灰葡萄孢霉菌產脫落酸發酵工藝優化

張俊,左建英,景飛江,陳鋼

1(南昌大學,食品科學與技術國家重點實驗室,江西 南昌,330047) 2(四川龍蟒福生科技有限責任公司,四川 眉山,620020)

脫落酸(S-abscisic acid,S-ABA),一種重要的植物生長調節劑,其與生長素、赤霉素、細胞分裂素、乙烯共同組成五大植物內源生長調節劑[1-2],其主要功能為提高植物抗病性、抗寒性、抗旱性,加速營養物質積累,提高作物逆境下的抵御和修復能力,顯著改善植物品質、提高苗木成活率、增加水稻分蘗和提高水稻抗性、?；ū９鸞1]、還具有促進種子和果實貯存蛋白與糖分的積累,提高農作物與水果的品質以及控制花芽分化,調節花期的應用[3],現主要生產方式為發酵生產,產生菌為Botrytiscinerea[4]。

液態發酵過程中,Botrytiscinerea菌體形態會因多種外部工藝條件以及營養條件變化,出現絮狀聚集體、菌絲團塊、菌絲球等表現(圖1),而這些表現直接影響了發酵液物質、氧傳質以及黏度、流動情況等特性[5-6]。目前關于S-ABA發酵生產相關的文獻主要針對于高產菌株篩選[7-8]、培養基優化[9]、發酵條件優化[10-11]方面,而關于菌體形態與S-ABA產量研究較少。以往的針對其他絲狀真菌液態發酵研究中,通過考察基因表達[12-13]、調節攪拌轉速[14]、調整碳氮比[15]、增加微顆粒[16]來進行菌體形態控制,對次級代謝產物的生產具有重要意義[17-18]。本研究結合真菌形態工程理論,采用響應面分析方法優化發酵工藝及相關參數,控制發酵過程中的菌體形態,從而達到提高S-ABA產量,為Botrytiscinerea菌體工業化發酵產S-ABA提供依據。

a-絮狀聚集體;b-菌絲團塊;c-菌絲球圖1 Botrytis cinerea液態發酵菌體的形態Fig.1 Morphology of Botrytis cinerea liquid fermentation cell

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

本文實驗中所使用的Botrytiscinerea菌株由龍蟒福生科技有限公司保存,由中科院成都生物研究所譚紅教授誘變篩選的高產Botrytiscinerea菌株。

1.1.2 試劑

大豆蛋白粉、SD-300分散型,臨沂山松生物制品有限公司;葡萄糖、玉米蛋白粉、玉米淀粉、食品級玉米油,山東西王糖業有限公司;甘油(食品級),中孚油脂(廣州)集團有限公司;瓊脂粉(分析純),天津致遠化學試劑有限公司、泡敵、GPE-2000,江蘇海安石油化工廠;ZnSO4、MnSO4、FeSO4、(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4,均分析純試劑,西隴科學股份有限公司。

1.1.3 培養基

種子培養基:PDA培養基取馬鈴薯200 g,去皮切成小塊,用蒸餾水煮沸20 min,8層紗布過濾,加入20 g葡萄糖,定容至1 L。滅菌參數為121 ℃,20 min。

發酵培養基(g/L):玉米淀粉15、玉米油1、甘油5.5、玉米蛋白粉2、K2HPO40.6、MnSO40.01、FeSO40.01、ZnSO40.01 g/L。

1.2 儀器與設備

ME204分析天平,瑞士梅特勒托利多;SW-CJ-2F超凈工作臺,中國蘇州凈化;G80F23CN3P-BM1(G0)微波爐,中國格蘭仕電器;TG16-WS離心機,中國湘儀;DGG-9240AD鼓風干燥箱,中國上海齊欣;BSD-YX3600恒溫搖床,中國上海博迅;LX-B50L高壓蒸汽滅菌鍋,中國合肥華泰醫療設備有限公司;CX23顯微鏡,日本奧林巴斯;LC20高效液相色譜系統,日本島津;15L-50L×2小試發酵系統,中國上海國強。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養方法

種子活化:取保存于-64 ℃的菌種接種于PDA平板,28 ℃恒溫培養48 h。將保存的菌種接種到茄瓶培養基中,28 ℃培養24～48 h,觀察菌落形態。用接種環挑取一環茄瓶中的菌種,接種到50 mL/250 mL種子培養基中,28 ℃、200 r/min恒溫培養18 h。

發酵培養(搖瓶):使用滅菌后的移液器吸取2 mL接種發酵培養搖瓶(帶擋板),培養基100 mL/500 mL,28 ℃、200 r/min恒溫培養20 d。

發酵培養(發酵罐):以0.1%的接種量(10 mL搖瓶種子液)接種到發酵罐種子培養液,發酵培養基的裝液量為 50 L發酵罐裝入 16 L 培養基,轉速200～600 r/min,通氣量 1～3 vvm,27 ℃下培養 18 d。

1.3.2 分析方法

菌體生長量測定方法:干重法測定菌體生長量,量取10 mL發酵液入15 mL離心管,稱取10 mL發酵液重量,離心條件,使用水平轉子,10 000 r/min,離心10 min。離心完成后傾倒上清液,蒸餾水沖洗菌體,再進行離心,沖洗程序重復2次。將離心管放入60 ℃鼓風干燥箱,烘干48 h,稱重得到菌體干重。

菌體形態測定法:菌體形態采用拍照結合顯微鏡標尺測量菌體形態,唐文俊等[19]在建立黑曲霉發酵過程中菌體形態的分析方法時,使用顯微測微尺預先確定拍攝照片的像素點與實際長度比例,再使用軟件進行統計分析。鑒于公司現有條件,調整形態分析方法如下:對發酵液進行攪拌混合,吸取3 mL滴入盛有20 mL生理鹽水的培養皿,分散菌體,吸取分散的菌體滴加在顯微鏡標尺合適的量程內,進行顯微觀察,拍照并記錄菌絲形態、尺寸數據。每一批發酵液重復10個處理,對數據進行平均得到發酵液體平均尺寸。

S-ABA含量檢測制樣方法:取適量發酵液,5 000 r/min離心5 min,吸取上清液,超純水稀釋10倍,通過0.22 μm水系膜直接進樣檢測。

S-ABA含量檢測液相條件:S-ABA為胞內產生釋放至發酵液,參考姚晨濤等[20]對高效液相色譜法測定S-ABA及對其設計濃度驗證實驗中的方法,采用HPLC系統,包含脫氣機(DGU-20A3R),二元泵(LC-20AT),自動進樣器(SIL-20A),柱溫箱(CTO-10AS vp),UV/VIS檢測器(SPD-20A),使用Eclipse XDB-C18 色譜柱(150 mm×4.6 mm,3.5 μm),進樣量:10 μL,以V(甲醇)∶V(水)=1∶1(用磷酸調pH值至3)為流動相,在254 nm處對試樣中的S-ABA進行高效液相色譜分離和測定。柱溫30 ℃,流動相流速1.5 mL/min。

Plackett-Burman試驗設計:在單因素實驗基礎上,以S-ABA產量為主要響應值,菌絲球直徑為次要響應值,對攪拌強度、初始pH、CaCO3添加量、接種量、通氣量以及碳氮比6個影響因素進行評價,設計Plackett-Burman試驗,篩選出主效應因素,每個因素取最低(-1)和最高(1)兩個水平,共12組實驗,試驗因素和水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設計的因素水平表Table 1 Factor level table for Plackett-Burman experimental design

實驗中將6個因素進行全面考察,實驗次數n=12的實驗設計,A、B、C、D、E、F分別代表碳氮比、初始pH、CaCO3添加量、接種量、通氣量以及攪拌強度6個影響因素,每個因素取最低最高兩個水平。

響應面分析:以Plackett-Burman試驗結果為基礎,進行Box-Behnken設計,對實驗結果進行回歸分析、誤差分析并求得最優值,響應面分析結果,繪制響應面分析圖,根據結果確定最佳發酵條件。用響應面分析所得的最佳發酵工藝條件進行3個批次平行實驗,結果取平均值,驗證所得的數學模型可靠性,得到最優發酵工藝結果。

1.4 數據處理與分析

采用Excel 2021、Design Expert 11處理數據和統計分析,GraphPad Prism 8軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同碳氮比對Botrytis cinerea菌體形態和產酸的影響

由表2可知,S-ABA產量隨著碳氮比變化而變化,最高產量出現在碳氮比為25,達到1 218 mg/L,較CK(均值964.33 mg/L)提高26.3%,后隨著碳氮比增高而降低,說明在適合的碳氮比條件下,可以有效提高BotrytiscinereaS-ABA產量,但過高的碳氮比會抑制S-ABA的合成,主要原因可能為底物抑制導致。同時,菌絲在液態發酵條件下菌體交聯成團,緊密纏繞形成核區,更高的碳氮比會使核區增大,較大的核區會影響營養物質及溶解氧對核區內部菌絲體的供應,影響菌絲代謝,最終造成S-ABA產量差異,因此綜合以上各參數,選擇碳氮比25為最佳的Botrytiscinerea發酵培養基碳氮比條件。

表2 不同碳氮比對Botrytis cinerea形態和發酵結果的影響Table 2 Effects of different C/N ratios on morphology and fermentation results of Botrytis cinerea

2.2 不同pH對Botrytis cinerea菌體形態和產酸的影響

由表3可知,隨著pH的逐漸升高,S-ABA產量、發酵最終pH、雜質含量及發酵液干重均有不同的表現,發酵液中最終pH隨初始pH增大而增大,說明初始pH會影響整體發酵過程的酸堿平衡,因為碳源代謝會產生有機酸,使整體發酵體系偏酸性。發酵液干重方面,pH 4平均值5.33 g/10 mL,pH 7為5.36 g/10 mL,說明初始pH的變化對發酵液干重無明顯影響,即發酵液初始pH對生長量影響較小;S-ABA產量方面,最高產量出現在pH 5.5,達到1 060.33 mg/L,較CK(均值989.67 mg/L)提高7.14%,后隨著pH增高而先升高后降低,最低值為pH 7,均值為789.33 mg/L,說明在適合的pH條件下,可以有效提高Botrytiscinerea合成S-ABA產量,但過高或者過低的pH會產生抑制,主要原因可能為S-ABA的相關合成酶在pH值為5.5左右時有較好活性。菌絲體隨pH的增長,尺寸先增大后減小,菌絲均較為緊密且表面光滑。說明在合適的pH條件下能形成適當松散的結構,有助于發酵液與菌絲球內部菌絲的物質、空氣交換,利于產量的提高。因此綜合以上各參數,選擇pH值為5.5最佳的Botrytiscinerea發酵培養基pH條件。

表3 不同pH對Botrytis cinerea形態和發酵結果的影響Table 3 Effects of different pH on the morphology and fermentation results of Botrytis cinerea

2.3 不同CaCO3濃度對Botrytis cinerea菌體形態和產酸的影響

如表4所示,發酵液pH隨著CaCO3濃度的增加而增加(CaCO3添加量為50、60、70、80、90、100 g/L,分別以CaCO31～CaCO35代表),原因是CaCO3對發酵產生的有機酸有中和作用,影響發酵液pH變化;發酵液干重方面, CaCO31平均值5.31 g/10 mL,CaCO35為5.98 g/10 mL,干重隨CaCO3增加而增加,原因是CaCO3不參與Botrytiscinerea發酵過程的生理活動;S-ABA產量方面,最高產量出現在CK組,達到978.33 mg/L,后隨著CaCO3增加逐漸降低,最低值為CaCO35,均值為185.33 mg/L,說明在添加CaCO3條件下,對Botrytiscinerea產S-ABA有不利的影響,結合最佳pH搖瓶結果,最佳pH條件為5.5,而添加CaCO3條件下會影響發酵液pH變化,不利于S-ABA的合成。同時,隨著CaCO3含量的增加,菌絲球趨向于形成更小更不規則的梭形,菌絲球緊實,邊緣粗糙,部分黏著CaCO3顆粒。分析認為,微顆粒雖然不參與菌體生長,但會增加菌體在發酵培養基中碰撞的概率,菌絲以CaCO3顆粒為核心形成菌絲球,密度大結構緊實,邊緣菌絲易與其他菌絲球互相纏繞、包裹形成多個核心,宏觀表現為不規則或梭形,不利于S-ABA合成。因此綜合以上各參數,選擇不在培養基中增加CaCO3。

表4 CaCO3濃度對Botrytis cinerea形態和發酵結果的影響Table 4 Effects of CaCO3 concentration on the morphology and fermentation results of Botrytis cinerea

2.4 接種量對Botrytis cinerea菌體形態和產酸的影響

在搖瓶實驗基礎上,總結適用于S-ABA發酵的碳氮比、固態載體添加量及最適pH,在50 L小試罐水平對接種量、通氣比、攪拌轉速條件。

根據統計,發酵12 d之前S-ABA積累量與接種量大小正相關,如圖2所示,原因為接種量多,菌體數量大,S-ABA積累量相對更高;12 d之后,接種量10%罐與12.5%接種量罐S-ABA積累量相當,至發酵結束均保持較高的日增量,發酵結束時達到最大值6 938 mg/L。菌體形態方面,除10%接種量外,其他的接種量條件菌絲球尺寸波動較大, 10%接種量菌絲球保持1～1.2 mm,變化較小。因此綜合以上表現,選擇發酵最佳接種量為10%。

a-接種量對菌絲球尺寸的影響;b-接種量對發酵結果的影響圖2 接種量對Botrytis cinerea形態和發酵結果的影響Fig.2 Effects of inoculation amount on the morphology and fermentation results of Botrytis cinerea

2.5 通氣量對Botrytis cinerea菌體形態和產酸的影響

根據通氣量實驗,S-ABA的積累伴隨著通氣量的增長而增長,如圖3所示。最低為0.5 vvm:4 479 mg/L,最高為3 vvm:7 013 mg/L。核算發酵液蒸騰損失,最高S-ABA產量為1 vvm:6 719.68 mg/L;伴隨著通氣比增加,菌體趨向于形成顆粒更小的菌絲球,結構致密,表面光滑,最小為通氣量3 vvm,直徑0.4 mm;而1 vvm發酵液菌絲球尺寸維持0.9～1.2 mm,結構相對疏松,有助于物質與氧氣對菌絲球內部的擴散。

在此實驗基礎上,可以確定最佳通氣比為1 vvm。

a-通氣量對菌絲球尺寸的影響;b-通氣量對發酵結果的影響圖3 通氣量對Botrytis cinerea形態和發酵結果的影響Fig.3 Effects of ventilation capacity on the morphology and fermentation results of Botrytis cinerea

2.6 攪拌對Botrytis cinerea菌體形態和產酸的影響

在轉速實驗中,S-ABA的產量隨著轉速增高而先升高后降低,如圖4所示,最高出現在500 r/min,達到6 853 mg/L,較最低轉速200 r/min提高56.96%。最低值為200 r/min,均值為4 366 mg/L, 700 r/min條件下產量低于500 r/min,說明合適的攪拌條件對S-ABA合成是有利,但過高或者過低的攪拌會抑制S-ABA的合成;在菌絲球尺寸方面,350 r/min轉速條件下菌絲球尺寸最大,為2.0 mm左右,最低為700、0.5、500 r/min轉速條件下菌絲球尺寸維持在0.8～1 mm,尺寸適中、體積穩定,菌絲形成與破壞達到一定的平衡,合成S-ABA在營養條件、通氣條件以及結構、菌絲球表面條件均處于較為穩定的狀態。綜合以上表現,500 r/min為最適合的攪拌轉速條件。

a-轉速對菌絲球尺寸的影響;b-轉速對發酵產量的影響圖4 攪拌強度對Botrytis cinerea形態和發酵結果的影響Fig.4 Effects of agitation intensity on the morphology and fermentation results of Botrytis cinerea

2.7 S-ABA發酵工藝響應面優化

在單因素實驗基礎上,以攪拌強度(A)、初始pH(B);CaCO3添加量(C)、接種量(D)、通氣量(E)以及碳氮比(F)為自變量,以S-ABA產量為主要響應值,菌絲球直徑為次要響應值,對6個影響因素進行評價,進行Plackett-Burman試驗。根據實驗結果,選取對S-ABA產量、菌絲球直徑顯著性影響的因素為攪拌轉速、接種量和初始pH,進行3因素3水平的Box-Behnken 中心組合原理進行的響應面實驗,實驗設計方案與結果見表5、表6。

2.8 響應面試驗回歸方程的建立及方差分析

利用Design-Expert11軟件對試驗設計的結果進行多項式回歸擬合分析,得到S-ABA產量回歸方程:R=7 028.37-332.64A-774.03B-255.84C-350.51AB-1 178.82AC-815.74BC-1 691.35A2-1 535.5B2-2 510.53C2,根據表7中有關于回歸模型的方差分析,可以發現此數學模型的P<0.000 1,表示該模型的回歸性極顯著,失擬項P=>0.1,不顯著,說明該模型的擬合性好,相關系數R2=0.983 9,該模型可靠性高,可用于Botrytis cinerea產S-ABA的優化,根據F值可知,各個因素對S-ABA產量的影響大小順序是:接種量>攪拌轉速>初始pH。

表5 Box-Behnken實驗設計的因素水平表和編碼Table 5 Factor level table and coding for Box-Behnken experimental design

表6 響應面試驗設計與結果Table 6 Response surface experimental design and results

表7 S-ABA的回歸模型的方差分析Table 7 Analysis of variance in the regression model of S-ABA

對另一響應值菌絲球尺寸,根據試驗設計的結果進行多項式回歸擬合分析,得到菌絲球直徑的回歸方程:R=0.863 2-0.398A+0.120 2B-0.029 5C+0.143 4AB+0.110 8AC+0.021 1BC-0.107 8A2+0.198 3B2+0.148 6C2,根據表8關于回歸模型的方差分析表現,可以發現此數學模型類似于S-ABA產量回歸模型,在影響因子顯著性上與S-ABA積累量不同,為攪拌轉速>接種量>初始pH,此數學模型的P<0.000 1,表示該模型的回歸性極顯著,失擬項P=>0.1,不顯著,說明該模型的擬合性好,相關系數R2=0.983,該模型可靠性高,可用于Botrytiscinerea菌體形態的優化。

響應面的等高線、坡度以及坐標軸的交點在響應面實驗中反映了試驗的各個因子對結果響應值的影響的大小,由圖5可知,攪拌強度、初始pH以及接種量交互作用顯著,影響S-ABA產量最顯著的因素是接種量的大小,表現為響應面弧度變化最大,其次是攪拌強度,且攪拌強度與初始pH交互作用、接種量與初始pH交互作用影響也極顯著。同時,影響菌絲球形態的因素交互作用表現如圖6所示。

表8 菌絲球直徑的回歸模型的方差分析Table 8 Analysis of variance for regression models of filamentous sphere diameter

a-攪拌轉速與接種量交互作用對S-ABA產量的影響;b-攪拌轉速與初始pH交互作用對S-ABA產量的影響; c-接種量與初始pH交互作用對S-ABA產量的影響圖5 各因素的交互作用對S-ABA產量的影響Fig.5 The impact of the interaction of various factors on the yield of S-ABA

a-攪拌轉速與接種量交互作用對菌絲球直徑的影響;b-攪拌轉速與初始pH交互作用對菌絲球直徑的影響; c-接種量與初始pH交互作用對菌絲球直徑的影響圖6 各因素的交互作用對菌絲球直徑的影響Fig.6 The influence of the interaction of various factors on the diameter of filamentous spheres

2.9 響應面驗證試驗

利用已經建立的數學模型預測S-ABA的最佳工藝條件為攪拌強度535.819 r/min;初始pH=5.127 11;接種量10.777 9%,考慮到實際的操作,修正以上工藝參數如下,攪拌強度535 r/min;初始pH 5.1;接種量11%。

在此條件下3次重復實驗結果為:S-ABA產量平均值7 189.52 mg/L,菌絲球直徑0.95 mm,與理論預測值產量7 105.3 mg/L、菌絲球尺寸0.913 875 mm,偏差較小,說明該模型能夠較好地預測S-ABA的發酵結果,同時相對于單因素實驗最高產量6 938 mg/L提升3.63%,與原工藝相比(平均產量6 597.82 mg/L),提升了約8.23%,與福生公司生產平均產量6 400～6 600 mg/L相比,提升11.5%。

3 結論

通過單因素實驗、Plackett-Burman試驗,分別以S-ABA積累量、菌絲球直徑作為響應值,在6種變量中確定了攪拌強度、接種量、初始pH為最主要的影響因素,后續通過3因素3水平的Box-Behnken實驗進行響應面分析,明確了對S-ABA產量的影響大小順序是:接種量>攪拌轉速>初始pH,而在對菌絲球形態影響因子顯著性攪拌轉速>接種量>初始pH,各因素交互性上,針對S-ABA的產量,攪拌強度與初始pH交互作用、接種量與初始pH交互作用影響極顯著,同時針對菌絲球尺寸變化,攪拌強度與接種量的符合作用影響極顯著。

通過響應面實驗得到最佳工藝參數:攪拌強度535 r/min;初始pH 5.1;接種量:11%。在此條件下3次重復實驗結果為:S-ABA產量平均值7 189.52 mg/L,菌絲球直徑0.95 mm,與理論預測值產量7 105.3 mg/L、菌絲球尺寸0.913 875 mm,偏差較小,說明該模型能夠較好地預測S-ABA的發酵結果,且平均實驗產量與原工藝相比(平均產量6 597.82 mg/L),提升了約8.23%,與福生公司生產平均產量6 400～6 600 mg/L相比,提升11.5%,工藝優化效果明顯。