司;鹽酸、無水乙醇、牛血清蛋白、氫氧化鈉、鄰二氮菲、過氧化氫、硫酸亞鐵,上海凌峰化學試劑有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、三氯乙酸、谷胱甘肽(glutathione,GSH),上海阿拉丁試劑有限公司。所有其他化學品和試劑均為分析級。

1.2 儀器與設備

721 N可見光分光光度計,上海儀電分析儀器有限公司;多功能離心機,Eppendorf/艾本德;SHB-ⅢA環水式真空泵,上海聚昆儀器設備有限公司;ATY224精密電子天平,常州萬泰天平儀器有限公司;UV-3600紫外可見近紅外分光光度計,島津企業管理(中國)有限公司;100～1 000 mL移液槍,Shanghai jiaan Analyzer Factory。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品處理

采用下述傳統腌制牛肉方法腌制,將牛肉分切成300 g每份,按照5%食用鹽,90%相對濕度,3～5 ℃,腌制5 d;隨后12 ℃,80%相對濕度,腌制5 d;隨后20 ℃,70%相對濕度,腌制7 d,體重下降45%;最后22.5 ℃下,腌制30 d。取樣時間為腌制的第0、5、10、17、32、47天。

1.3.2 粗肽提取

提取方法根據ZHU等[8]進行修改。本實驗采用鹽酸提取法,剝去肉眼可見的脂肪和結締組織,用勻漿機將50 g肌肉在250 mL 0.01 mol/L鹽酸中勻漿。均質采用4次沖程,每次30 s,在冰水中冷卻。勻漿在低溫(12 000×g,4 ℃,20 min)下離心,快速定性濾紙過濾后,用3倍量乙醇變性沉淀上清液中的蛋白質組分。將混合物在4 ℃下放置20 min,然后再在4 ℃下以12 000×g離心20 min。然后,將混合物在50 ℃、55 r/min的旋轉蒸發器中除去乙醇,然后冷凍干燥并貯存在-20 ℃中進行進一步檢測。粗肽含量的測定參照徐娟等[9]方法,得到回歸線方程為y=0.128 1x-0.000 2,R2=0.999 7,進而求得多肽含量,以下所有結果測試前均按此方法測定肽質量濃度并配制溶液。

1.3.3 粗肽的平均鏈長

平均鏈長采用嚴群芳[10]方法,稍加調整。茚三酮顯色液配制:25 mL沸水中依次加入1 g茚三酮,1 g 維生素C,攪拌15 min后冷卻,過濾后的沉淀用清水洗滌3次,干燥可得還原茚三酮。將170 mg茚三酮和30 mg還原茚三酮溶于20 mL乙醇中,即得茚三酮顯色液。在1 mL粗肽液(1 mg/mL)中依次加入1 mL醋酸緩沖液和1 mL顯色液,沸水浴15 min,冷卻后加入3 mL乙醇,波長在570 nm處測吸光度A值。配制梯度濃度甘氨酸標準氨基酸溶液,繪制標準曲線,計算多肽含量,根據氨基酸平均分子質量計算多肽個數。

1.3.4 粗肽的氨基酸含量與形貌觀察

為了探究消化系統對于粗肽液的影響,選用胃蛋白酶、胰蛋白酶處理粗肽。方法如下,將提取液用去離子水配質量濃度為1 mg/mL粗肽液,用1.0 mL HCl調節體系的pH值為2.0,加入4%(粗肽含量的4%,質量分數)胃蛋白酶,攪拌后37 ℃恒溫反應2 h,取出沸水浴滅酶10 min,冷卻后4 000 r/min離心15 min。取經胃蛋白酶處理后的粗肽液,用0.9 mol/L碳酸氫鈉調pH值至5.3,再用1.0 mol/L氫氧化鈉調至7.5,加入4%(粗肽含量的4%,質量分數)胰蛋白酶,攪拌后37 ℃恒溫反應2 h,取出沸水浴滅酶10 min,冷卻后4 000 r/min離心15 min,冷凍干燥。粗肽樣品中加5%磺酸水楊酸沉淀蛋白(1∶4,g∶mL),用高速冰凍離心機在18 000 r/min轉速下離心30 min,取上清液過保存,用0.45 μm+0.22 μm混合膜過濾后上機分析。

取質量5 mg的粗肽凍干粉,25 ℃進行圓二色譜測定,在190～260 nm,以1 nm間隔和1 nm帶寬采集數據。

1.3.5 抗氧化測試

采用DPPH法和羥自由基清除法,研究了不同時期不同部位干腌牛肉活性肽在1 mg/mL質量濃度下的抗氧化能力,對照組為同質量濃度的GSH。

1.3.5.1 DPPH自由基清除率

根據LI等[11]方法,稍加修改。將不同腌制時期的提取物分別配制成質量濃度為1 mg/mL的粗肽液,以GSH作為對照組。將2 mL 0.2 mmol/L DPPH自由基溶液(95%乙醇溶解)加入2 mL樣品,混勻,室溫避光反應30 min,在517 nm波長處測樣品吸光度?？瞻诪? mL樣品加2 mL 95%乙醇,對照為2 mL DPPH加2 mL 95%乙醇,同樣條件下測A517 nm。DPPH自由基清除率計算如公式(1)所示:

(1)

式中,As,Ab分別代表樣品和空白的吸光度。

1.3.5.2 超氧陰離子自由基清除率

參照LIU等[12]方法并稍加修改。具體方法如下,無菌水配制質量濃度為1 mg/mL的粗肽液與GSH對照。1.5 mL粗肽液,依次加入0.5 mL 300 μmol/L氯化硝基四氮唑藍(pH 8.0 Tris-HCl緩沖液配制),0.5 mL 468 μmol/L還原型輔酶Ⅰ(pH 8.0 Tris-HCl緩沖液配制),0.5 mL 60 μmol/L過硫酸氫鉀(pH 8.0 Tris-HCl緩沖液配制),振蕩混勻,25 ℃水浴5 min,560 nm波長測定吸光值,以緩沖液代替樣品作為空白對照。超氧陰離子自由基清除率按公式(2)計算:

(2)

式中:As,Ab分別代表樣品和空白吸光度。

1.3.5.3 羥自由基清除率

參照LI等[11]的方法進行?；旌衔镉? mL 1,10-鄰菲咯啉(5 mmol/L)和4 mL FeSO4(5 mmol/L)組成,然后加入3 mL磷酸鹽緩沖液(pH 7.4),然后加入3 mL H2O2(0.01%)和4 mL粗肽(1 mg/mL)。最后,將混合物在36 ℃下放置1 h,在536 nm處測量吸光度。對照:用蒸餾水代替多肽溶液,其他試劑與樣品相同?？瞻?用蒸餾水代替H2O2,其他試劑與樣品相同。使用公式(3)確定結果:

(3)

式中:As,Ac和Ab分別代表樣品、對照和空白的吸光度。

1.3.5.4 ABTS陽離子自由基清除率

根據ZHU等[8]所描述的方法進行。將5 mL 7 mmol/L ABTS溶液與88 μL 140 mmol/L過硫酸鉀溶液混合,在20 ℃下放置20 h,加入約3倍75%(體積分數)乙醇,在734 nm波長處的吸光度為0.70±0.02,得到ABTS陽離子自由基。樣品由9.8 mL稀釋的ABTS陽離子自由基溶液和0.2 mL 1 mg/mL粗肽組成。以0.2 mL蒸餾水和9.8 mL稀釋的ABTS陽離子自由基溶液的混合物為空白,以1 mg/mL粗肽0.2 mL和9.8 mL蒸餾水為對照。所有混合物在室溫下放置0.5 h,用分光光度計在734 nm處測定。ABTS陽離子自由基清除活性如公式(4)所示:

(4)

式中:As,Ac和Ab分別表示樣品、對照和空白的吸光度

1.3.6 抗氧化性能的穩定性研究

肽在被人體攝入后,消化部位的酸化,酶解以及鹽分,都可能會對其穩定性產生影響,甚至失活。本研究主要研究成熟后的干腌牛肉食鹽含量,溫度,pH等因素對粗肽液抗氧化活性的影響。

1.3.6.1 食鹽含量對于粗肽液抗氧化活性的影響

配制質量濃度1 mg/mL粗肽液,分別添加0.0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%、10.0% (質量分數) NaCl,在121 ℃、0.1 MPa條件下加熱15 min,冷卻至室溫,測定其DPPH自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率和羥自由基清除率。

1.3.6.2 溫度對于粗肽液抗氧化活性的影響

配制質量濃度1 mg/mL粗肽液,分別在25、40、60、80、100 ℃水浴2 h后,快速冷卻至室溫,測定其DPPH自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率和羥自由基清除率。

1.3.6.3 pH對于粗肽液抗氧化活性的影響

配制質量濃度1 mg/mL粗肽液,分別在pH為3.0、5.0、7.0、9.0、11.0室溫下放置1 h,然后將各溶液pH值調至7.0,測定其DPPH自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率和羥自由基清除率。

1.3.7 抑菌率測試

測定粗肽液對金黃色葡萄球菌、O157型大腸桿菌、白色念珠菌的抑菌活性,測定結果以抑菌率表示。首先對粗肽液進行超濾處理,截留分子質量3 kDa以下的肽液進行凍干。使用PBS配制粗肽液,質量濃度為5 mg/mL。將O157型大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌培養至對數期,并用無菌生理鹽水進行稀釋,調整濃度為106CFU/mL。按照體積比1∶4吸取細菌培養液500 mL與2 mL粗肽液(0.22 μm混合膜過濾)混合后加入實驗管中,對照組為無菌磷酸鹽緩沖溶液。然后進行培養,O157型大腸桿菌與金黃色葡萄球菌放于37 ℃恒溫振蕩器中振蕩培養18 h,白色念珠菌放于28 ℃恒溫振蕩器中振蕩培養48 h。取出拍照并記錄菌落數。抑菌率采用公示(5)計算:

(5)

式中:實驗組為加粗肽液組,對照組為未加粗肽液組。

1.3.8 抗氧化肽分離鑒定

取適量樣品用C18除鹽柱進行除鹽。根據抗氧化實驗結果測試,選擇干腌成熟的牛肉進行分離純化,選擇SephadexG-25和SephadexG-15分別進行2次分離純化。SephadexG-25分離純化條件:選擇26 mm×1 m層析柱,蒸餾水經45 nm過濾后作為洗脫液進行洗脫,調節流速0.5 mL/min,每管收集5 mL洗脫液,分別進行抗氧化性能測試,選擇抗氧化性能好的收集液進行SephadexG-15二次分離純化并進行抗氧化性能測試,條件同SephadexG-25。

nano-HPLC-MS/MS分析:將樣品經由配備在線納噴離子源的LC-MS/MS分析。整套系統為串聯EASY-nanoLC 1200的Q ExactiveTMPlus質譜儀(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)。共上樣5 μL樣品(分析柱:Acclaim PepMap C18, 75 μm×25 cm),以60 min的梯度分離樣品,柱流量控制在300 nL/min,柱溫為40 ℃,電噴霧電壓2 kV,梯度從2%的B相起始,在47 min以非線性梯度升高到35%,1 min內升高到100%,維持12 min。

質譜儀在數據依賴采集模式下運行,自動在MS和MS/MS 采集間切換。質譜參數設置如下:a) MS:掃描范圍(m/z):200～1 800;分辨率:70 000;AGC target:3e6;最大注入時間:50 ms;b)HCD-MS/MS:分辨率:17 500;AGCtarget:1e5;最大注入時間:45 ms;碰撞能量:28;動態排除時間:30 s。

1.4 數據分析與統計處理

實驗中用Origin 2018繪圖。使用Microsoft Excel 工作表來統計數據。

2 結果與分析

2.1 粗肽提取

由圖1可知,在0～2.0 mg/mL的質量濃度范圍內牛血清蛋白線性良好,線性標準方程為y=0.128 1x-0.000 2(R2=0.999 7);其中y為540 nm下的吸光度,x為牛血清蛋白的質量濃度(mg/mL)。

圖1 牛血清蛋白標準曲線Fig.1 Bovine serum protein standard curve

蛋白質在生物體內具有廣泛的功能特性,可以形成網絡和結構,并能與水、鹽等成分協同作用,對肉的質地、感官和營養品質等的形成起著重要作用。肉類發酵過程中會發生蛋白質水解,肌動蛋白、肌球蛋白和膠原蛋白是肉類中的主要結構蛋白[13],首先是內源肽酶水解(主要為組織蛋白酶和鈣激活蛋白酶)分解完整蛋白質生成小肽,外源肽釋放將小肽進一步降解單氨基酸、二肽或三肽[14]。根據標準曲線計算不同加工時長樣品中粗肽含量,如圖2所示,未加工時期粗肽含量約為1.46 mg/mL,腌制47 d后粗肽含量約為1.72 mg/mL,相比增加了17.8%。粗肽含量隨著腌制時長的延長而增加。

圖2 不同時期肽含量Fig.2 Peptide content in different periods

2.2 粗肽平均鏈長

甘氨酸標準曲線為y= 0.013 5x-0.015 4(R2=0.999 9),通過計算得出不同時期粗肽平均鏈長,見表1。

表1 不同時期粗肽平均鏈長以及肽鏈平均分子質量Table 1 Average chain length of crude peptides and average molecular weight of peptide chains in different periods

粗肽為不同鏈長的多肽組成的混合物,由表1可知,不同加工時期的粗肽的平均鏈長為15.21、16.26、16.36、16.52、17.05和21.33。肽鏈平均分子質量分別為1 926.84、2 059.49、2 072.94、2 093.27、2 160.22、2 702.00 kDa。

2.3 粗肽的氨基酸含量與形貌觀察

氨基酸的類型和組成的對于活性肽的抗氧化功能的影響的探究是必需的[15]。由于原料、酶以及制備條件的不同,抗氧化肽的氨基酸組成、序列以及結構也有所不同。迄今為止獲得的抗氧化肽的分子質量大多為500～3 000 U,具有抗氧化能力的氨基酸主要包括酸性氨基酸、疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸等[16]。LIU等[12]結果表明,含有酪氨酸的二肽具有較強的自由基清除能力。除疏水性氨基酸外,酸性氨基酸側鏈的氨基和羧基可與金屬離子螯合,鈍化氧化金屬離子,減少自由基鏈式反應的進行,從而發揮抗氧化作用。

3種不同處理方式的氨基酸成分見表2。3種粗肽液氨基酸含量分別為29.81、64.199、258.111 mg/mL,均高于牛肉的17.749 mg/mL。經過2 h胃蛋白酶消化后,氨基酸水解成小片段,而在胰蛋白酶作用下多肽被更徹底的水解。由表2可得出結論,疏水性氨基酸Val、Leu等在經過兩段酶解處理后氨基酸含量顯著增加,具有金屬離子螯合能力的Met、Glu、Lys與Arg等同樣顯著增加。

表2 三種不同處理方式的氨基酸成分 單位:mg/mL

活性肽的空間結構對其發揮抗氧化也有重要作用。CHEN等[17]研究指出肽的氨基酸序列和構象可能對肽的氧化有很大的影響。CHAN等[18]對于肌肽及其相關含組氨酸二肽淬滅自由基能力的電子自旋共振研究,也得出了類似的結論。圓二色譜的結果(圖3)顯示,粗肽在195、215 nm附近有吸收帶,在205 nm 附近有較弱吸收帶,進一步的統計分析證實,粗肽凍干粉的圓二色譜測試中,由24.10%的粗肽呈β-折疊,72.10%的粗肽呈反平行,12.80%的粗肽呈平行。

圖3 粗肽圓二色譜Fig.3 Crude peptide circular dichroism

2.4 抗氧化測試

抗氧化能力是發酵肉制品中生物活性肽最主要的功能特性,CASTELLANO等[19]發現經酸乳清腌制的發酵牛肉會釋放大量生物活性肽,其中最主要的就是抗氧化功能肽,例如EKAGAHLKG。

DPPH法的原理是通過向DPPH自由基提供氫原子來測量抗氧化劑淬滅自由基的能力。干腌火腿中的色氨酸和酪氨酸具有良好的供氫能力,可以為自由基提供氫原子,從而形成穩定的苯氧基、吲哚等中間產物,可以減緩或終止自由基鏈式反應[20]。如圖4-a所示,未處理前的粗肽1 mg/mL的DPPH自由基清除率約為68.03%,干腌結束后約為78.33%,同比增加了10.30%,但還是遠低于同濃度GSH的95.87%。超氧陰離子自由基清除率、羥自由基清除率和ABTS陽離子自由基清除率也同樣是測定抗氧化能力和還原能力的常用方法,通過測試發現,干腌結束后的超氧陰離子自由基清除率、羥自由基清除率和ABTS陽離子自由基清除率,分別為81.05%、26.89%和36.92%,相較于未腌制的增加了14.11%、9.89%和24.39%,依然低于同質量濃度的GSH。

2.5 粗肽抗氧化性能的穩定性研究

生物活性肽需要保持其特定結構的完整性才能發揮其生理功能,維持較高的生物活性。研究表明,生物活性肽在胃腸道中可被人體唾液、胃酸和蛋白酶消化后結構發生降解,導致其生物活性降低甚至喪失[15]。

2.5.1 NaCl對于粗肽液抗氧化活性的影響

由圖5可以看出,隨NaCl含量增加,DPPH自由基清除率先增加后減小。0%添加量時,DPPH自由基清除率約為75.74%;添加量增加到6%時,DPPH自由基清除率達到最高,約為81.91%;添加量增加10%時,DPPH自由基清除率又隨之降低,約為74.85%。羥自由基清除率呈現下降趨勢,0%添加量時,羥自由基清除率約為25.87%,隨著NaCl添加量的增加,羥自由基清除率開始下降,10%添加量時約為12.06%,清除率最低,同比下降了13.81%。超氧陰離子自由基清除率隨著NaCl添加量的增加呈先下降后增加趨勢。0%添加量時,超氧陰離子自由基清除率最高約為84.42%;2%添加量時,超氧陰離子自由基清除率最低約為54.24%;而后隨著NaCl添加量的增加,超氧陰離子自由基清除率開始上升,10%添加量時,超氧陰離子自由基清除率約為65.23%。

a-DPPH自由基清除率;b-超氧陰離子自由基清除率;c-羥自由基清除率;d-ABTS陽離子自由基清除率圖4 不同時期抗氧化能力Fig.4 Antioxidant capacity in different periods

圖5 NaCl添加量對粗肽液抗氧化活性的影響Fig.5 Effect of NaCl on the antioxidant activity of crude peptide solution

2.5.2 溫度對于粗肽液抗氧化活性的影響

由圖6可以看出,隨溫度增加,抗氧化能力開始改變,呈現先增加后減小的趨勢,25 ℃時,DPPH自由基清除率、羥自由基清除率和超氧陰離子自由基清除率約為63.55%、18.26%和72.87%;60 ℃時,清除率最高,約為73.94%、28.23%和79.86%;100 ℃時,自由基清除率最低,約為59.89%、12.58%和57.57%。

2.5.3 pH對于粗肽液抗氧化活性的影響

由圖7可以看出,隨pH增加,抗氧化能力開始改變,呈現先增加后減小的趨勢,pH 3.0時,DPPH自由基清除率、羥自由基清除率和超氧陰離子自由基清除率約為58.25%、9.28%和31.14%;pH 7.0時,清除率最高,約為70.30%、24.41%和61.36%;pH 11.0時,自由基清除率最低,約為61.89%、15.01%和52.84%。

圖6 溫度對粗肽液抗氧化活性的影響Fig.6 Effect of temperature on the antioxidant activity of crude peptide solution

圖7 pH對粗肽液抗氧化活性的影響Fig.7 Effect of pH on the antioxidant activity of crude peptide solution

2.6 抑菌率測試

抗菌肽是生物活性肽的另一個重要性能?？咕姆植紡V泛,在復雜多細胞生物的進化中發揮重要作用,也是非常重要的防御細菌、真菌和病毒的武器[21]。鄭錦曉等[6]分離比較了宣威火腿、金華火腿、如皋火腿粗多肽,結果表明,3種火腿均可抑制大腸桿菌的生長。CASTELLANO等[22]對西班牙火腿的抗菌肽進行提取、抑菌活性的測定以及純化鑒定,結果表明RHGYM的抑菌活性最強。

經測試,結果如圖8所示,5 mg/mL粗肽液可以有效抑制O517型大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌,經計算抑菌效果為75.45%、48.53%和44%。O517型大腸桿菌為革蘭氏陰性菌,結構簡單,一層肽聚糖構成細胞壁,粗肽通過復雜的機制抑制了靶細胞壁組分的合成或是對細胞壁結構造成破壞,從而降低了大腸桿菌的生長能力;金黃色葡萄球菌作為一種典型的革蘭氏陽性菌,相較于O517大腸桿菌的細胞壁來說,更厚且結構緊密,不易破壞,致使粗肽難以破壞細胞壁發揮抑制作用;白色念珠菌作為一種典型的條件致病性真菌,對熱的抵抗力不強,60 ℃加熱1 h即可殺死,但對化學制劑、紫外線的抵抗力較強。

a-O157型大腸桿菌;b-金黃色葡萄球菌;c-白色念珠菌圖8 粗肽液(5 mg/mL)抑菌率Fig.8 Bacterial inhibition rate of crude peptide solution (5 mg/mL)注:上為實驗組,下為對照組。

2.7 抗氧化肽分離鑒定

凝膠過濾色譜法是目前最廣泛的多肽分離方法,該方法分離條件溫和,回收率高,操作簡單,基于樣品分子質量大小達到分離效果。由表3可知,經由SephadexG-25分離后得到了6個組分,各組分性能差異較大,其中組分C抗氧化性能最好。質量濃度為1 mg/mL時抗氧化能力為69.33%、17.58%、65.52%。

表3 SephadexG-25分離組分抗氧化活性 單位:%

組分C再次經由SephadexG-15二次分離后得到5個組分,如圖9、圖10所示,各組分差異不大?；钚噪姆蛛x純化后,由質譜結合軟件分析及蛋白質數據庫分析氨基酸序列,得到的氨基酸序列分別為:DALKKK、FDGDF、HLPSDF、FLSDH、TPTDWK。

圖9 SephadexG-15二次分離抗氧化測試Fig.9 Antioxidant test of SephadexG-15 secondary separation

圖10 DALKKK、FDGDF、HLPSDF、FLSDH、TPTDWK質譜Fig.10 Mass spectra of DALKKK, FDGDF, HLPSDF, FLSDH and TPTDWK

3 結論

本實驗通過測定不同時期干腌牛肉的抗氧化與抑菌指標,通過鹽酸提取法,發現粗肽含量隨著腌制時間的延長而顯著增加,干腌牛肉抗氧化性能隨著腌制時間的延長而增加,對不同自由基的清除效果也呈現較大差異,清除效果最好的為超氧陰離子自由基,1 mg/mL時可以達到81.05%,DPPH自由基清除率、羥自由基清除率和ABTS陽離子自由基最終清除率為78.33%、26.89%和36.92%。通過穩定性測試,發現0% NaCl、60 ℃和pH 7.0時抗氧化能力最強。驗證了粗肽液在5 mg/mL時對于O517型大腸桿菌、白色念珠菌和金黃色葡萄球菌的抑菌能力,分別可以達到75.45%、44%和48.53%。經過SephadexG-25和SephadexG-15分別進行2次分離純化后發現5個肽具有良好的抗氧化活性,分別為DALKKK、FDGDF、HLPSDF、FLSDH、TPTDWK。本研究結果表明,傳統的中國干腌肉制品對人體健康是有益的。作為食源性生物活性肽重要的來源之一的傳統干腌肉制品,可作為功能性食品的一個新的探究方向,具有很大的研究空間和研究價值。